Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

Summary

Die Erzeugung von Lymphknoten-/Fettpolster-Chimären zur Untersuchung des Ursprungs von Lymphknotenstromazellen wird beschrieben. Die Methode umfasst die Isolierung von Lymphknoten aus neugeborenen Mäusen und embryonalen Fettpolstern, die Erzeugung von chimären Lymphknoten-Fettpolstern und deren Übertragung unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus.

Abstract

Das Stroma ist eine Schlüsselkomponente der Lymphknotenstruktur und -funktion. Über seine Herkunft, die genaue zelluläre Zusammensetzung und die Mechanismen, die zu seiner Entstehung führen, ist jedoch wenig bekannt. Lymphknoten sind immer im Fettgewebe verkapselt, und wir haben kürzlich gezeigt, wie wichtig dieser Zusammenhang für die Bildung von Lymphknotenstroma ist. Adipozyten-Vorläuferzellen wandern während seiner Entwicklung in den Lymphknoten und schalten bei Aktivierung des Lymphotoxin-b-Rezeptors die Adipogenese aus und differenzieren sich zu lymphoiden Stromazellen (Bénézech et al.¹⁴). Basierend auf dem lymphoiden Stromapotenzial von Fettgewebe stellen wir eine Methode vor, die eine Lymphknoten-/Fettpolster-Chimäre verwendet, die es ermöglicht, die Abstammungslinie von Lymphknotenstromazellvorläufern zu verfolgen. Wir zeigen, wie man neugeborene Lymphknoten und EYFP⁺ embryonales Fettgewebe isoliert und eine LN/ EYFP⁺ Fettpolster-Chimäre herstellt. Nach dem Transfer unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus nimmt der Lymphknoten lokale Vorläuferzellen des Fettgewebes auf und schließt seine Bildung ab. Die Nachkommenanalyse von EYFP⁺-Fettpolsterzellen in den resultierenden Lymphknoten kann durch durchflusszytometrische Analyse enzymatisch verdauter Lymphknoten oder durch Immunfluoreszenzanalyse von Lymphknotenkryosektionen erfolgen. Durch die Verwendung von Fettpolstern aus verschiedenen Knockout-Mausmodellen bietet diese Methode eine effiziente Möglichkeit, die Herkunft der verschiedenen Lymphknotenstromazellpopulationen zu analysieren.

Introduction

Lymphknoten (LNs) sind Schlüsselorgane des Immunsystems, die sich an strategischen Stellen im Körper entlang des lymphatischen Gefäßsystems befinden. Sie ermöglichen die Filtration von Antigenen und Krankheitserregern und bieten einen Ort für die Antigenpräsentation bei Lymphozyten und die Induktion adaptiver Immunantworten. Das Stroma, das die Grundstruktur des LN bildet und die Bewegung der verschiedenen hämatopoetischen Teilnehmer der adaptiven Immunantwort orchestriert, ist für die Funktion dieser Organe von zentraler Bedeutung. Unterschiedliche Populationen von Stromazellen liefern essentielle und spezifische Hinweise für die Bewegungen, die Lokalisation, das Übe....

Protocol

Mäuse wurden in der Biomedical Service Unit an der Universität Birmingham gemäß den Vorschriften des britischen Innenministeriums und der lokalen Ethikkommission unter SPF-Bedingungen gezüchtet und gepflegt. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren fallen unter eine Projektlizenz, die sowohl von der lokalen Ethikkommission als auch vom Innenministerium genehmigt wurde.

1. Isolierung von Neugeborenen-LNs

1. Opfern Sie die neugeborenen Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation.
2. Teilen Sie den Kopf ab und öffnen Sie den Körper mit einer Schere von der Oberseite der Brustregion bis zur Unterseite der Bauchregion und entfern....

Results

Drei Wochen nach der Transplantation wird die LN/Fettpolster-Chimäre aus der Niere gewonnen. Die Chimäre ist nun einem normalen LN in seinem eigenen Fettpolster sehr ähnlich, und der LN ist in der Mitte des Fettgewebes sichtbar (Abbildung 1). Wenn die LN nicht identifiziert werden kann, ist es möglich, dass sie bei der Transplantation an der Niere verloren gegangen ist. Bei der Bewertung der Rolle von Genen, die für die LN-Entwicklung potenziell wichtig sind, können die gewonnenen LNs sehr klein und schw.......

Discussion

In diesem Artikel haben wir eine Methode vorgestellt, um den Beitrag von Fettgewebe-Vorläuferzellen zu den sich entwickelnden LNs zu testen und zu quantifizieren, sowie zwei Techniken, die die Analyse ihrer Nachkommen ermöglichen. Die Dissektion von embryonalen Fettpolstern und Neugeborenen LNs sind heikel und erfordern manuelle Fähigkeiten, die durch viel Übung vor der Erzeugung der eigentlichen LN-Fettpolster-Chimäre erworben wurden. Um die Qualität der Dissektionen zu kontrollieren, kann eine durchflusszytometrische A.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petrischale	Appleton Woods	SC265
90 mm Sterilin Petrischale	Appleton Woods	SC260
Selbstklebende Objektträger	Surgipath	00202
Anti-Maus CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-Maus CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-Maus CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-Maus IgM Rhodamin Rot	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-Maus Podoplanin PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-Maus Podoplanin gereinigt	eBioscience	14-5381
Kollagenase D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Pinzette Inox Biologie	FST	11252-20	Extrafeine Pinzette für Embryonal- und Neugeborenendissektionen
EDTA-Lösung 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Fötales Rinderserum	Sigma	F9665
Gehärtete Feinirisschere gerade 11 cm	FST	14090-11	Kleine Schere zum Sezieren
HEPES Lösung	Sigma	H0887
Isoporen-Membranfilter 0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutaminlösung	Sigma	G7513
MEM Nonessential Amino Acid Solution (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4458
Kunststoffbox mit Deckel	Watkins und Doncaster	E6052	Sandwich-Box für in vitro Organkulturen. Bohren Sie zwei Löcher in den Deckel, um den Gasaustausch im CO2-Inkubator zu ermöglichen.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Schwämme Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomikroskop	Leica	LEICA MZ95	Präpariermikroskop mit Zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200