Methodenartikel

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

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DOI:

10.3791/50915

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27. Dezember 2013

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Zusammenfassung

Das sensorische Vorderhirn besteht aus kompliziert miteinander verbundenen Zelltypen, deren funktionelle Eigenschaften noch nicht vollständig geklärt sind. Das Verständnis der Wechselwirkungen dieser Vorderhirnschaltkreise wurde in jüngster Zeit durch die Entwicklung optogenetischer Methoden zur lichtvermittelten Modulation der neuronalen Aktivität unterstützt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der funktionellen Organisation von Vorderhirnschaltkreisen in vitro mittels Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin, das optogenetisch über virale Transfektion exprimiert wird. Dieser Ansatz nutzt auch den Nutzen der Cre-Lox-Rekombination in transgenen Mäusen, um die Expression in bestimmten neuronalen Zelltypen zu beeinflussen. Nach der Transfektion werden die Neuronen physiologisch in Schnittpräparaten mit Hilfe einer Ganzzell-Patch-Clamp aufgezeichnet, um ihre evozierten Reaktionen auf die Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin-exprimierenden Fasern zu messen. Dieser Ansatz ermöglicht eine Beurteilung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften. Morphologische Korrelate können durch Abbildung der neuroanatomischen Expression von Kanalrhodopsin-exprimierenden Fasern mittels konfokaler Mikroskopie des lebenden Schnitts oder postfixierten Gewebes erhalten werden. Diese Methoden ermöglichen funktionelle Untersuchungen von Schaltkreisen im Vorderhirn, die konventionellere Ansätze erweitern.

Einleitung

Die ausgeklügelten Schaltkreise des Vorderhirns von Säugetieren stellen eine experimentelle Herausforderung dar, um die funktionellen Rollen seiner miteinander verflochtenen Komponenten zu entschlüsseln. Die Entwirrung dieser Zusammenhänge wurde in jüngster Zeit durch die Entwicklung optogenetischer Methoden zur spezifischen Anregung und Hemmung neuronaler Populationen und ihrer Projektionen unterstützt1-3. Diese Ansätze machen sich die genetisch kontrollierte Expression von Membrankanälen zunutze, die auf Lichtreagieren 4-6. Besonders hervorzuheben ist, dass Channelrhodopsin, ein lichtgesteuerter Ionenkanal, nach optischer Stimulation neuronale Membranen depolarisiert, was zu einer Erregung des exprimierenden Neurons und seiner Projektionen führt4,7. Umgekehrt hyperpolarisiert Halorhodopin, eine lichtgesteuerte Chloridpumpe, die Membran und hemmt so die gezielte Projektion6,8,9. Mehrere Varianten dieser Opsine wurden entwickelt, mehrere Vektoren für die Transfektion und Expression in neuronalen Populationen von Interesse hergestellt und transgene Mauslinien entwickelt, die diese Opsine konstitutiv exprimieren oder eine Cre-Lox-vermittelte Kontrolle ihrer Expression ermöglichen1,2,10,11.

Die Nützlichkeit dieser optogenetischen Methoden und Materialien hat die moderne experimentelle Neurowissenschaft revolutioniert und ermöglicht es, die Rolle spezifischer neuronaler Schaltkreise in der Physiologie und dem Verhalten des Organismus12-15 zu analysieren. Insbesondere können diese Methoden mit Hilfe von in vitro Schnittpräparaten16-20 kraftvoll auf die funktionelle Dissektion von Gehirnschaltkreisen angewendet werden. In diesem Zusammenhang ist einer der Hauptvorteile dieser Methode die Fähigkeit, die Physiologie von Langstreckenprojektionen zu charakterisieren, die schwierig, wenn nicht gar unmöglich in einer dicken Scheibe zu erhalten sind, wie z. B. die kommissuralen Verbindungen zwischen den Gehirnrindenhemisphären16. Darüber hinaus ermöglicht diese Technologie Manipulationen, die mit anderen Methoden nicht möglich sind, wie z.B. die selektive Hemmung von Projektionen mit feiner zeitlicher Präzision unter Verwendung von Halorhodopsin6,8,9. Darüber hinaus ermöglicht die zelltypspezifische Expression dieser Opsine die selektive Stimulation oder Hemmung isolierter Komponenten in einem neuronalen Schaltkreis1,2,11,15,21. Als solche ermöglichen diese neuartigen optogenetischen Werkzeuge eine beispiellose Analyse der neuronalen Beiträge zu Physiologie und Verhalten.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Expression von Channelrhodopsin im Gehirn von Mäusen unter Verwendung von Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren1,2. Eine spezifische Transfektion von Zielneuronalpopulationen kann unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt werden, mit der geeigneten Auswahl an Promotorkonstrukten oder transgenen Mäusen, die Cre-Rekombinase in den Zielneuronen von Interesse exprimieren, und einem "floxierten" viralen Konstrukt1,11,15,21 (Abbildung 1). Als Beispiele untersuchen wir hier die kortikokortikalen Projektionen zwischen dem primären visuellen Kortex (V1) und dem sekundären visuellen Kortex (V2) sowie die kortikothalamische Projektion der Schicht 6 vom primären somatorsensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren medialen Kern (VPm). Wir kombinieren diese spezifische Expression mit Laser-Scanning-Photostimulation in vitro, um die synaptische Physiologie und funktionelle Topographie zu beurteilen. Der hier vorgestellte Aufbau ermöglicht die präzise räumliche Positionierung und Steuerung der Loci der Photostimulation. Abschließend beschreiben wir die Visualisierung von Expressionsmustern mittels konfokaler Mikroskopie.

Protokoll

1. Chirurgie und Injektionen

  1. Anästhesieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion (22-25 g Nadel empfohlen) von Ketamin (100-120 mg/kg) und Xylazin (7,5-16 mg/kg).
    1. Beurteilen Sie die Sedierung mit starken Zehenkneifungen, bis keine Reaktionen hervorgerufen werden. Für alle beschriebenen Tierverfahren ist bei Bedarf eine Änderung vorzunehmen, um den lokalen IACUC-Richtlinien zu entsprechen.
  2. Setzen Sie sedierte Mäuse in ein stereotaktisches Gerät ein, indem Sie den Kopf und die Ohren in ihren jeweiligen Halterungen befestigen.
    1. Schmieren Sie die Augen, bevor Sie das Tier in das stereotaktische Gerät einsetzen, mit einer sterilen Augensalbe.
  3. Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Bereich mit Betadine-Tupfern.
  4. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie und reflektieren Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln über dem zu injizierenden Bereich.
  5. Drehen Sie eine Skalpellklinge als Trepan, um eine Kraniotomie über der freizulegenden Region durchzuführen. Alternativ können Sie einen kleinen Bohrer verwenden, der an einem Dremel befestigt ist, um die Kraniotomie durchzuführen.
    1. Um die Kraniotomie durchzuführen, legen Sie ein Skalpell oder einen Bohrer auf die Oberfläche des Schädels und drehen Sie sich langsam, bis genügend Knochen ausgegraben wurde, um die darunter liegende Pia mater freizulegen.
    2. Sobald die erste Exkavation erfolgt ist, vergrößern Sie die Kraniotomie mit einer feinen Pinzette, um vorsichtig Knochen von den Rändern zu entfernen.
  6. Füllen Sie eine 1 μl Spritze mit der zu injizierenden Viruslösung (UNC Vector Core).
    1. Um die Wirksamkeit der Transfektion zu verbessern, bereiten Sie die Viruslösung mit 4 μg/ml Polybren vor.
  7. Senken Sie die Nadel in den zu injizierenden Bereich und infundieren Sie mit einer Spritzenpumpe 200 nl virushaltige Lösung.
    1. Lassen Sie die Spritze 10 Minuten einwirken, bevor Sie die Nadel zurückziehen.
  8. Nähen Sie die Haut mit nicht resorbierbarem monofilamentem Nylon und bedecken Sie den Schnitt mit antibiotischer Salbe.
    1. Die Fäden sollten nach 7-10 Tagen gezogen werden.
  9. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) zur postoperativen Analgesie.
  10. Lassen Sie die Tiere 14-21 Tage lang postoperativ genesen, um eine angemessene Expression von Kanalrhodopsin zu ermöglichen.

2. Vorbereitung von Schichten

  1. Nach der Erholungsphase ist das Tier mit einer Isoflurananästhesie tief zu betäuben, was durch das Fehlen eines Entzugsreflexes bestätigt wird, wenn der Hinterfuß und/oder die Zehen fest eingeklemmt sind.
  2. Präparieren Sie das Gehirn durch Enthauptung, gefolgt von Mittellinien- und Frontschnitten am Schädel.
  3. Schälen Sie den Schädel von der Mittellinie ab, um das Gehirn freizulegen.
  4. Entferne das Gehirn vorsichtig mit einem feinen Spatel, um die Hirnnerven von der Basis des Gehirns zu trennen.
  5. Legen Sie das präparierte Gehirn schnell in ein kleines 100-ml-Becherglas mit gekühlter, eiskalter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 Glukose).
  6. Entfernen Sie das Gehirn aus dem ACSF und legen Sie es auf einen Objektträger, der mit mit ACSF vorbenetztem Filterpapier bedeckt ist.
  7. Machen Sie mit einer sauberen Rasierklinge einen blockierenden Schnitt des Gehirns in der gewünschten Ausrichtung.
  8. Befestigen Sie die blockierte Oberfläche des Gehirns mit Sekundenkleber auf der Schnittphase.
  9. Übertragen Sie die Phase in eine Vibratom-Schneidkammer (bis zum Schneiden im Gefrierschrank aufbewahrt).
  10. Gießen Sie eiskaltes ACSF in die Schneidkammer.
  11. Schneiden Sie Gehirnschnitte bei 400-500 μm mit einem vibrierenden Gewebeschneider.
  12. Die Gehirnschnitte werden in eine Haltekammer mit sauerstoffreichem ACSF überführt und vor dem Experiment mindestens 1 Stunde lang bei 30 °C inkubiert.

3. Physiologische Aufzeichnung

  1. Nach der Inkubationszeit wird eine Scheibe in eine Aufnahmekammer auf einem modifizierten Mikroskoptisch überführt.
  2. Sichern Sie die Scheibe während des Experiments im Bad mit ein paar Fäden aus Nylonfilamenten, die an einem Scheibenhalter aus Platindraht befestigt sind.
  3. Perfusionieren Sie das Slice ständig mit ACSF.
  4. Ziehen Sie die Aufzeichnungspipetten auf einen Spitzenwiderstand von 3-6 MΩ, wenn sie mit einer intrazellulären Lösung gefüllt sind, die Folgendes (in mM) enthält: 127 K-Gluconat, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. Die intrazelluläre Lösung sollte einen pH-Wert von 7,3 haben, mit KOH oder Gluconsäure eingestellt werden und eine Osmolalität von 280-290 mOsm aufweisen.
  5. Unter Verwendung eines standardmäßigen Aufbaus für visualisierte Ganzzellaufzeichnungen wird die Aufnahmepipette in der Nähe des aufzuzeichnenden Neurons platziert, während ein positiver Druckausgeübt wird 22,23.
  6. Lassen Sie den Überdruck ab, während Sie einen Sog ausüben, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden.
  7. Wenden Sie einen kurzen Sog an, um die Membran aufzubrechen und eine Aufzeichnung der Ganzzellkonfiguration zu erstellen.
  8. Zeichnen Sie die Reaktionen von Neuronen entweder in der Spannungs- oder Stromzange auf.

4. Laser-Scanning-Photostimulation

  1. Starten Sie die Datenerfassungssoftware und -hardware, die in den vorherigen Berichten23-29.
    beschrieben wurde. Hinweis: Wir haben sowohl Tidelwave25 als auch in jüngerer Zeit Ephus26 Akquisitionsprogramme verwendet, die in Matlab geschrieben und vom Labor von Karel Svboda bei Janelia Farms30 entwickelt wurden. Für eine vollständige Beschreibung der Laser-Scanning-Photostimulation bei Ephus siehe Suter et al.26 und die Schritt-für-Schritt-Anleitung30.
    Hinweis: Das in diesem Artikel beschriebene Setup ist von dem von Shepherd (2012)23 beschriebenen Setup abgeleitet. Der Laserstrahl wird über ein offenes Strahlsystem von Spiegeln durch die Objektivlinse zum oberen Port des Mikroskops auf die Scheibe geleitet (Abbildung 2).
  2. Lenken Sie einen kleinen Teil des Lasers auf eine Fotodiode mit einem Mikroskopdeckglas im Lasergang ab und verwenden Sie den Stromausgang dieser Fotodiode, um die Laserintensität während der Experimente zu überwachen.
    1. Kalibrieren Sie den in der Software aufgezeichneten Fotodiodenstromausgang auf die gemessene Laserleistung in der hinteren Brennebene des Objektivs unter Verwendung eines Leistungsmessers während der Geräteeinrichtung23.
  3. Steuern Sie die Laserleistung, indem Sie ein Rad mit variabler Neutraldichte drehen. Die verwendete Laserleistung schwankte in unseren Experimenten zwischen 25-70 mW (in der hinteren Brennebene).
  4. Stellen Sie die Länge und das Timing der Laserstimulation ein, indem Sie die Pulsparameter für den Laser und den Shutter ändern. Die Laserstimulation ist in der Regel 2 ms lang.
  5. Nehmen Sie ein Bild der zu stimulierenden Region mit der Funktion "Video aufnehmen" auf.
  6. Wählen Sie das Stimulationsgitter entsprechend den gewünschten Abmessungen aus. In der Regel verwenden wir ein 16 x 16 Stimulationsarray mit einem Abstand von 80 μm zwischen benachbarten Reihen und Spalten.
  7. Überlagern Sie das Mapping-Raster mit dem aufgenommenen Bild und passen Sie den X-, Y- und Grad-Versatz an die gewünschte Position und Ausrichtung an.
  8. Aktivieren Sie die Funktion "Map", um die Stimulation und Datenerfassung zu starten.
  9. Nach der Erfassung der photostimulationsevozierten Reaktionen führen Sie die Analyse der kartierten Daten entweder mit dem Offline-Kartenanalyseprogramm in Tidelwave25 oder dem Programm "MapAnalysis" in Ephus26 durch.

5. Fixed-Slice-Imaging

  1. Nach der Aufzeichnung wird die Gehirnscheibe über Nacht bei 4 ºC auf 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,01 M PBS (pH7,4) übertragen.
  2. Die Scheibe in 30 % Saccharose in 4 % PFA/0,01 M PBS über Nacht bei 4 ºC übertragen.
  3. 50 μm Abschnitte mit einem Kryostaten schneiden und in 0,01 M PBS auffangen.
  4. Spülen Sie die Abschnitte zweimal bei Raumtemperatur in 0,01 M PBS.
  5. Montieren Sie die Abschnitte und das Deckglas in einem geeigneten Antifading-Medium.
  6. Übertragen Sie Schnitte auf das Konfokalmikroskop.
  7. Fokussieren Sie sich auf den ROI mit weißem Licht.
  8. Wählen Sie die Wellenlänge, die Bildgröße und die Wiederholung für die Bildaufnahme. Für YFP verwenden wir 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Ergebnisse

Laser-Scanning-Photostimulation von Projektionen zwischen dem primären visuellen Areal (V1) und dem sekundären visuellen Areal (V2) bei der Maus wurde durchgeführt nach Injektionen von pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 einer Balb/C-Maus (Abbildung 3Der CaMKIIa-Promotor in diesem viralen Konstrukt ermöglicht die spezifische Expression von Channelrhodopsin-EYFP in exzitatorischen glutamatergen Neuronen.1,15Nach der Herstellung von Schnitten zur physiologischen Ableitung, Expression von Channelrhodopsin-EYFP-Fasern, das heißt Epifluoreszenz des konjugierten EYFP, wurde beim Durchtritt von V1 nach V2 beobachtet (Abbildung 3A). Zusätzlich wurden auch die corticothalamischen Fasern im lateralen Geniculum (LGN) beobachtet (Abbildung 3A). Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von einem Neuron in V2 zeigten EPSCs, die durch lasergestützte Photostimulation von Channelrhodopsin-EYFP exprimierenden Fasern in den tieferen Schichten von V2 ausgelöst wurden (Abbildung 3B).

In einem weiteren Beispiel wurde die Laser-Scanning-Photostimulation der kortikothalamischen Projektionen aus Schicht 6 des primären somatosensorischen Kortex (S1) auf den ventroposterioren Kern (VP) mithilfe dieses Protokolls durchgeführt. Dabei verwendeten wir einen Cre-Lox-Ansatz, um die Expression von Channelrhodopsin gezielt in den Neuronen der Schicht 6 und den betreffenden kortikothalamischen Projektionen anzusteuern. Konkret injizierten wir pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA in den S1 von B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd Mäusen (Abbildungen 1 und 4). Diese transgene Mauslinie exprimiert Cre-Rekombinase spezifisch in kortikothalamischen Neuronen der Schicht 621, wodurch nach Transfektion mittels des „gefloxten“ AAV-Konstrukts eine Expression von ChR-YFP ausschließlich in diesen Neuronen erfolgt. Nach der Herstellung von Schnitten konnten Channelrhodopsin-EYFP-Fasern in den Neuronen der Schicht 6 sowie in den Fasern, die zu Schicht 4 und zum VP projizieren, beobachtet werden (Abbildungen 4A und 4B). Die physiologische Aufzeichnung von einem VPm-Neuron mittels Ganzzell-Patch-Clamp zeigte, dass EPSCs durch Laser-Scanning-Photostimulation in der Nähe des aufgezeichneten Neurons ausgelöst werden konnten (Abbildungen 4C und 4D).

Die Morphologie der markierten Fasern ließ sich leichter beurteilen, nachdem physiologische Ableitungen durchgeführt worden waren. Hier schneiden wir erneut (50 μm) Schnittpräparationen mit Channelrhodopsin-EYFP-Expression in kortikothalamischen Neuronen der Schicht 6 (Abbildung 5). Dabei zeigte sich ein feines Muster markierter Fasern, die von Schicht 6 bis in Schicht 4 verliefen, wo sie endeten und sich ausgiebig verzweigten (Abbildung 5A). Zusätzlich wurden kortikothalamische Fasern beobachtet, die in die weiße Substanz eindrangen und sich in Richtung Thalamus zogen (Abbildungen 5A und 5B).

Genbearbeitungsdiagramm unter Verwendung von Cre-loxP zur gezielten ChR-YFP-Expression in einem Mausmodell.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der gezielten Expression von Channelrhodopsin mittels eines Cre-Lox-Ansatzes. Transgene Mäuse, die Cre-Rekombinase in den interessierenden neuronalen Zellpopulationen exprimieren, werden mit einem „floxed“ Virus injiziert, das Channelrhodopsin, das an ein fluoreszierendes Protein wie YFP fusioniert ist, kodiert. Nach der Transfektion exprimieren nur Neurone, die über Cre-Rekombinase verfügen, Channelrhodopsin-EYFP. Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Laser-Mikroskopie-Diagramm mit Laser-Optik, dichroischem Spiegel, CCD-Kamera und Abtastanordnung.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Photostimulationsanordnung. (A) Diagramm der Laser-Scanning-Photostimulationsanordnung. Der Laserstrahl wird nacheinander durch ein offenes Strahlsystem zu einem Verschluss und einem Neutraldichtefilter (N.D.) gelenkt. Ein Deckglas reflektiert einen Teil des Strahls auf eine Fotodiode, die mit einem Verstärker zur Messung der Laserleistung verbunden ist. Spiegelgalvanometer dienen dazu, den Laserstrahl über eine Scan-Linse zu positionieren, die den Strahl durch eine Seitenöffnung an der Oberseite des Mikroskops leitet. Der Strahl wird dann mithilfe eines dichroischen Spiegels durch das Objektiv nach unten auf das Schnittpräparat gelenkt. Weitere Einzelheiten finden sich bei Lam und Sherman23 und Shepherd29. (B) Beispiel für das Photostimulationsrastermuster im repräsentativen Experiment, das in Abbildung 3 gezeigt wird. Das 16 × 16-Stimulationsraster ist über eine Fotomikrografie des Schnittpräparats gelegt. Ein roter Stern markiert die Position eines Neurons, das mittels Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahme registriert wurde. Die Position des Laserstrahls wird durch computerisierte Steuerung der Spiegelgalvanometer an jede der 256 Positionen im Stimulationsraster gelenkt. Die Laserpositionen der ersten 5 Stimulationsstellen sind in der Abbildung dargestellt. Die Antworten des aufgezeichneten Neurons auf die Photostimulation an jeder dieser Stellen sind in Abbildung 3 dargestellt. Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.

Neuroimaging-Kartendiagramm; Analyse von LGN, V1, V2 visueller Kortex; Untersuchung neuronaler Verbindungen.
Abbildung 3. Laser-Scanning-Photostimulation kortikokortikaler Projektionen vom primären visuellen Kortex (V1) zum sekundären visuellen Kortex (V2) bei der Maus. (A) Epifluoreszenzbild des Schnittpräparats mit Channelrhodopsin-EYFP-Fasern von V1 nach V2 und zum Nucleus geniculatus lateralis (LGN). Die spezifische Expression von Channelrhodopsin-EYFP in exzitatorischen glutamatergen Neuronen wird durch einen viralen Konstrukt mit dem CaMKIIa-Promotor induziert. (B) Ausgelöste exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) in einem Neuron in V2 nach Laser-Scanning-Photostimulation. Der rote Stern markiert die Ableitungsstelle. Maßstäbe: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 ms. Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Schemazeichnung der kortikalen Schichten mit Analyse des VP-Bereichs; zeigt mikroelektrische Aktivität; elektrophysiologische Daten.
Abbildung 4. Laser-Scanning-Photostimulation kortikothalamischer Projektionen vom primären somatosensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren Kern (VP) bei der Maus. (A) Epifluoreszenzbild des Schnittpräparats mit Channelrhodopsin-EYFP-Fasern im S1. (B) Epifluoreszenzbild markierter Fasern im VP. (C) Angeregte exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) eines VP-Neurons nach Laser-Scanning-Photostimulation. (D) Darstellung der mittleren EPSCs. Der rote Stern markiert die Ableitstelle. Die框ed traces in (C) entsprechen den框ed Werten in (D). Maßstäbe: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 ms. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Fluoreszenzmikroskopie, die neuronale Strukturen zeigt, markiert mit grünen Markern; Vergleichsdiagramm.
Abbildung 5. Abbildung von Neuronen der Schicht 6, die Channelrhodopsin-EYFP im primären somatosensorischen Kortex (S1) der Maus exprimieren. (A–B) Markierte Neuronen in Schicht 6 und Fasern, die zu Schicht 4 und zur weißen Substanz projizieren. Maßstabsbalken: (A) 250 µm, (B) 250 µm. Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Diskussion

Das beschriebene Protokoll beschreibt einen Ansatz zur in vitro Beurteilung der funktionellen Topographie und Physiologie neuronaler Schaltkreise, der sich nicht auf die Untersuchung von Vorderhirnschaltkreisen, d.h. denen des Thalamus und des Kortex, beschränkt. Mehrere virale Konstrukte für die optogenetische Transfektion wurden der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt und sind über den UNC Vector Core leicht erhältlich. Eine Beschreibung der leicht zugänglichen viralen Konstrukte finden Sie im UNC Vector Core31, auf der Ressourcenseite für Optogenetik am Deisseroth Lab an der Stanford University32 und im Boyden Synthetic Neurobiology Lab am MIT33. Varianten dieser Opsine wurden von diesen Labors entwickelt und ermöglichen weitreichende Modi zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit1,2. Die Beschaffung dieser Vektoren aus dem UNC Vector Core erfordert eine Materialtransfervereinbarung mit den Ursprungslaboren. In diesem Protokoll stellen wir fest, dass die Zugabe von Polybren die Wirksamkeit der Transfektion erhöht. Darüber hinaus ist eine weitere Variable, die die Expression beeinflusst, die postoperative Erholungsphase, bei der wir feststellen, dass ein Zeitraum von mindestens 14 Tagen ausreicht, um eine robuste Expression in den Vorderhirnbahnen von Mäusen zu erhalten.

Für die gezielte Transfektion spezifischer neuronaler Gruppen wurden mehrere Cre-transgene Mauslinien entwickelt, die in Kombination mit "floxierten" umgekehrten offenen Leserahmen-Viruskonstrukten verwendet werden können, die entwickelt wurden11. Mehrere Stämme, die für die neurowissenschaftliche Forschung relevant sind, sind über die Mutant Mouse Regional Resource Centerserhältlich 34. Atlanten von Cre-rekombinase-Expressionsmustern in diesen transgenen Linien werden über die GENSAT-Datenbank35 angeboten. Darüber hinaus bietet Jackson Labs mehrere Cre-transgene Stämme sowie andere an, die Opsine konstitutiv in bestimmten neuronalen Gruppen exprimieren. Ein kritischer Schritt bei der Verwendung dieser Mauslinien besteht darin, die Zeit zu berücksichtigen, die für die Gewinnung und Etablierung einer Zuchtkolonie erforderlich ist, die je nach interessiertem Stamm variieren kann.

Für die Photostimulation haben wir den vom Shepherd Lab an der Northwestern University entwickelten Aufbau verwendet und angepasst, der in einem kürzlich erschienenen Protokollbeschrieben wurde 29. Obwohl dieser Aufbau für die Glutamat-Entkäfigung optimiert ist, ist er auch für die Photostimulation von Channelrhodopsin ohne Modifikation geeignet. Dieser Aufbau ermöglicht eine präzise räumliche Kontrolle und Positionierung der Loci der Photostimulation, was eine Beurteilung der funktionellen Topographie der Kanalrhodopsin-Innervation der aufgezeichneten Neuronen ermöglicht. Obwohl die räumliche Kontrolle durch dieses Verfahren der Photostimulation verbessert wird, ist es kostengünstiger als Verfahren, die eine LED-basierte Feldbeleuchtungverwenden 20. Darüber hinaus ist die Ungleichmäßigkeit des Hirngewebes eine Einschränkung der Optogenetik oder aller Techniken, die eine Manipulation des Lichts beinhalten. In der Praxis spielt dies jedoch selten eine Rolle, da die Ergebnisse meist qualitativ interpretiert werden. Falls ein quantitativer Vergleich zwischen den Gehirnregionen erforderlich ist, kann man immer die maximale Lichtintensität verwenden, um "gesättigte" Reaktionen zu erzielen.

Darüber hinaus haben wir sowohl Tidelwave- als auch Ephus-Softwareprogramme verwendet, die in Matlab geschrieben wurden, um die Laser-Scanning-Photostimulation und Datenerfassung zu steuern25,26. Es wird jedoch empfohlen, dass diejenigen, die ein ähnliches System einrichten, die neuere Ephus-Software26 verwenden, für die Unterstützung über die Entwicklungsseite30 von Janelia Farms verfügbar ist. Ein wichtiger Schritt ist die Entscheidung, welches dieser Softwarepakete verwendet werden soll, da sich ihre Hardwareanforderungen leicht unterscheiden. Darüber hinaus sind die Kartenanalyseprogramme auf die jeweiligen Datenerfassungsprogramme zugeschnitten.

Einige dieser Schritte können modifiziert werden, um sie an die spezielle Einrichtung des Praktizierenden anzupassen. Injektionen von viralen Lösungen können neben einer Spritze auch mit Verabreichungsmechanismen durchgeführt werden, z.B. funktionieren auch Kapillarglaspipetten, die auf Spitzendurchmesser von ~40 μm gezogen werden. Bei Operationen kann eine nichtstereotaktische Kopfhalterung ersetzt werden, wenn solche Koordinaten für die Führung der Injektionen nicht erforderlich sind. Darüber hinaus können ACSF- und intrazelluläre Lösungszusammensetzungen in Abhängigkeit von den besonderen experimentellen Anforderungen verändert werden, z. B. durch Substitution einer intrazellulären Cäsium- oder Intrazellularlösung mit hohem Chloridgehalt zur Isolierung von Hemmströmen. Eine Alternative zur Bildgebung von Expressionsmustern in festen Schichten kann auch in der lebenden Schicht auf einem geeigneten Bildgebungsrigg mit einem Badperfusionssystem durchgeführt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll den Behandler in die Lage versetzen wird, die funktionelle Topographie und synaptische Physiologie von Projektionen in vitro zu charakterisieren, was mit Standardmethoden, z. Charakterisierung von Langstreckenprojektionen, die nicht in einem Slice konserviert werden können. Das beschriebene Transfektionsprotokoll kann auf optogenetische In-vivo-Experimente 1-3,12,14 angewendet werden, da der Verabreichungsmechanismus derselbe ist. Obwohl dieses Protokoll die Transfektion von Mäusen beschreibt, können viele der verfügbaren viralen Vektoren verwendet werden, um diese Opsine theoretisch in einer Vielzahl von Säugetierarten zu transfizieren und zu exprimieren, was eine Vielzahl von vergleichenden und speziesspezifischen Studien ermöglicht1-3.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben. Der Autor (CCL) erhielt ein Publikationsstipendium von Leica Microsystems, das ein Instrument herstellt, das bei dieser Aufnahme dieses Protokolls verwendet wird.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH/NIDCD grant R03 DC 011361, SVM CORP grant LAV3202, NSF-LA EPSCoR grant PFUND86 und ein publication grant von Leica Microsystems (CCL) und NIH/NIDCD grant R01 DC 008794 (SMS).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PolybreneSanta Cruz BiotechSC134220
Paraformaldehyd 32% ige LösungEMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV virale KonstrukteUNC Vector CoreNA
Maus stereotaktische KopfhalterungStoelting51730
Nanocool InjektorHarvard Gerät703040
UV-Laser: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;DPSS Lasers, Inc3500
GalvonometerCambridge Scanning6210
SpiegelCambridge Scanning6m2003S-A
HalterungCambridge Scanning6102103L
KabelCambridge Scanning6010-19-120
Treiber/ControllerCambridge Scanning67121-1
Shutter - ZM beschichtet (UV-kompatibel)UniblitzL23-ZM2
Shutter ControllerUniblitzVMM-D1
StromverstärkerStanford Research SystemsSR570
6713 PlatineNational Instruments777741-01
2110 Break-Out-BoxNational Instruments777643-01
PCI-MIO-16E-4National Instruments777383-01
BNC-2090National Instruments777270-01
KabelNational Instruments184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems

Referenzen

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