Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die in Zwei-Photonen-Bildgebung von Maus Cortex während Verhalten in einer Umgebung der virtuellen Realität beteiligt experimentellen Verfahren.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat Zwei-Photonen-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug in den Neurowissenschaften, wie es für chronische Messung der Aktivität von genetisch identifizierten Zellen während Verhalten ^6.1. Hier beschreiben wir Methoden, um Zwei-Photonen-Imaging in Maus Kortex, während das Tier navigiert ein Virtual-Reality-Umgebung. Wir konzentrieren uns auf die Aspekte der experimentellen Verfahren, die Schlüssel in einem Tier verhalten in einem hell erleuchteten virtuellen Umgebung Bildgebung sind. Die wichtigsten Probleme, die in diesem Versuchsaufbau, dass wir hier sind, entstehen Adresse: Minimierung Gehirn Bewegung bezogenen Artefakte minimiert Lichtaustritt aus der virtuellen Realität Projektionssystem und der Minimierung der laserinduzierten Gewebeschäden. Wir bieten auch Beispiel-Software, um die Virtual-Reality-Umgebung zu steuern und Schüler Tracking zu tun. Mit diesen Verfahren und Mittel sollte es möglich sein, einen herkömmlichen Zwei-Photonen-Mikroskop zur Verwendung in Mäusen verhalten konvertieren.

Einleitung

Zwei-Photonen-Imaging von Calcium-Indikatoren (genetisch wie GCaMP5 ⁷ oder R-GECO ^8, oder synthetische Farbstoffe wie OGB oder Fluo4 kodiert) als leistungsfähige Methode zur Messung der neuronalen Aktivität in Mäusen verhält ^6.1 entstanden. Sie ermöglicht die gleichzeitige Messung der Aktivität von Hunderten von Zellen mit nahezu einzelnes Aktionspotential Auflösung, bis zu etwa 800 &mgr; m unter der Hirnoberfläche ^9,10. Darüber hinaus mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) neuronale Aktivität gemessen werden kann chronisch ^5,11,12 und in genetisch definierten Zelltypen ^13. Zusammen bieten diese Methoden einen Grad an zeitlicher und räumlicher Auflösung, die sich eröffnen eine Vielzahl neuer Möglichkeiten bei der Untersuchung von neuronalen Berechnung in vivo.

Der chirurgische Eingriff ist notwendig, um für die Bildgebung aussetzen und beschriften Sie die Maus Gehirn. Zellen werden typischerweise unter Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten vir transfizierten us (AAV)-System für GECI Lieferung und kranial Fenster auf die Injektionsstelle implantiert, um einen optischen Zugang zum Gehirn zu erhalten. Ein Kopfleiste wird dann an den Schädel für Kopf-Fixierung unter der Zwei-Photonen-Mikroskop angebracht. Das Design und die Implementierung dieser Schritte ist kritisch, da die meisten der Probleme, wach Bildgebung ergeben sich Instabilitäten bei der Herstellung. Idealerweise sollte für chronische Abbildung von bis zu mehreren Monaten nach der Operation die hier beschriebene Vorgehensweise zu ermöglichen.

Um visuell geführte Verhalten während der Zwei-Photonen-Imaging ermöglichen, sitzt der Kopf fixiert Maus auf einem Luft unterstützt Kugellaufband, die sie verwenden können, um eine virtuelle Realität Umgebung zu navigieren. Locomotion der Maus auf dem Laufband ist, um die Bewegung in der virtuellen Umgebung, die auf einem Ring Bildschirm rund um die Maus ^14,15 angezeigt wird, gekoppelt. Verhaltensvariablen, wie Fortbewegung, visuellen Reiz und Pupillenposition aufgezeichnet ⁶ werden.

t "> Wir beschreiben die Verfahren bei chronischen Zwei-Photonen-Imaging bei Mäusen Erforschung einer virtuellen Umgebung beteiligt Die wichtigsten Punkte angesprochen werden:. Reduzierung von Bewegungsartefakten, Reduzierung der Licht Leck, Maximierung der Anzahl der gleichzeitig aufgenommenen Zellen, und die Minimierung der Foto Schäden. Wir bieten auch Informationen über die Einrichtung des luftgestützten Laufband, Schüler-Tracking und die Umgebung der virtuellen Realität. Die hier beschriebenen Verfahren können zur Abbildung fluoreszenzmarkierten Zellpopulationen im Kopf fixiert Mäuse in einer möglicherweise Vielzahl von Verhaltensparadigmen verwendet werden .

Protokoll

Alle Tier Verfahren wurden genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Veterinärdirektion des Kantons Basel-Stadt durchgeführt.

1. Hardware-und Software-Setup

1. Zwei-Photonen-Scanning-Mikroskop-Setup:
   1. Verwenden eines gepulsten IR-Laser als Beleuchtungsquelle (Pulsbreite <120 fs).
   2. Verwenden Sie einen Scankopf eines 8 oder 12 kHz Resonanz-Scanner und ein Standard-Galvanometer Hinweis aus:. Dies ermöglicht Bildraten von 40 oder 60 Hz bei 750 x 400 Pixel. Eine hohe Bildrate ist entscheidend für die Minimierung Gehirn Bewegung induzierte Bildverzerrung. Darüber hinaus schnell Resonanzscanergebnisse in einer höheren Signalausbeute und reduziert Bleichen ¹⁶ und Phototoxizität.
   3. Verwenden Sie einen Piezo-Hochgeschwindigkeits-z-Schritt zu erwerben zeitverschachtelten Bilder nacheinander an verschiedenen Tiefen. Hinweis: Dies ist optional und wird verwendet, um Daten-Ausbeute auf Kosten der Framerate zu erhöhen.
   4. Verwenden Sie amechanische Blanker der Laserbelichtung auf das Gewebe zu reduzieren. Die Breite des Blanker Abhängigkeit von der Amplitude der Resonanzscanner. Hinweis: Wegen der sinusförmigen Natur der Abtastbahn eines Resonanzscanner, bewegt sich der Laserstrahl vergleichsweise langsam an den Scan Wendepunkten. Zu einer Schädigung des Gewebes an diesen Wendepunkten, wo die Laserbelichtung am größten zu verhindern, wird eine mechanische Austaster in der Brennebene zwischen dem Scan-und Rohrlinsen, die den Laserstrahl stoppt eingeführt.
   5. Zur Datenerfassung mit einem Hochgeschwindigkeits-Digitizer (800 MHz) in Kombination mit einem Field-Programmable Gate Array (FPGA). Hinweis: Die FPGA-Hochpass-Filter und Sortierfächer der PMT-Signal in Pixel. Die Kombination des Hochpass-Filters auf dem FPGA und der wirksamen Tiefpaßfilter auf dem PMT-Verstärker Ergebnis in einem Bandpassfilter zentriert rund um die Wiederholungsrate des Lasers (80 MHz). Probe-FPGA-Code ist als Ergänzung zur Verfügung gestellt.
2. Air-gestützte Laufband Setup basiert auf dem Design von Dombeck und Kollegen ²
   1. Verbinden der Kugelhalter mit einer Luftversorgungsleitung mit einer Luftzufuhrrohr von mindestens 10 mm Innendurchmesser. Maximieren Sie den Querschnitt des Kugelhalter Luftzufuhreingang und legen reichliche Menge an Schlauch zwischen der Hauptluftzufuhr und dem Kugelhalter. Hinweis: Erhöhte Querschnitt und Länge des erhöhten Luftzufuhrschlauch reduziert die Geräuschentwicklung.
   2. Legen Sie eine Styropor Kugel (20 cm Durchmesser) in einem speziell entwickelten und 3D-gedruckten Kugelhalter.
   3. Wenn die Verhaltens Paradigma erfordert nur nach vorne (und hinten) Fortbewegung, beschränken die Bewegung der Kugel auf die horizontale (Pitch)-Achse, indem Sie einen Stift (z. B. eine 19-G-Injektionsnadel) auf der Seite der Kugel. Hinweis: In der Regel passen sich Tiere das Setup viel schneller in dieser reduzierten Dreh Paradigma.
   4. Spur der Bewegung der Kugel mit einem oder zwei optische Computermäusezur Bewegung um zwei oder alle drei Achsen zu erfassen, die jeweils. Hinweis: Die Computermäuse sollte idealerweise mit einer Infrarot-Diode für wenigstens Störung der Bildgebung zu betreiben.
3. Virtuelle Realität Umwelt-Setup
   1. Bereiten Sie die Umgebung der virtuellen Realität. Hinweis: Eine Probe Umgebung auf Basis von Panda3D, ein frei verfügbares Spiel-Engine wird als Ergänzung zur Verfügung gestellt. Die Objekte der virtuellen Umgebung verwenden Wings3D, eine Open-Source-3D-Modellierer erzeugt. Das Beispielprogramm liest Positionsinformationen über eine Datenerfassungskarte und übersetzt diese in eine Bewegung in der virtuellen Umgebung. Der Code führt auch die nichtlineare Transformation für die Umwelt, auf eine Leinwand projiziert werden Ringkern erforderlich. Der detaillierte Aufbau des Ringbild anderswo ^14,17 beschrieben.
   2. Verwenden Sie LED-Projektoren oder LED-Hintergrundbeleuchtung und Computer-Bildschirme für die Anzeige der virtuellen Umgebung. Integrieren Sie eine Gating-Kreiscuit für schnelle Flackern der LED während der Bildgebung. Hinweis: Ein inhärentes Problem bei der Zwei-Photonen-Bildgebung bei der visuellen Stimulation Lichtleck von der visuellen Stimulationssystem, die durch Abschirmen des Ziels reduziert werden kann stammen. Allerdings kann die Lichtleck von der visuellen Stimulationssystem vollständig durch Synchronisieren der Lichtleistung des Projektors, der den Wendepunkten der Resonanzscanner (wenn Daten nicht erfasst) abgeschafft werden, da mit LED-Arenen für visuelle Stimulation während der Bildgebung verwendet gemacht wird ^{Drosophila-18.} Dies führt zu einer effektiven Hochgeschwindigkeitswechsel von visuellen Stimulation und Datenerfassung (siehe Fig. 2). Das Flackern Frequenz (24 kHz) ist um Größenordnungen über der Flimmerverschmelzungsfrequenz Schwellenwert, über dem Flackern nicht mehr durch das Tier wahrgenommen. Der elektronische Schaltbild dieser Modifikation eines handelsüblichen LED-Projektor ist in Fig. 3 gezeigt.
4. Welpeil Tracking
   1. Verwenden Sie einen CMOS-basierte Video-Kamera (30 fps) für Schüler Positionsverfolgung. Stellen Sie sicher, dass die Kamera nicht ein Infrarot-Sperrfilter enthalten. Hinweis: Der Schüler mit hohem Kontrast bei Aufnahmen durch Streulicht von der Zwei-Photonen-Laser-Anregung durch das Auge verlassen sichtbar ist. Schüler-Position und Durchmesser wird in Echtzeit mit Hilfe von individuell programmierte Software basiert auf dem Design von Sakatani und Isa ¹⁹ extrahiert.

2. Die Injektion von Genetic Calcium-Indikator-und Fenster-Implantat

Das Einspritzen eines Calciumindikator ²⁰ und die Implantation des Schädelfenster ²¹ durchgeführt werden, wie zuvor mit folgenden Zusätzen beschrieben:

1. Injizieren des Virus in der Region von Interesse unter Verwendung eines Glasinjektionspipette mit Virus-Lösung aufgefüllt und auf einen Druck Einspritzsystem verbunden. Stellen Sie den Druck in Abhängigkeit von der Pipette InnenDurchmesser, in der Regel ca. 70-140 mbar bis etwa 100 nl der Viruslösung im Verlauf von 1-2 min injizieren. Geringes Volumen Einspritzimpulse bei niedriger Frequenz (0,05 sec Impulse bei 2 Hz) geliefert werden sollten, um Überlauf des Virus entlang der Pipette während der Injektion zu verhindern. Hinweis: Um die Einspritzmenge zu überwachen, können die Pipette bei kleinen gekennzeichnet werden gleichmäßigem Abstand Längen (zB 0,5 mm) unter einem Stereomikroskop. Verlagerung des Meniskus zwischen den Markierungen kann dann verwendet werden, um das eingespritzte Volumen abzuschätzen.
2. Einige Wochen nach der Injektion sollte dies in einem Bolus von dicht markierten Zellen mit einem Durchmesser von etwa 500 &mgr; m führen. Wirksamkeit GECI Expression in der Region von Interesse hängt von der Wahl des GECI und Promotor-sowie infektiösen Titer und Serotyp des rekombinanten AAV verwendet. Hinweis: Als repräsentatives Beispiel Injektion AAV2/1-EF1α-GCaMP5 mit eine Virus titER von 8 x 10 ¹² GC / ml in primären visuellen Kortex von einer Maus führt zu zufriedenstellenden Ausdruck bei etwa zwei Wochen nach der Injektion (Fig. 1).
3. Die Kopfleiste sollte nicht behindern das Sichtfeld der Maus, sollte aber fest genug, um für eine stabile Bildgebung während Verhalten zu ermöglichen. Dies erfordert in der Regel zwei Befestigungspunkten auf beiden Seiten des Kopfleiste (siehe Abbildung 1). Um fest an die Kopfleiste des Schädels, stellen Sie sicher, zu maximieren und trocknen Sie den Bereich des Schädels ausgesetzt, wo der Kopf Leiste angebracht werden. Zusätzlich mit einem Skalpell oder einer Spritze, kratzen die Schädel oberflächliche Rillen, wodurch die Oberfläche vergrößert zum Kleben zu schaffen. Decken Sie die Knochen mit Sekundenkleber Gewebekleber vor dem Anbringen des Kopfbalkens mit Zahnzement.

3. Versuchsdurchführung

1. Zwei bis drei Wochen nach der Virusinjektion, überprüfen Sie die Fenster Schädelimplantat für Klarheit und Expression unter epiFluoreszenzbeleuchtung. Deutlich sichtbar und scharf definierten Grenzen der oberflächlichen Blutgefäße sind ein gutes Indiz dafür, dass das Fenster Implantat geeignet ist für die Bildgebung (siehe Abbildung 1).
2. Messen und Einstellen der Laserleistung auf einen Wert unterhalb von 50 mW an der Probe.
3. Schalten Sie den Luftstrom zu dem sphärischen Laufband.
4. Für Kopf-Fixierung unter dem Mikroskop, kurz betäuben das Tier mit Isofluran, Stress zu reduzieren. Legen Sie das Tier in eine Isofluran-Narkose Behälter und warten, bis die Tierhaltestellen bewegen (ca. 10 sec). Nehmen Sie das Tier sofort und Kopf fixieren unter dem Mikroskop.
5. Positionieren der visuellen Anzeigesystem so nahe wie möglich an das Tier noch für den Zugang zu dem Tier zu ermöglichen. Je weniger Sichtkontakt das Tier mit dem Experimentator, der weniger belasteten das Tier während der ersten Phase des Experiments.
6. Stellen Sie sicher, dass die Schädelfenster Implantat ist frei von Staub und Schmutz. Mit Wasser reinigenfalls notwendig.
7. Bewerben klar Ultraschall-Gel als Immersionsmedium zwischen der Schädelfenster und Wasserimmersionsobjektiv. Dies löst Probleme der langsamen Verschlechterung der Bildqualität durch Wasserverdampfung oder Leckage und verringert die Notwendigkeit, um einen Kegel auf dem Kopf Stangenhalterung, Wasser zu halten. Hinweis: Centrifuge das Gel vor Gebrauch, um alle Luftblasen zu entfernen, und kümmern sich nicht um die Luft zu erstellen Luftblasen während der Anwendung des Gels. Luftblasen können die Bildqualität stark beeinträchtigen.
8. Wickeln Sie ein Stück schwarzes Klebeband um den Ziel-und Kopfleiste zur Lichtabschirmung.
9. Bewegen Sie den virtuellen Umgebung Arena, um seine endgültige Position und stellen Sie die Videokamera für Schüler-Tracking.
10. Stellen Sie den Laser Blanker, um den Scan Amplitude während des Experiments übereinstimmen.
11. Starten Sie die Aufnahme-Daten.

Ergebnisse

Die Bildqualität in Zwei-Photonen-Calcium-Imaging von Zellpopulationen mit einer markierten GECI hängt weitgehend von der Qualität der Schädel Fenster Implantats. Zwei Wochen nach der Virusinjektion in die Schädelfenster sollte für Klarheit geprüft werden. Es sollte kein Granulationsgewebe oder Knochen Nachwachsen sichtbar (Abbildung 1A) sein. Darüber hinaus sollte das Muster der oberflächlichen Blutgefäße unverändert bleiben und die Grenzen des Gefäßsystems sollte scharf sein. Zur gleichen Zeit kann GE...

Diskussion

Der Schlüssel zum Erfolg des Verhaltens Zwei-Photonen-Bildgebung ist die Stabilität der Zubereitung in zwei Arten:

1. Im Laufe der Tage nach der Implantation Fenster können entzündliche Reaktionen des Gewebes auf die Verbesserung der Bildung von Granulationsgewebe und Knorpel, behindern oder sogar verhindern Bildgebung führen wird.
2. Während des Experiments das Gehirn ausreichend stabil, um Bewegungsartefakte zu korrumpieren neuronalen Aktivität verbunden Fluoreszenzsignals zu verhindern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Deckgläser (Durchmesser = 3-5 mm)	Menzel		Fensterimplantat
InSight DeepSee Laser	Spectra-Physics		Mikroskop
12 kHz Resonanzscanner	Cambridge Technology	G1-003-30026	Mikroskop
Galvometer	Cambridge Technology	G6215H	Mikroskop
Digitizer	National Instruments	NI 5772
Mikroskop FPGA	National Instruments	PXIe 7965R	Mikroskop
Erfassungskarte	National Instruments	PCIe 6363
Mikroskop Emissionsfilter 525/50	Semrock	FF03-525/50-25	Mikroskop
Piezoelektrischer Z-Antrieb	Physikinstrumente	P-726.1CD
Mikroskop Controller für piezoelektrisches Mikroskop Antrieb	Physikinstrumente	E665 LVPZT	Mikroskop
Objektiv 16X, 0.8NA	Nikon	CFI75	Mikroskop
Stromverstärker	Femto	DHPCA-100	Mikroskop
Photomultiplier Tube	Hamamatsu		Mikroskop
USB Kamera ohne IR-Filter	ImagingSource	DMK22BUC03	Pupillenverfolgung
Objektiv 50 mm	ImagingSource	M5018-MP	Pupillenverfolgung
Makro-Adapterringe	ImagingSource	LAexSet	Pupillenverfolgung
Optische Computermaus	Logitech	G500	Bewegungsverfolgung
Styroporkugel 20 cm	z.B. idee-shop.de	08797.00.15	virtuelle Umgebung
LED-Projektor	Samsung	SP-F10M	virtuell environment
Acquisition card	National Instruments	6009	virtuelle Umgebung
Panda3D game engine		www.panda3d.orgvirtuelle	Umgebung
Numpy		href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org	virtuelle Umgebung
Scipy Bibliothek für Python		www.scipy.org	virtuelle Umgebung
NI-DAQmx-Treiber	National Instruments	www.ni.com	virtuelle Umgebung
Ultraschallgel	Dahlhausen	5701.0342.10	Bildgebung