Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Zusammenfassung

Das sensorische Vorderhirn besteht aus kompliziert miteinander verbundenen Zelltypen, deren funktionelle Eigenschaften noch nicht vollständig geklärt sind. Das Verständnis der Wechselwirkungen dieser Vorderhirnschaltkreise wurde in jüngster Zeit durch die Entwicklung optogenetischer Methoden zur lichtvermittelten Modulation der neuronalen Aktivität unterstützt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der funktionellen Organisation von Vorderhirnschaltkreisen in vitro mittels Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin, das optogenetisch über virale Transfektion exprimiert wird. Dieser Ansatz nutzt auch den Nutzen der Cre-Lox-Rekombination in transgenen Mäusen, um die Expression in bestimmten neuronalen Zelltypen zu beeinflussen. Nach der Transfektion werden die Neuronen physiologisch in Schnittpräparaten mit Hilfe einer Ganzzell-Patch-Clamp aufgezeichnet, um ihre evozierten Reaktionen auf die Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin-exprimierenden Fasern zu messen. Dieser Ansatz ermöglicht eine Beurteilung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften. Morphologische Korrelate können durch Abbildung der neuroanatomischen Expression von Kanalrhodopsin-exprimierenden Fasern mittels konfokaler Mikroskopie des lebenden Schnitts oder postfixierten Gewebes erhalten werden. Diese Methoden ermöglichen funktionelle Untersuchungen von Schaltkreisen im Vorderhirn, die konventionellere Ansätze erweitern.

Einleitung

Die ausgeklügelten Schaltkreise des Vorderhirns von Säugetieren stellen eine experimentelle Herausforderung dar, um die funktionellen Rollen seiner miteinander verflochtenen Komponenten zu entschlüsseln. Die Entwirrung dieser Zusammenhänge wurde in jüngster Zeit durch die Entwicklung optogenetischer Methoden zur spezifischen Anregung und Hemmung neuronaler Populationen und ihrer Projektionen unterstützt^1-3. Diese Ansätze machen sich die genetisch kontrollierte Expression von Membrankanälen zunutze, die auf Licht^{reagieren 4-6}. Besonders hervorzuheben ist, dass Channelrhodopsin, ein lichtgesteuerter Ionenkanal, nach optischer Stimulation neuronale Membranen depolarisiert, was zu einer Erregung des exprimierenden Neurons und seiner Projektionen führt^4,7. Umgekehrt hyperpolarisiert Halorhodopin, eine lichtgesteuerte Chloridpumpe, die Membran und hemmt so die gezielte Projektion^6,8,9. Mehrere Varianten dieser Opsine wurden entwickelt, mehrere Vektoren für die Transfektion und Expression in neuronalen Populationen von Interesse hergestellt und transgene Mauslinien entwickelt, die diese Opsine konstitutiv exprimieren oder eine Cre-Lox-vermittelte Kontrolle ihrer Expression ermöglichen^1,2,10,11.

Die Nützlichkeit dieser optogenetischen Methoden und Materialien hat die moderne experimentelle Neurowissenschaft revolutioniert und ermöglicht es, die Rolle spezifischer neuronaler Schaltkreise in der Physiologie und dem Verhalten des Organismus^12-15 zu analysieren. Insbesondere können diese Methoden mit Hilfe von in vitro Schnittpräparaten^16-20 kraftvoll auf die funktionelle Dissektion von Gehirnschaltkreisen angewendet werden. In diesem Zusammenhang ist einer der Hauptvorteile dieser Methode die Fähigkeit, die Physiologie von Langstreckenprojektionen zu charakterisieren, die schwierig, wenn nicht gar unmöglich in einer dicken Scheibe zu erhalten sind, wie z. B. die kommissuralen Verbindungen zwischen den Gehirnrindenhemisphären¹⁶. Darüber hinaus ermöglicht diese Technologie Manipulationen, die mit anderen Methoden nicht möglich sind, wie z.B. die selektive Hemmung von Projektionen mit feiner zeitlicher Präzision unter Verwendung von Halorhodopsin^6,8,9. Darüber hinaus ermöglicht die zelltypspezifische Expression dieser Opsine die selektive Stimulation oder Hemmung isolierter Komponenten in einem neuronalen Schaltkreis^1,2,11,15,21. Als solche ermöglichen diese neuartigen optogenetischen Werkzeuge eine beispiellose Analyse der neuronalen Beiträge zu Physiologie und Verhalten.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Expression von Channelrhodopsin im Gehirn von Mäusen unter Verwendung von Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren^1,2. Eine spezifische Transfektion von Zielneuronalpopulationen kann unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt werden, mit der geeigneten Auswahl an Promotorkonstrukten oder transgenen Mäusen, die Cre-Rekombinase in den Zielneuronen von Interesse exprimieren, und einem "floxierten" viralen Konstrukt^1,11,15,21 (Abbildung 1). Als Beispiele untersuchen wir hier die kortikokortikalen Projektionen zwischen dem primären visuellen Kortex (V1) und dem sekundären visuellen Kortex (V2) sowie die kortikothalamische Projektion der Schicht 6 vom primären somatorsensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren medialen Kern (VPm). Wir kombinieren diese spezifische Expression mit Laser-Scanning-Photostimulation in vitro, um die synaptische Physiologie und funktionelle Topographie zu beurteilen. Der hier vorgestellte Aufbau ermöglicht die präzise räumliche Positionierung und Steuerung der Loci der Photostimulation. Abschließend beschreiben wir die Visualisierung von Expressionsmustern mittels konfokaler Mikroskopie.

Protokoll

1. Chirurgie und Injektionen

1. Anästhesieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion (22-25 g Nadel empfohlen) von Ketamin (100-120 mg/kg) und Xylazin (7,5-16 mg/kg).
   1. Beurteilen Sie die Sedierung mit starken Zehenkneifungen, bis keine Reaktionen hervorgerufen werden. Für alle beschriebenen Tierverfahren ist bei Bedarf eine Änderung vorzunehmen, um den lokalen IACUC-Richtlinien zu entsprechen.
2. Setzen Sie sedierte Mäuse in ein stereotaktisches Gerät ein, indem Sie den Kopf und die Ohren in ihren jeweiligen Halterungen befestigen.
   1. Schmieren Sie die Augen, bevor Sie das Tier in das stereotaktische Gerät einsetzen, mit einer sterilen Augensalbe.
3. Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Bereich mit Betadine-Tupfern.
4. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie und reflektieren Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln über dem zu injizierenden Bereich.
5. Drehen Sie eine Skalpellklinge als Trepan, um eine Kraniotomie über der freizulegenden Region durchzuführen. Alternativ können Sie einen kleinen Bohrer verwenden, der an einem Dremel befestigt ist, um die Kraniotomie durchzuführen.
   1. Um die Kraniotomie durchzuführen, legen Sie ein Skalpell oder einen Bohrer auf die Oberfläche des Schädels und drehen Sie sich langsam, bis genügend Knochen ausgegraben wurde, um die darunter liegende Pia mater freizulegen.
   2. Sobald die erste Exkavation erfolgt ist, vergrößern Sie die Kraniotomie mit einer feinen Pinzette, um vorsichtig Knochen von den Rändern zu entfernen.
6. Füllen Sie eine 1 μl Spritze mit der zu injizierenden Viruslösung (UNC Vector Core).
   1. Um die Wirksamkeit der Transfektion zu verbessern, bereiten Sie die Viruslösung mit 4 μg/ml Polybren vor.
7. Senken Sie die Nadel in den zu injizierenden Bereich und infundieren Sie mit einer Spritzenpumpe 200 nl virushaltige Lösung.
   1. Lassen Sie die Spritze 10 Minuten einwirken, bevor Sie die Nadel zurückziehen.
8. Nähen Sie die Haut mit nicht resorbierbarem monofilamentem Nylon und bedecken Sie den Schnitt mit antibiotischer Salbe.
   1. Die Fäden sollten nach 7-10 Tagen gezogen werden.
9. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) zur postoperativen Analgesie.
10. Lassen Sie die Tiere 14-21 Tage lang postoperativ genesen, um eine angemessene Expression von Kanalrhodopsin zu ermöglichen.

2. Vorbereitung von Schichten

1. Nach der Erholungsphase ist das Tier mit einer Isoflurananästhesie tief zu betäuben, was durch das Fehlen eines Entzugsreflexes bestätigt wird, wenn der Hinterfuß und/oder die Zehen fest eingeklemmt sind.
2. Präparieren Sie das Gehirn durch Enthauptung, gefolgt von Mittellinien- und Frontschnitten am Schädel.
3. Schälen Sie den Schädel von der Mittellinie ab, um das Gehirn freizulegen.
4. Entferne das Gehirn vorsichtig mit einem feinen Spatel, um die Hirnnerven von der Basis des Gehirns zu trennen.
5. Legen Sie das präparierte Gehirn schnell in ein kleines 100-ml-Becherglas mit gekühlter, eiskalter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25_NaH2PO₄, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 25 Glukose).
6. Entfernen Sie das Gehirn aus dem ACSF und legen Sie es auf einen Objektträger, der mit mit ACSF vorbenetztem Filterpapier bedeckt ist.
7. Machen Sie mit einer sauberen Rasierklinge einen blockierenden Schnitt des Gehirns in der gewünschten Ausrichtung.
8. Befestigen Sie die blockierte Oberfläche des Gehirns mit Sekundenkleber auf der Schnittphase.
9. Übertragen Sie die Phase in eine Vibratom-Schneidkammer (bis zum Schneiden im Gefrierschrank aufbewahrt).
10. Gießen Sie eiskaltes ACSF in die Schneidkammer.
11. Schneiden Sie Gehirnschnitte bei 400-500 μm mit einem vibrierenden Gewebeschneider.
12. Die Gehirnschnitte werden in eine Haltekammer mit sauerstoffreichem ACSF überführt und vor dem Experiment mindestens 1 Stunde lang bei 30 °C inkubiert.

3. Physiologische Aufzeichnung

1. Nach der Inkubationszeit wird eine Scheibe in eine Aufnahmekammer auf einem modifizierten Mikroskoptisch überführt.
2. Sichern Sie die Scheibe während des Experiments im Bad mit ein paar Fäden aus Nylonfilamenten, die an einem Scheibenhalter aus Platindraht befestigt sind.
3. Perfusionieren Sie das Slice ständig mit ACSF.
4. Ziehen Sie die Aufzeichnungspipetten auf einen Spitzenwiderstand von 3-6 MΩ, wenn sie mit einer intrazellulären Lösung gefüllt sind, die Folgendes (in mM) enthält: 127 K-Gluconat, 3 KCl, 1 MgCl₂, 0,07 CaCl₂, 10 HEPES, 2 Na_2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. Die intrazelluläre Lösung sollte einen pH-Wert von 7,3 haben, mit KOH oder Gluconsäure eingestellt werden und eine Osmolalität von 280-290 mOsm aufweisen.
5. Unter Verwendung eines standardmäßigen Aufbaus für visualisierte Ganzzellaufzeichnungen wird die Aufnahmepipette in der Nähe des aufzuzeichnenden Neurons platziert, während ein positiver Druck^{ausgeübt wird 22,23}.
6. Lassen Sie den Überdruck ab, während Sie einen Sog ausüben, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden.
7. Wenden Sie einen kurzen Sog an, um die Membran aufzubrechen und eine Aufzeichnung der Ganzzellkonfiguration zu erstellen.
8. Zeichnen Sie die Reaktionen von Neuronen entweder in der Spannungs- oder Stromzange auf.

4. Laser-Scanning-Photostimulation

1. Starten Sie die Datenerfassungssoftware und -hardware, die in den vorherigen Berichten^23-29.
   beschrieben wurde. Hinweis: Wir haben sowohl Tidelwave²⁵ als auch in jüngerer Zeit Ephus²⁶ Akquisitionsprogramme verwendet, die in Matlab geschrieben und vom Labor von Karel Svboda bei Janelia Farms³⁰ entwickelt wurden. Für eine vollständige Beschreibung der Laser-Scanning-Photostimulation bei Ephus siehe Suter et al.²⁶ und die Schritt-für-Schritt-Anleitung³⁰.
   Hinweis: Das in diesem Artikel beschriebene Setup ist von dem von Shepherd (2012)²³ beschriebenen Setup abgeleitet. Der Laserstrahl wird über ein offenes Strahlsystem von Spiegeln durch die Objektivlinse zum oberen Port des Mikroskops auf die Scheibe geleitet (Abbildung 2).
2. Lenken Sie einen kleinen Teil des Lasers auf eine Fotodiode mit einem Mikroskopdeckglas im Lasergang ab und verwenden Sie den Stromausgang dieser Fotodiode, um die Laserintensität während der Experimente zu überwachen.
   1. Kalibrieren Sie den in der Software aufgezeichneten Fotodiodenstromausgang auf die gemessene Laserleistung in der hinteren Brennebene des Objektivs unter Verwendung eines Leistungsmessers während der Geräteeinrichtung²³.
3. Steuern Sie die Laserleistung, indem Sie ein Rad mit variabler Neutraldichte drehen. Die verwendete Laserleistung schwankte in unseren Experimenten zwischen 25-70 mW (in der hinteren Brennebene).
4. Stellen Sie die Länge und das Timing der Laserstimulation ein, indem Sie die Pulsparameter für den Laser und den Shutter ändern. Die Laserstimulation ist in der Regel 2 ms lang.
5. Nehmen Sie ein Bild der zu stimulierenden Region mit der Funktion "Video aufnehmen" auf.
6. Wählen Sie das Stimulationsgitter entsprechend den gewünschten Abmessungen aus. In der Regel verwenden wir ein 16 x 16 Stimulationsarray mit einem Abstand von 80 μm zwischen benachbarten Reihen und Spalten.
7. Überlagern Sie das Mapping-Raster mit dem aufgenommenen Bild und passen Sie den X-, Y- und Grad-Versatz an die gewünschte Position und Ausrichtung an.
8. Aktivieren Sie die Funktion "Map", um die Stimulation und Datenerfassung zu starten.
9. Nach der Erfassung der photostimulationsevozierten Reaktionen führen Sie die Analyse der kartierten Daten entweder mit dem Offline-Kartenanalyseprogramm in Tidelwave²⁵ oder dem Programm "MapAnalysis" in Ephus²⁶ durch.

5. Fixed-Slice-Imaging

1. Nach der Aufzeichnung wird die Gehirnscheibe über Nacht bei 4 ºC auf 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,01 M PBS (pH7,4) übertragen.
2. Die Scheibe in 30 % Saccharose in 4 % PFA/0,01 M PBS über Nacht bei 4 ºC übertragen.
3. 50 μm Abschnitte mit einem Kryostaten schneiden und in 0,01 M PBS auffangen.
4. Spülen Sie die Abschnitte zweimal bei Raumtemperatur in 0,01 M PBS.
5. Montieren Sie die Abschnitte und das Deckglas in einem geeigneten Antifading-Medium.
6. Übertragen Sie Schnitte auf das Konfokalmikroskop.
7. Fokussieren Sie sich auf den ROI mit weißem Licht.
8. Wählen Sie die Wellenlänge, die Bildgröße und die Wiederholung für die Bildaufnahme. Für YFP verwenden wir 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Ergebnisse

Die Laser-Scanning-Photostimulation von Projektionen zwischen dem primären visuellen Bereich (V1) und dem sekundären visuellen Bereich (V2) in der Maus wurde nach Injektionen von pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 einer Balb/C-Maus durchgeführt (Abbildung 3). Der CaMKIIa-Promotor in diesem viralen Konstrukt steuert die spezifische Expression von Kanalrhodopsin-EYFP in exzitatorischen glutamatergen Neuronen^1,15. Nach der Vorbereitung der Schnitte für die physiologische Aufzeichnung wurde die Expression von Channelrhodopsin-EYFP-Fasern, d.h. die Epifluoreszenz des konjugierten EYFP, beim Übergang von V1 nach V2 beobachtet (Abbildung 3A). Darüber hinaus wurden auch die kortikothalamischen Fasern im Nucleus geniculatus lateralis (LGN) beobachtet (Abbildung 3A). Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von einem Neuron in V2 zeigten, dass EPSCs nach Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin-EYFP-exprimierenden Fasern in den unteren Schichten von V2 hervorgerufen wurden (Abbildung 3B).

In einem anderen Beispiel wurde die Laser-Scanning-Photostimulation der kortikothalamischen Projektionen von Schicht 6 des primären somatosensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren Kern (VP) unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt. Hier verwendeten wir einen Cre-Lox-Ansatz, um spezifisch auf die Kanalrhodopsin-Expression in den interessierenden Layer-6-Neuronen und kortikothalamischen Projektionen abzuzielen. Explizit haben wir pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA in S1 von B6 injiziert. Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd-Mäuse (Abbildungen 1 und 4). Dieser transgene Mausstamm exprimiert Cre-Rekombinase spezifisch in kortikothalamischen Neuronen der Schicht 6²¹ und führt daher nur in diesen Neuronen nach der Transfektion durch das "floxierte" AAV-Konstrukt zu einer ChR-YFP-Expression. Nach der Präparation der Schnitte wurden Channelrhodopsin-EYFP-Fasern in den Neuronen der Schicht 6 und Fasern beobachtet, die zu Schicht 4 und VP projizieren (Abbildungen 4A und 4B). Die physiologische Aufzeichnung eines VPm-Neurons mit einer Ganzzell-Patch-Clamp zeigte, dass EPSCs nach Laser-Scanning-Photostimulation in der Nähe des aufgezeichneten Neurons hervorgerufen werden konnten (Abbildungen 4C und 4D).

Die Morphologie der markierten Fasern konnte anhand physiologischer Aufzeichnungen leichter beurteilt werden. In dieser Arbeit wurden (50 μm) Schnittpräparate mit Kanalrhodopsin-EYFP-Expression in kortikothalamischen Neuronen der Schicht 6 resektioniert (Abbildung 5). Dabei zeigte sich ein feines Muster markierter Fasern, die von Schicht 6 nach Schicht 4 verliefen, wo sie endeten und großflächig arborierten (Abbildung 5A). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass kortikothalamische Fasern in die weiße Substanz eindringen, die in Richtung des Thalamus verläuft (Abbildungen 5A und 5B).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der gezielten Expression von Channelrhodopsin über einen Cre-Lox-Ansatz. Transgene Mäuse, die Cre-Rekombinase in den interessierenden neuronalen Populationen exprimieren, werden mit einem "floxierten" Virus injiziert, das für Channelrhodopsin kodiert, das mit einem fluoreszierenden Protein wie YFP fusioniert. Nach der Transfektion exprimieren nur Neuronen mit Cre-Rekombinase Channelrhodopsin-EYFP. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des Aufbaus der Photostimulation. (A) Diagramm des Aufbaus der Laser-Scanning-Photostimulation. Der Laserstrahl wird sukzessive durch ein offenes Strahlsystem zu einem Shutter und einem Neutraldichtefilter (N.D.) geführt. Ein Deckglas reflektiert einen Teil des Strahls zu einer Fotodiode, die mit einem Verstärker für Laserleistungsmessungen verbunden ist. Spiegelgalvanometer werden verwendet, um den Laserstrahl durch eine Scanlinse zu positionieren, die den Strahl durch eine seitliche Öffnung an der Oberseite des Mikroskops leitet. Der Strahl wird dann durch die Objektivlinse zur Schnittvorbereitung mit einem dichroitischen Spiegel reflektiert. Für weitere Einzelheiten siehe Lam und Sherman²³ und Shepherd²⁹. (B) Beispiel für das Photostimulationsgittermuster für das repräsentative Experiment in Abbildung 3. Das 16 x 16 Stimulationsgitter wird mit einer Mikroaufnahme der Schnittvorbereitung überlagert. Ein roter Stern zeigt die Position eines Neurons an, das mit einer Ganzzell-Patch-Klemme aufgezeichnet wurde. Die Position des Laserstrahls wird durch computergestützte Positionierung der Spiegelgalvanometer zu jeder der 256 Positionen im Stimulationsgitter geführt. Die Laserpositionen der 1. 5 Stimulationsstellen sind in der Abbildung dargestellt. Die Reaktionen des aufgezeichneten Neurons auf Photostimulation an jeder der Stellen sind in Abbildung 3 dargestellt. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 3. Laser-Scanning-Photostimulation von kortikokokkalen Projektionen vom primären visuellen Kortex (V1) zum sekundären visuellen Kortex (V2) bei der Maus. (A) Epifluoreszierendes Bild der Schnittpräparation mit Channelrhodopsin-EYFP-Fasern von V1 bis V2 und im Nucleus geniculatus lateralis (LGN). Die spezifische Expression von Channelrhodopsin-EYFP in exzitatorischen glutamatergen Neuronen wird durch ein virales Konstrukt gesteuert, das den CaMKIIa-Promotor enthält. (B) Exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs), die von einem Neuron in V2 nach Laser-Scanning-Photostimulation ausgelöst werden. Ein roter Stern zeigt den Aufnahmeort an. Maßstabsleisten: (A) 500 μm, (B) 200 pA, 100 ms Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 4. Laser-Scanning-Photostimulation von kortikothalamischen Projektionen vom primären somatosensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren Kern (VP) bei der Maus. (A) Epifluoreszierendes Bild der Schnittpräparation mit Channelrhodopsin-EYFP-Fasern in S1. (B) Epifluoreszierendes Bild von markierten Fasern in VP. (C) Exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs), die nach Laser-Scanning-Photostimulation von einem VP-Neuron ausgelöst werden. (D) Darstellung der mittleren EPSCs. Ein roter Stern zeigt den Aufnahmeort an. Boxed Traces in (C) entsprechen den Boxed Werten in (D). Maßstabsleisten: (A) 250 μm, (B) 250 μm, (C) 100 pA, 100 ms. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 5. Bildgebung von Neuronen der Schicht 6, die Channelrhodopsin-EYFP im primären somatosensorischen Kortex (S1) der Maus exprimieren. (A-B) Markierte Neuronen in Schicht 6 und Fasern, die auf Schicht 4 und die weiße Substanz projizieren. Maßstabsleisten: (A) 250 μm, (B) 250 μm. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Diskussion

Das beschriebene Protokoll beschreibt einen Ansatz zur in vitro Beurteilung der funktionellen Topographie und Physiologie neuronaler Schaltkreise, der sich nicht auf die Untersuchung von Vorderhirnschaltkreisen, d.h. denen des Thalamus und des Kortex, beschränkt. Mehrere virale Konstrukte für die optogenetische Transfektion wurden der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt und sind über den UNC Vector Core leicht erhältlich. Eine Beschreibung der leicht zugänglichen viralen Konstrukte finden Sie im UNC Vector Core³¹, auf der Ressourcenseite für Optogenetik am Deisseroth Lab an der Stanford University³² und im Boyden Synthetic Neurobiology Lab am MIT³³. Varianten dieser Opsine wurden von diesen Labors entwickelt und ermöglichen weitreichende Modi zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit^1,2. Die Beschaffung dieser Vektoren aus dem UNC Vector Core erfordert eine Materialtransfervereinbarung mit den Ursprungslaboren. In diesem Protokoll stellen wir fest, dass die Zugabe von Polybren die Wirksamkeit der Transfektion erhöht. Darüber hinaus ist eine weitere Variable, die die Expression beeinflusst, die postoperative Erholungsphase, bei der wir feststellen, dass ein Zeitraum von mindestens 14 Tagen ausreicht, um eine robuste Expression in den Vorderhirnbahnen von Mäusen zu erhalten.

Für die gezielte Transfektion spezifischer neuronaler Gruppen wurden mehrere Cre-transgene Mauslinien entwickelt, die in Kombination mit "floxierten" umgekehrten offenen Leserahmen-Viruskonstrukten verwendet werden können, die entwickelt wurden¹¹. Mehrere Stämme, die für die neurowissenschaftliche Forschung relevant sind, sind über die Mutant Mouse Regional Resource Centers^{erhältlich 34}. Atlanten von Cre-rekombinase-Expressionsmustern in diesen transgenen Linien werden über die GENSAT-Datenbank³⁵ angeboten. Darüber hinaus bietet Jackson Labs mehrere Cre-transgene Stämme sowie andere an, die Opsine konstitutiv in bestimmten neuronalen Gruppen exprimieren. Ein kritischer Schritt bei der Verwendung dieser Mauslinien besteht darin, die Zeit zu berücksichtigen, die für die Gewinnung und Etablierung einer Zuchtkolonie erforderlich ist, die je nach interessiertem Stamm variieren kann.

Für die Photostimulation haben wir den vom Shepherd Lab an der Northwestern University entwickelten Aufbau verwendet und angepasst, der in einem kürzlich erschienenen Protokoll^{beschrieben wurde 29}. Obwohl dieser Aufbau für die Glutamat-Entkäfigung optimiert ist, ist er auch für die Photostimulation von Channelrhodopsin ohne Modifikation geeignet. Dieser Aufbau ermöglicht eine präzise räumliche Kontrolle und Positionierung der Loci der Photostimulation, was eine Beurteilung der funktionellen Topographie der Kanalrhodopsin-Innervation der aufgezeichneten Neuronen ermöglicht. Obwohl die räumliche Kontrolle durch dieses Verfahren der Photostimulation verbessert wird, ist es kostengünstiger als Verfahren, die eine LED-basierte Feldbeleuchtung^{verwenden 20}. Darüber hinaus ist die Ungleichmäßigkeit des Hirngewebes eine Einschränkung der Optogenetik oder aller Techniken, die eine Manipulation des Lichts beinhalten. In der Praxis spielt dies jedoch selten eine Rolle, da die Ergebnisse meist qualitativ interpretiert werden. Falls ein quantitativer Vergleich zwischen den Gehirnregionen erforderlich ist, kann man immer die maximale Lichtintensität verwenden, um "gesättigte" Reaktionen zu erzielen.

Darüber hinaus haben wir sowohl Tidelwave- als auch Ephus-Softwareprogramme verwendet, die in Matlab geschrieben wurden, um die Laser-Scanning-Photostimulation und Datenerfassung zu steuern^25,26. Es wird jedoch empfohlen, dass diejenigen, die ein ähnliches System einrichten, die neuere Ephus-Software²⁶ verwenden, für die Unterstützung über die Entwicklungsseite³⁰ von Janelia Farms verfügbar ist. Ein wichtiger Schritt ist die Entscheidung, welches dieser Softwarepakete verwendet werden soll, da sich ihre Hardwareanforderungen leicht unterscheiden. Darüber hinaus sind die Kartenanalyseprogramme auf die jeweiligen Datenerfassungsprogramme zugeschnitten.

Einige dieser Schritte können modifiziert werden, um sie an die spezielle Einrichtung des Praktizierenden anzupassen. Injektionen von viralen Lösungen können neben einer Spritze auch mit Verabreichungsmechanismen durchgeführt werden, z.B. funktionieren auch Kapillarglaspipetten, die auf Spitzendurchmesser von ~40 μm gezogen werden. Bei Operationen kann eine nichtstereotaktische Kopfhalterung ersetzt werden, wenn solche Koordinaten für die Führung der Injektionen nicht erforderlich sind. Darüber hinaus können ACSF- und intrazelluläre Lösungszusammensetzungen in Abhängigkeit von den besonderen experimentellen Anforderungen verändert werden, z. B. durch Substitution einer intrazellulären Cäsium- oder Intrazellularlösung mit hohem Chloridgehalt zur Isolierung von Hemmströmen. Eine Alternative zur Bildgebung von Expressionsmustern in festen Schichten kann auch in der lebenden Schicht auf einem geeigneten Bildgebungsrigg mit einem Badperfusionssystem durchgeführt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll den Behandler in die Lage versetzen wird, die funktionelle Topographie und synaptische Physiologie von Projektionen in vitro zu charakterisieren, was mit Standardmethoden, z. Charakterisierung von Langstreckenprojektionen, die nicht in einem Slice konserviert werden können. Das beschriebene Transfektionsprotokoll kann auf optogenetische In-vivo-Experimente ^1-3,12,14 angewendet werden, da der Verabreichungsmechanismus derselbe ist. Obwohl dieses Protokoll die Transfektion von Mäusen beschreibt, können viele der verfügbaren viralen Vektoren verwendet werden, um diese Opsine theoretisch in einer Vielzahl von Säugetierarten zu transfizieren und zu exprimieren, was eine Vielzahl von vergleichenden und speziesspezifischen Studien ermöglicht^1-3.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polybrene	Santa Cruz Biotech	SC134220
Paraformaldehyd 32% ige Lösung	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV virale Konstrukte	UNC Vector Core	NA
Maus stereotaktische Kopfhalterung	Stoelting	51730
Nanocool Injektor	Harvard Gerät	703040
UV-Laser: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;	DPSS Lasers, Inc	3500
Galvonometer	Cambridge Scanning	6210
Spiegel	Cambridge Scanning	6m2003S-A
Halterung	Cambridge Scanning	6102103L
Kabel	Cambridge Scanning	6010-19-120
Treiber/Controller	Cambridge Scanning	67121-1
Shutter - ZM beschichtet (UV-kompatibel)	Uniblitz	L23-ZM2
Shutter Controller	Uniblitz	VMM-D1
Stromverstärker	Stanford Research Systems	SR570
6713 Platine	National Instruments	777741-01
2110 Break-Out-Box	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
Kabel	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems