Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

Zusammenfassung

Die Erzeugung von Lymphknoten-/Fettpolster-Chimären zur Untersuchung des Ursprungs von Lymphknotenstromazellen wird beschrieben. Die Methode umfasst die Isolierung von Lymphknoten aus neugeborenen Mäusen und embryonalen Fettpolstern, die Erzeugung von chimären Lymphknoten-Fettpolstern und deren Übertragung unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus.

Zusammenfassung

Das Stroma ist eine Schlüsselkomponente der Lymphknotenstruktur und -funktion. Über seine Herkunft, die genaue zelluläre Zusammensetzung und die Mechanismen, die zu seiner Entstehung führen, ist jedoch wenig bekannt. Lymphknoten sind immer im Fettgewebe verkapselt, und wir haben kürzlich gezeigt, wie wichtig dieser Zusammenhang für die Bildung von Lymphknotenstroma ist. Adipozyten-Vorläuferzellen wandern während seiner Entwicklung in den Lymphknoten und schalten bei Aktivierung des Lymphotoxin-b-Rezeptors die Adipogenese aus und differenzieren sich zu lymphoiden Stromazellen (Bénézech et al.¹⁴). Basierend auf dem lymphoiden Stromapotenzial von Fettgewebe stellen wir eine Methode vor, die eine Lymphknoten-/Fettpolster-Chimäre verwendet, die es ermöglicht, die Abstammungslinie von Lymphknotenstromazellvorläufern zu verfolgen. Wir zeigen, wie man neugeborene Lymphknoten und EYFP⁺ embryonales Fettgewebe isoliert und eine LN/ EYFP⁺ Fettpolster-Chimäre herstellt. Nach dem Transfer unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus nimmt der Lymphknoten lokale Vorläuferzellen des Fettgewebes auf und schließt seine Bildung ab. Die Nachkommenanalyse von EYFP⁺-Fettpolsterzellen in den resultierenden Lymphknoten kann durch durchflusszytometrische Analyse enzymatisch verdauter Lymphknoten oder durch Immunfluoreszenzanalyse von Lymphknotenkryosektionen erfolgen. Durch die Verwendung von Fettpolstern aus verschiedenen Knockout-Mausmodellen bietet diese Methode eine effiziente Möglichkeit, die Herkunft der verschiedenen Lymphknotenstromazellpopulationen zu analysieren.

Einleitung

Lymphknoten (LNs) sind Schlüsselorgane des Immunsystems, die sich an strategischen Stellen im Körper entlang des lymphatischen Gefäßsystems befinden. Sie ermöglichen die Filtration von Antigenen und Krankheitserregern und bieten einen Ort für die Antigenpräsentation bei Lymphozyten und die Induktion adaptiver Immunantworten. Das Stroma, das die Grundstruktur des LN bildet und die Bewegung der verschiedenen hämatopoetischen Teilnehmer der adaptiven Immunantwort orchestriert, ist für die Funktion dieser Organe von zentraler Bedeutung. Unterschiedliche Populationen von Stromazellen liefern essentielle und spezifische Hinweise für die Bewegungen, die Lokalisation, das Überleben, die Proliferation und die Reifung der hämatopoetischen Komponente des Immunsystems^1-3. Adulte LN-Stromazellen lassen sich in drei Kategorien einteilen: die Blutendothelzellen, die lymphatischen Endothelzellen und die Fibroblasten. Diese drei Kategorien umfassen heterogene Populationen. Die fibroblastischen Populationen enthalten fibroblastische retikuläre Zellen (FRC), follikuläre dendritische Zellen (FDC), marginale retikuläre Zellen (MRC), während die Fibroblasten, die die Kapsel bilden, die Medulla und andere Zellen, die noch nicht identifiziert wurden^1-5. Die Ursprünge und die Mechanismen, die die Reifung der verschiedenen LN-Stromazellpopulationen steuern, sind unklar, und das Fehlen spezifischer Marker, die eine Kartierung des Verbleibs spezifischer LN-Stromazellpopulationen ermöglichen, macht ihre Untersuchung besonders schwierig. Ein vollständiges Verständnis der Ontogenese von LN-Stromazellen ist jedoch notwendig, um die adaptiven Immunantworten zu verstehen, die Mechanismen, die zur Toleranz beitragen, und ist die Grundlage für die Entwicklung künstlicher LNs.

Bisher beschränkte sich die Untersuchung des Ursprungs und der Entwicklung von LN-Stromazellen hauptsächlich auf die direkte Beurteilung der LN-Entwicklung in Embryonen und Neugeborenen in Wildtyp-Mäusen und verschiedenen Knockout-Mausstämmen^6-9. Diese Ansätze sind durch die embryonale und perinatale Letalität einiger Mausstämme begrenzt, die Deletionen in Genen tragen, die für die LN-Entwicklung wichtig sind. Darüber hinaus sind einige der Gene, die für die Entwicklung des lymphatischen Gewebes essentiell sind, auch an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt, wie es bei RANK^10-11 oder NF-κB2¹² der Fall ist. Um diese Probleme zu lösen, wurden die Isolierung und Transplantation von embryonalen LNs unter der Nierenkapsel einer Wirtsmaus durchgeführt^12-13. Diese Technik ermöglicht beispielsweise den Transfer von genetisch veränderten embryonalen LNs in einer Wildtyp-Umgebung, um die Organentwicklung sowie die Rekrutierung und Organisation von Wirtszellen zu beurteilen. Das Wachstum von embryonalem LN, das unter die Nierenkapsel eines adulten Wirts transplantiert wurde, ist jedoch beeinträchtigt, wodurch die Anwendung dieser Technik eingeschränkt wird.

LNs und Fettdepots sind anatomisch eng miteinander verbunden und entwickeln sich gleichzeitig während der Embryogenese. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Assoziation LN/Fettgewebe eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Stromazellvorläuferzellen für die LNs spielt. Insbesondere steuert die Signalübertragung über den LTβR das Schicksal von Adipozyten-Vorläuferzellen, indem sie die Adipogenese blockiert und stattdessen die Reifung in Richtung eines LN-Stromazell-Phänotyps^{fördert 14}. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf der Generierung von LN-Fettpad-Chimären basiert und die Verfolgung von Zellen aus Fettgewebe im sich entwickelnden LN ermöglicht. Diese Methode wird nützlich sein, um den Beitrag von Fettgewebe zu verschiedenen LN-Stromazellpopulationen zu bestimmen und in Kombination mit der Verwendung von Geweben aus genetisch veränderten Mausstämmen ein besseres Verständnis der Mechanismen ermöglichen, die die Differenzierung der verschiedenen LN-Stromazell-Untergruppen steuern.

Protokoll

Mäuse wurden in der Biomedical Service Unit an der Universität Birmingham gemäß den Vorschriften des britischen Innenministeriums und der lokalen Ethikkommission unter SPF-Bedingungen gezüchtet und gepflegt. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren fallen unter eine Projektlizenz, die sowohl von der lokalen Ethikkommission als auch vom Innenministerium genehmigt wurde.

1. Isolierung von Neugeborenen-LNs

1. Opfern Sie die neugeborenen Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation.
2. Teilen Sie den Kopf ab und öffnen Sie den Körper mit einer Schere von der Oberseite der Brustregion bis zur Unterseite der Bauchregion und entfernen Sie vorsichtig alle Eingeweide (Herz, Lunge, Leber, Darm, Niere, Blase) aus der Bauchhöhle.
3. Übertragen Sie den Körper in eine 90-mm-Petrischale, die RF10-Medien enthält (RPMI1640 Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt wurde). Ab diesem Schritt werden die Gewebe unter sterilen Bedingungen aufbewahrt und in einer Gewebekulturhaube gehandhabt.
4. Übertragen Sie den Körper in eine neue 90-mm-Petrischale, die RF10 enthält.
5. Unter dem Präpariermikroskop lösen Sie vorsichtig das Bauchfell von der Haut in der Leistenregion. Die leistenale LN befindet sich am Schnittpunkt von drei Blutgefäßen im Fettpolster.
6. Entfernen Sie vorsichtig den LN. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Fettgewebe entfernt wird. Übertragen Sie den LN in eine 50-mm-Petrischale, die RF10-Medien enthält. Halten Sie das Taschentuch auf Eis, während Sie mit dem Eingriff fortfahren.

2. Isolierung von E18.5 Fettpolstern

1. Um Mausembryonen am Tag 18.5 der Trächtigkeit (E18.5) zu erzeugen, richten Sie zeitgesteuerte Schwangerschaften ein, indem Sie eine weibliche und eine männliche Maus pro Käfig über Nacht einsetzen. Trennen Sie die Mäuse morgens und prüfen Sie, ob sich Scheidenstopfen befinden (Schwangerschaftstag E0,5).
   1. Euthanasieren Sie die verstopften Weibchen am 18.5. Tag der Trächtigkeit durch Zervixluxation.
   2. Entnehmen Sie die Embryonen und legen Sie sie in eine 90 mm Petrischale, die RF10 enthält.
2. Ab diesem Schritt sollten die Gewebe in der Gewebekulturhaube steril behandelt werden. Unter dem Präpariermikroskop wird der Kopf abgetrennt, die Embryonen mit einer Schere vom Brustbereich bis zum unteren Rand der Bauchregion geöffnet und vorsichtig alle Eingeweide (Herz, Lunge, Leber, Darm, Niere, Blase) aus der Körperhöhle entfernt.
3. Reinigen Sie den Körper von allen verbleibenden viszeralen Geweben und waschen Sie ihn in PBS, um alle Blutspuren zu beseitigen, die die Dissektion erschweren könnten.
4. Übertragen Sie die sauberen Körper in eine frische 90-mm-Petrischale, die RF10 enthält.
5. Löse vorsichtig das Bauchfell im Leistenbereich von der Haut. Die leistenale LN befindet sich am Schnittpunkt von drei Blutgefäßen im Fettpolster.
6. Entfernen Sie den LN vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Es ist sehr wichtig, das LN vollständig zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Fettpolster, das für die Chimären verwendet wird, nicht durch lymphoide Stromazellen kontaminiert ist.
7. Entfernen Sie das Leistenfettpolster und geben Sie es in eine 50 mm Petrischale mit RF10-Medium. Halten Sie das Taschentuch auf Eis, während Sie mit dem Eingriff fortfahren.

3. Erzeugung der LN-Fett-Pad-Chimäre

1. Bereiten Sie das In-vitro-Organkultursystem ¹⁵ vor.
   1. Schwamm- und Filtervorbereitung: Dies kann im Voraus erfolgen und Schwämme und Filter steril in einer Petrischale in der Kulturhaube lagern.
      1. Schneiden Sie das Vulkan Underwrap in 1-1,5 cm² Stücke
      2. Die Schwämme 2 Std. in destilliertem Wasser kochen.
      3. Lassen Sie die Schwämme einige Stunden in der Zellkulturhaube trocknen.
      4. Kochen Sie die Filter 20 Minuten lang.
      5. Lassen Sie die Filter einige Stunden in der Zellkulturhaube trocknen.
   2. Bereiten Sie DMEM-Medien vor, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 10 mM HEPES, 1x MEM Nonessential Amino Acid Solution, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
   3. Geben Sie 2 ml Medium in eine 50 mm Petrischale.
   4. Lege einen Biskuit auf den Boden der Petrischale. Befeuchten Sie beide Seiten des Schwamms, indem Sie sie in das Medium tauchen.
   5. Lege einen Filter auf den Schwamm. Der Filter befindet sich an der Flüssig-Luft-Grenzfläche.
2. Unter dem Präpariermikroskop wird ein neugeborenes LN vorsichtig wieder mit einem embryonalen Fettpolster verknüpft.
3. Platzieren Sie die LN-Fettpad-Chimäre auf dem Filter.
4. Übertragen Sie die Petrischale in eine rechteckige Plastikbox mit ein paar Löchern am Deckel und Wasser am Boden, um die Feuchtigkeit zu gewährleisten.
5. Verschließen Sie den Deckel der Box mit Klebeband. Lassen Sie die beiden Löcher im Deckel offen.
6. Überführen Sie die Box in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂. Lassen Sie die Box 2 Stunden lang äquilibrieren, bevor Sie die Löcher im Deckel mit Klebeband verschließen.
7. Inkubieren Sie das Gewebe mindestens 2 Tage lang, damit sich das LN an das Fettpolster anheften und unter die Nierenkapsel übertragen werden kann.

4. Übertragung der LN-Fett-Pad-Chimäre unter die Nierenkapsel von Wirtsmäusen

1. Sammeln Sie die LN-Fett-Pad-Chimären aus dem Filter und geben Sie sie unter die Nierenkapsel der Wirtsmäuse. Die Methode des Nierenkapseltransfers wurde bereits beschrieben ¹⁶.

5. Isolierung der übertragenen LNs

1. Nach 3-4 Wochen unter der Nierenkapsel sind die LN-Fettpolster Chimären bereit für die Ernte. Euthanasieren Sie die Wirtsmäuse unter Verwendung der genehmigten Anleitung.
2. Entferne die Niere von den Wirtsmäusen.
3. Isolieren Sie unter dem Präpariermikroskop die LN-Fettpad-Chimäre und präparieren Sie das LN.

6. Enzymatischer Verdau der übertragenen LNs für die durchflusszytometrische Analyse

1. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen Schnitt in das LN, damit die Enzyme in das Organ eindringen und die Verdauung erleichtern können.
2. Geben Sie einen LN in 1,5 ml Eppendorf mit 600 μl Aufschlusspuffer (RPMI 1 % FCS, 2,5 mg/ml Kollagenase D, 100 μg/ml DNase I).
3. 30 min bei 37 °C auf einem Rühr-Thermoblock inkubieren. Pipettieren Sie alle 10 Minuten auf und ab, um die Dissoziation des Gewebes zu unterstützen.
4. Geben Sie 6 μl EDTA 0,5 M in das Röhrchen und pipettieren Sie auf und ab, um die Dissoziation des Gewebes zu beenden.
5. 5 min bei 490 x g zentrifugieren.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der Färbelösung (PBS, 0,1 % BSA, 5 % Rattenserum und 5 % Mausserum), die die Kombination von Primärantikörpern enthält.
7. 30 min auf Eis inkubieren.
8. Zweimal in PBS waschen
9. Bei Bedarf 20 min mit Sekundärantikörpern inkubieren.
10. 2x in PBS waschen.
11. Analyse auf einem Durchflusszytometer.

7. Analyse der übertragenen LNs durch Immunfluoreszenz

1. Fixierung für die EYFP-Konservierung während des Gefrier- und Kryosektionsprozesses: Geben Sie das LN in eine Lösung aus PBS, 4 % PFA und 10 % Saccharose und lassen Sie es 3-4 Stunden einwirken.
2. Geben Sie einen einzelnen kleinen Tropfen kalte O.C.T.-Masse auf ein kleines Stück Aluminiumfolie. Vermeiden Sie Luftblasen. Legen Sie den LN vorsichtig ohne Flüssigkeit in die Mitte des Tropfens.
3. Frieren Sie das Organ ein, indem Sie die Alufolie auf Trockeneis legen.
4. Schneiden Sie 8-10 μm Abschnitte mit einem Kryostaten auf zusätzliche selbstklebende Glasobjektträger. Lassen Sie die Objektträger 2 Stunden trocknen, bevor Sie sie bei -20 °C lagern.
5. Die Färbeverfahren können je nach verwendetem Primärantikörper variieren und können anhand des folgenden Protokolls optimiert werden. Die Schnitte werden mit einer Färbelösung (PBS, 1 % BSA) gefärbt, die die Kombination von Primärantikörpern enthält.
6. 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
7. Zweimal 5 Minuten in PBS waschen
8. Inkubieren Sie 1 Stunde lang mit Sekundärantikörpern.
9. Zweimal 5 Min. in PBS waschen.
10. Einbinden von Folien in Einhängemedien, die DAPI enthalten.
11. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop auf.

Ergebnisse

Drei Wochen nach der Transplantation wird die LN/Fettpolster-Chimäre aus der Niere gewonnen. Die Chimäre ist nun einem normalen LN in seinem eigenen Fettpolster sehr ähnlich, und der LN ist in der Mitte des Fettgewebes sichtbar (Abbildung 1). Wenn die LN nicht identifiziert werden kann, ist es möglich, dass sie bei der Transplantation an der Niere verloren gegangen ist. Bei der Bewertung der Rolle von Genen, die für die LN-Entwicklung potenziell wichtig sind, können die gewonnenen LNs sehr klein und schw...

Diskussion

In diesem Artikel haben wir eine Methode vorgestellt, um den Beitrag von Fettgewebe-Vorläuferzellen zu den sich entwickelnden LNs zu testen und zu quantifizieren, sowie zwei Techniken, die die Analyse ihrer Nachkommen ermöglichen. Die Dissektion von embryonalen Fettpolstern und Neugeborenen LNs sind heikel und erfordern manuelle Fähigkeiten, die durch viel Übung vor der Erzeugung der eigentlichen LN-Fettpolster-Chimäre erworben wurden. Um die Qualität der Dissektionen zu kontrollieren, kann eine durchflusszytometrische A...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petrischale	Appleton Woods	SC265
90 mm Sterilin Petrischale	Appleton Woods	SC260
Selbstklebende Objektträger	Surgipath	00202
Anti-Maus CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-Maus CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-Maus CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-Maus IgM Rhodamin Rot	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-Maus Podoplanin PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-Maus Podoplanin gereinigt	eBioscience	14-5381
Kollagenase D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Pinzette Inox Biologie	FST	11252-20	Extrafeine Pinzette für Embryonal- und Neugeborenendissektionen
EDTA-Lösung 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Fötales Rinderserum	Sigma	F9665
Gehärtete Feinirisschere gerade 11 cm	FST	14090-11	Kleine Schere zum Sezieren
HEPES Lösung	Sigma	H0887
Isoporen-Membranfilter 0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutaminlösung	Sigma	G7513
MEM Nonessential Amino Acid Solution (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4458
Kunststoffbox mit Deckel	Watkins und Doncaster	E6052	Sandwich-Box für in vitro Organkulturen. Bohren Sie zwei Löcher in den Deckel, um den Gasaustausch im CO2-Inkubator zu ermöglichen.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Schwämme Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomikroskop	Leica	LEICA MZ95	Präpariermikroskop mit Zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200