Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen

Zusammenfassung

Die Bodenplatte ist eine wichtige Struktur der Entwicklung des Rückenmarks und bietet diffusionsfähige Signale an Vorläuferzellen und Neuronen differenzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Bodenplatte konditionierten Medium zu produzieren, um es an die frische Rückenmarksgewebe anzuwenden und die Auswirkungen auf die Proteine ​​von Interesse durch Biochemie beurteilen.

Zusammenfassung

Während der Entwicklung Vorfahren und post-mitotischen Neuronen empfangen Signale von benachbarten Gebieten, die ihr Schicksal zu regulieren. Die Bodenplatte ist eine Gruppe von Gliazellen entlang der Ependymzellen Kanal in Bauchlage. Die Bodenplatte drückt Taste Morphogenen Beitrag zur Strukturierung der Zelllinien in das Rückenmark. In späteren Entwicklungsstadien, die Bodenplatte regelt die Navigation der Axone im Rückenmark, als ein Hindernis für die Überquerung des ipsilateralen Axone und Controlling Mittellinie Kreuzung von kommissuralen Axone ¹ zu verhindern handeln. Diese Funktionen werden durch die Sekretion verschiedener Führungssignale erreicht. Einige dieser Hinweise dienen als Lockmittel und Repellentien für die wachsenden Axone während andere regeln Führung Rezeptoren und nachgeschalteten Signal, um die Empfindlichkeit der Axone zu den lokalen Führungssignale ^2,3 modulieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Untersuchung der Eigenschaften von Boden-Platte abgeleiteten Signale in einer Vielzahl von Ent erlaubtlopmental Zusammenhänge, bezogen auf die Produktion von Boden-Platte konditionierten Medium (FP ^{cm) 4-6.} Wir veranschaulichen dann die Verwendung dieses FP ^cm im Rahmen der Axon Führung. Zunächst wird das Rückenmark von Mausembryo bei E12.5 isoliert und der Boden-Platte herauspräpariert und in einem Plasma-Thrombin-Matrix (Abbildung 1) kultiviert. Zweite zwei Tage später, sind kommissuralen Gewebe aus E12.5 Embryonen seziert, zerrieben und mit der FP ^cm ausgesetzt. Drittens werden die Gewebe für die Western-Blot-Analyse der Kommissuren Marker verarbeitet.

Einleitung

Die Bodenplatte ist eine bekannte Muster Zentrum der Entwicklung von Rückenmark, spielen Schlüsselrollen in der Spezifikation von Vorläufern und postmitotische Zelllinien und Steuerung Axon Navigation ^7,8. Die hier beschriebene FP ^cm erzeugen experimentelle Verfahren ermöglicht Forschern, die funktionellen Eigenschaften der Bodenplatte abgeleiteten Signale in einem verschiedenen Kontexten von Entwicklungsprozessen von Zelle Strukturierung und das Überleben zu Zelle und Axon Migration zu beurteilen.

Um die Verwendung solcher FP ^cm erläutern, werden dorsalen Rückenmarksgewebe enthält kommissuralen Neuronen seziert, dilacerated und mit der FP ^cm stimuliert. Die Gewebe können dann zur Western-Blot-Analyse verarbeitet. Dies ermöglicht die Untersuchung Bestimmungen des Axon Führung Maschinen durch Bodenplatte freigegeben Signale. Das Verfahren zur Behandlung von dilacerated frischem Gewebe hält den großen Vorteil der Erhaltung der Mikroumgebung der Zellen innerhalb the Gewebe. Somit werden die Auswirkungen der Behandlung von FP ^cm oder jede Behandlungsarten werden in einer physiologischen Weise als in Zell-und Gewebekulturbedingungen geprüft.

Protokoll

TAG 1

1. Dissektion der Spinal Cord Bodenplatte (FP) aus E12.5 Maus Embryonen

Hinweis: Das gesamte Verfahren erfordert die Verwendung von sterilen Bedingungen. Es ist bevorzugt, die Dissektion unter einer Haube Dissektion durchführen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Oberfläche der Abzugshaube mit Ethanol gereinigt werden. Alle Dissektionsinstrumente sterilisiert und aufbewahrt werden in einer sterilen Petrischale. Die Flüssigkeiten (medium, mittel Dissektion) geschlossen gehalten und in einem Eisbad gestellt werden. Jeder Embryo in einzelnen Tropfen frisch gesammelt werden. Dies ist wichtig für die Gewebeerhaltung. Die Präparation wird mit Dumont Nr. 5 Zange durchgeführt. Um die Embryonen zwischen Gerichten, Griff die Nabelschnur oder der Kopf, ohne Schäden an der Hinterhirn übertragen. Es ist wichtig, nicht zu beschädigen das Rückenmark, die Dissektion erfolgreich abgeschlossen. Vorbereitung kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS), Kälte Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -6,5% Glucose und Raumtemperatur Neurobasalmedium.

1.1 Rückenmark Dissektion

Tiere sind nach den Richtlinien der Tierpflege des Centre National de la Recherche Scientifique folgenden europäischen Richtlinien behandelt. Das Verfahren nach Euthanasie zervikale Dislokation, es besteht aus Aufbringen von Druck auf den Hals und Dislokation der Wirbelsäule aus dem Gehirn. Dieses Verfahren ist für Maus Tiermodell empfohlen und kann in einer schnellen und effizienten Weise durchgeführt werden.

1. Euthanize eine schwangere Maus auf E12.5 der Schwangerschaft (E0.5 = Tag nach Matten). Platzieren Sie die Maus Bauchseite auf.
2. Weichen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Klemmen Sie die Haut des Bauches mit Adson Pinzette und Messer durch die Haut und die Bauchfellschichten mit chirurgischer Schere. Einen Einschnitt machen und es verwenden, um sowohl auf Seite der Maus geschnitten, um die Bauchhöhle aus.
3. Eine Reihe von Embryonen ist auf jeder Seite der Maus vorhanden ist. Fassen Sie ein Horn des uterus im Gewebe zwischen zwei Embryonen und sezieren sie ausgehend von den äußeren Teil. Übertragen Sie die intakte Gebärmutter auf eine 100 mm Petrischale mit kaltem PBS auf Eis.
4. Extrahieren Sie die Embryonen aus extra-embryonalen Geweben. Fassen Sie die Plazentagewebe (in dunkelrot) mit zwei Pinzetten und ziehen leise, um das Gewebe reißen, und entfernen Sie die Embryonen von der Gebärmuttersack.

Hinweis: Für eine bessere Erhaltung, sammeln die Embryonen aus ihrer Gebärmutter-sac eine nach der anderen.

5. Die nächsten Schritte werden unter binokularen Lupe und Dissektion Haube getan. Legen Sie ein Embryo in einem Tropfen kaltem HBSS-6,5% Glucose.
6. Mit einer Pinzette, den Embryo zu enthaupten.

Hinweis: zwischen Unterkiefer und Hinterhirn Schneiden, ist der hintere Teil des Hinterhirn wichtig für die nächsten Schritte.

7. Setzen Sie den Embryo ventralen Seite nach unten mit dem vorderen Teil mit Blick auf den Experimentator.
8. Klemmen Sie die Hautdes Embryos mit einer Zange und mit dem anderen Paar ziehen weg die Haut.

Anmerkung: Dieser Schritt ist zu wiederholen, bis die Haut vollständig von dem vorderen Teil des Embryos entfernt.

9. Drehen des Embryos vorderen Seite zu der linken Seite. Mit einer Pinzette "festzunageln", den Embryo in den vorderen Teil. Mit der anderen Pinzette greifen die Haut und ziehen in Richtung der rostralen Seite des Embryos. Das Rückenmark ist dann zugänglich.
10. Verwenden Sie eine Seite der Zange, um die Hirnhäute, die noch wickeln Sie das Rückenmark zu schneiden. Das Rückenmark ist jetzt geöffnet.
11. Drehen des Embryos Vorderseite nach rechts.
12. Lösen das Gewebe aus dem Rückenmark ausgehend von der zervikalen Seite des Embryos. Schieben der Zange unter dem Rückenmark (die Zange geschlossen gehalten werden sollte, um Schädigung des Rückenmarks zu verhindern). Die Zange haben unter dem Rückenmark zu sehen sein. Kleine Drehbewegungen unter dem Rückenmark sind ausreichend, um das zu lösenumliegende Gewebe und die dorsale Wurzelganglien (DRG).

Hinweis: Leaving angebracht umliegende Gewebe Gewicht auf das Rückenmark, wodurch die Wahrscheinlichkeit, im nächsten Schritt bricht es zu.

13. Legen Sie die isolierten Rückenmark in einem frischen Tropfen kaltem HBSS-6,5% Glucose.
14. Legen Sie das Rückenmark in einer flachen Position, Hirnhaut auf der Oberseite und vordere Seite vom Experimentator.
15. "Festzunageln", die das Rückenmark mit dem restlichen Hinterhirn mit einer Zange und mit den zweiten Pinzette greifen die Hirnhäute. Ziehen Sie die Hirnhaut ab dem rostralen Seite des Rückenmarks.

Hinweis: Die Bewegung sollte langsam und konstant jede Brechen der Wirbelsäule zu vermeiden. Schwingbewegungen kann die Ablösung der Meningen erleichtern.

1.2 FP-Dissektion

1. Drücken Sie den Hinterhirn mit einer Pinzette.
2. Die FP ist die zentrale transparent Teil des Gewebes. Mit einem Skalpell schneiden Sie die Bodenplatte.

Hinweis: Um beide Seiten mit der gleichen Qualität zu schneiden, gehen von der rostralen Seite und abwechselnd schneiden die rechte Seite und die linke Seite der Bodenplatte.

3. Schützen Sie die FP seziert in Neurobasalmedium bei Raumtemperatur.

2. FP Kultur

Hinweis: Alle Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden. Verwenden Sie frisches Medium und frisch aufgetaut Ergänzungsmittel und Reagenzien. Bereiten sterilen Glasdeckgläser, warm Neurobasalmedium + B27, Plasma und HBSS-Thrombin.

2.1 FP Kultur

1. Legen Sie mehrere sterile Deckgläschen in einer 100 mm Petrischale und Pipette 20 ul Plasma in der Mitte jedes Deckglas.
2. Bringen Sie zwei vor vier FP in jeder Plasmaverlust und mit 20 ul HBSS-Thrombin neben dem Plasmaabfall und vorsichtig mischen. Halten Sie die Deckgläserfür mindestens zehn Minuten bei Raumtemperatur zur Gerinnung des Plasmas zu ermöglichen.

Hinweis: Transfer beiden FPs bei vollständiger Dissektion und mehr bei Teilzerlegung. Mischen Sie langsam mit einer Pipettenspitze und Kontakt mit den FP-Explantate zu vermeiden.

Die Plasmagerinnsel fährt wenigen um als ein Zeichen der Koagulation. Die Koagulation nicht vorzeitig abgebrochen werden, um ein Ablösen der Plasmagerinnsel zu vermeiden.

3. Übertragen Sie jede Deckglas in einer 24-Well-Platte und fügen Sie 500 ul Neurobasal + B27. Inkubiere 48 Stunden bei 37 ° C.

TAG 3

3. FP-konditioniertem Medium (FP ^cm) Ernten

Hinweis: Die Ernte sollte unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube durchgeführt werden. Wenn der Überstand wird während der Kultur peri verunreinigt oder Bodenplatten sind schwimmende (das heißt, sie hätte sterben könnenod), dann haben die FP ^cm nicht ernten von diesem auch.

FP 3.1 ^cm Ernte

1. Ernten Sie sorgfältig das Medium aus jedem Well.

Hinweis: die polymerisierte Plasma-Thrombin-Mix oder keine FP-Fragmente pipettieren.

2. Speichern 100 ul Aliquots bei -80 ° C.

TAG 4

4. Dissektion der Spinal Cord Commissural Neuronen aus E12.5 Maus Embryonen

Hinweis: Die Zubereitung muss nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Folgen Sie der oben beschriebenen, um die Embryonen zu sammeln Verfahren. Bereiten kaltem PBS, kaltem HBSS-6.5% Glucose und kalt Neurobasalmedium.

4.1 Rückenmark Dissektion

1. Mit einer Pinzette, den Embryo zu enthaupten.

Hinweis: zwischen Unterkiefer und Hinterhirn Schneiden, ist der hintere Teil des Hinterhirn wichtig für dienächsten Schritte.

2. Setzen Sie den Embryo ventralen Seite nach unten in einem frischen Tropfen mit dem vorderen Teil mit Blick auf den Experimentator.
3. Klemmen Sie die Haut der Embryo mit einer Pinzette und mit der anderen ziehen weg die Haut.

Anmerkung: Dieser Schritt ist zu wiederholen, bis die Haut vollständig von dem vorderen Teil des Embryos entfernt.

4. Drehen des Embryos vorderen Seite zu der linken Seite. Mit einer Pinzette "festzunageln", den Embryo in den vorderen Teil. Bei den anderen Zangen, greifen die Haut und ziehen in Richtung der rostralen Seite des Embryos, um das Rückenmark aus.
5. Verwenden Sie eine Seite der Zange, um die Hirnhäute, die noch wickeln Sie das Rückenmark zu schneiden. Das Rückenmark liegt nun frei und offen.
6. Positionieren des Embryos Vorderseite nach rechts.
7. Lösen das Gewebe aus dem Rückenmark ausgehend von der zervikalen Seite des Embryos. Schieben Sie die Zange unter dem Rückenmark (halten die Zange geschlossen). FürSteinpilze müssen unter dem Rückenmark sichtbar. Kleine Drehbewegungen unter der Wirbelsäule ausreichend, um das angrenzende Gewebe und die dorsalen Wurzelganglien (DRG) zu lösen.
8. Übertragen Sie die isolierten Rückenmark in einem neuen Tropfen kaltem HBSS-6,5% Glucose.
9. Legen Sie das Rückenmark in einer flachen Position, Hirnhaut auf der Oberseite und vordere Seite vom Experimentator.
10. "Festzunageln", die das Rückenmark mit dem restlichen Hinterhirn mit einer Zange, mit der zweiten Zange greifen die Hirnhäute. Ziehen Sie die Hirnhaut ab dem rostralen Seite des Rückenmarks.

4.2 Commissural Neuron Dissektion

1. Drücken Sie den Hinterhirn mit einer Pinzette.
2. Die Commissural Neuronen in der am Seitenteil des Rückenmarks (der Rückenseite). Schneiden Sie dieses Seitenteil mit einem feinen Skalpell.

Hinweis: Das Rückenteil des Rückenmarks können aus dem ventralen Teil durch die Differenz der Zell d unterschieden werdenichte, wobei der ventrale Teil mehr undurchsichtig.

Hinweis: Um beide Seiten mit der gleichen Qualität zu schneiden, gehen von der rostralen Seite und abwechselnd schneiden Sie ein kleines Länge der rechten Seite und der linken Seite.

3. Schützen Sie die sezierten Gewebes in Neurobasalmedium auf Eis für den sofortigen Einsatz.

5. Die Behandlung von Commissural Tissue mit der FP ^cm

Hinweis: Dieses Verfahren gilt nicht sterilen Bedingungen. Das Gewebe sollte im Einzel 1,5-ml-Röhrchen gesammelt werden. Der gefrorene FP ^cm sollte nur einmal verwendet werden. Vermeiden Sie mehrfache Wiedereinfrieren. Bereiten warmen FP ^cm (37 ° C).

5.1 Behandlungen von kommissuralen Neuronen

1. Dilacerate die kommissuralen Gewebe mit kleinen Schere.

Hinweis: Schneiden Sie das Gewebe so klein wie möglich, um die Zugänglichkeit der Zellen verstärken.

2. Verteilen ziemlich das Gewebe zwischen den verschiedenen experimentellen Bedingungen Kontrollbehandlung und FP ^cm Behandlung.
3. Zentrifugieren Gewebefragmente bei 800 × g für 1 min bei 4 ° C
4. Überprüfen Sie die Aufteilung zwischen den Röhren.

Hinweis: Bei Bedarf umverteilen und Zentrifuge wieder, bis Fragmente werden gleichmäßig verteilt.

5. Entfernen Sie den Überstand.
6. In den warmen FP ^cm und Kontrollbehandlungen zu den Geweben.

Hinweis: Das Volumen bezieht sich auf die Menge der Pellets eingestellt werden und sollte mindestens das Doppelte des Volumens der Tablette sein.

7. Inkubieren bei 37 ° C für 30 min.

Hinweis: Behutsam alle 10-15 min schütteln

8. Zentrifugieren bei 800 g für 1 min und entfernen Sie die Behandlung.
9. Fügen Sie die Lyse-Puffer

Hinweis: Die Lautstärke muss auf die eine eingestellt werdenHalterung des Pellets und sollte mindestens das doppelte Volumen des Pellets sein.

10. Pipette auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren.

Hinweis: Ein Wirbel kann ebenfalls verwendet werden.

11. Inkubation 15 min auf Eis.
12. Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min bei 4 ° C
13. Halten Sie den Überstand und messen die Menge des Proteins mit einem Bradford-Test ^9.
14. In 6x Laemmli-Puffer.
15. Inkubieren bei 95 ° C für 5 min auf den Proteingehalt zu denaturieren.

Hinweis: Die Proben können sofort verwendet werden oder bei -80 ° C gelagert werden

16. Bewerten Sie die Auswirkungen der Behandlung durch ^{Western-Blot-10.}

Hinweis: Mindestens 50 ug Gesamt-Proteine ​​sollten für jede Bahn geladen werden.

Ergebnisse

Kommissur-Gewebe wurden durch das FP ^cm behandelt, und die Proben wurden zur Analyse der Rezeptorspiegel im Western-Blot bearbeitet. Die Anwendung der FP ^cm wurde gezeigt, um die Ebenen eines Führungs Rezeptor, PlexinA1, die die Empfindlichkeit des kommissuralen Axone der Mittellinie abweisend Semaphorin3B nach der Überquerung (Abbildung 2) vermittelt zu erhöhen. Dies zeigte, dass Signale, die von der FP veröffentlicht regulieren PlexinA1 Ebenen ^4,6.

Diskussion

Die Produktion von Bodenplatte konditionierten Medium bietet eine effiziente und einfache Möglichkeit für die Beurteilung der biologischen Eigenschaften der Bodenplatte frei Signale.

Das Plasma-Thrombin-Matrix bietet eine hervorragende Voraussetzung für die Gewebeüberlebens. Dennoch könnte diese angereicherten Umgebung eine Beschränkung für einige Typen von Experimenten. So kann die Bodenplatte Gewebe auch in Agarose-Matrix kultiviert werden. Die Qualität der Bodenplatte konditionierte Mediu...

Materialien

Tabelle 2. Werkzeuge und Materialien.

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien erforderlich
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- frei	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasales	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Rekonstitution in H2O und Filtrat)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Rekonstitution in H2O und Filtrat)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerin	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten	Roche	04 693 116 001
Natriumorthovanadat (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Destilliertes H 2O
Tabelle 1.Reagenzien erforderlich.
Werkzeuge und Materialien
Chirurgische Schere	Fine Science Tools	14002-12
Adson-Zange	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips Pinzette	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Dissektion und FP-Kultur Ethanol 70% dissektion Haube Dissektionsmikroskop Petrischale Glasdeckgläser 18 mm x 18 mm Bunsen-Gasbrenner 24-Well-Platte Gewebekultur-Inkubator (37 &Grad; C, 5% CO2, feuchtekontrolliert) Zentrifuge Recipes FP Nährmedien Neurobasal B27 1/50e Verdünnung aus dem Stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μ l Lysepuffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerin 10% IGEPAL (NP40) 0,10% Protease-Inhibitor-Cocktail 1x Natriumorthovanadat 0,2 M H2O Laemmli Puffer Tris 0,5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerin DTT 0,6 M Bromphenol blue H2O < tr> < td>60%

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