Mammalian Zellen, die das bakterielle Biolumineszenz Genkassette ( Lux) Erzeugen Licht autonom. Die resultierenden Biolumineszenz Dynamik bei Exposition gegenüber chemischen Stoffen haben nachgewiesen, dass die Behandlung Auswirkungen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel zu reflektieren, so dass diese Zellen eine kostengünstige, kontinuierliche, Echtzeit-Toxizität Screening-Tool, das leicht für High-Throughput-Automatisierung angepasst werden kann.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Säugetier-Zell-basierten in vitro-Assays wurden weithin als Alternativen zu Tierversuchen für toxikologische Studien eingesetzt wurden dann aber wegen der hohen Geld-und Zeit Kosten parallel Probenvorbereitung, die aufgrund der destruktiven Natur der Glühwürmchen-Luciferase-basierte Screening-Verfahren notwendig sind begrenzt . Dieses Video beschreibt die Verwendung von autonom Biolumineszenz Säugerzellen, die keine die destruktive Addition eines Luciferinsubstrat als kostengünstige und einfache Methode zur Überwachung der zytotoxischen Wirkung einer Verbindung von Interesse. Säugerzellen stabil exprimieren, die vollständige Bakterien Biolumineszenz (luxCDABEfrp) Genkassette autonom erzeugt ein optisches Signal, das Peaks bei 490 nm ohne Zusatz eines teuren und möglicherweise störende Luciferinsubstrat, Anregung durch eine externe Energiequelle oder Zerstörung der Probe, die traditionell durchgeführt während der optischen Bildgebungsverfahrens. Diese Unabhängigkeit von externer Stimulation stellt die Belastung für die Aufrechterhaltung der Biolumineszenz-Reaktion lediglich auf der Zelle, so dass das resultierende Signal nur während des aktiven Metabolismus detektiert. Diese Eigenschaft macht das lux-exprimierenden Zelllinie ein ausgezeichneter Kandidat für die Verwendung als biosentinel gegen zytotoxische Effekte, da Änderungen in Biolumineszenz Produktion anzeigt nachteilige Auswirkungen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel sind. Ebenso ermöglicht die autonome Natur und der Mangel an erforderlichen Probe Zerstörung wiederholte Abbildung der gleichen Probe in Echtzeit während der gesamten Giftstoff Belichtung und können über mehrere Proben in einem der vorhandenen bildgebende Geräte in einer automatisierten Weise durchgeführt werden.
Einleitung
In den USA benötigen Arzneimittel und andere Produkte für den menschlichen Verzehr bestimmt sind umfangreiche Einschätzung, bevor sie für den Verbraucher von der Food and Drug Administration genehmigt werden. Die finanzielle Belastung für die Durchführung dieser Tests auf den Entwickler 1, das im Wesentlichen die Kosten für neue Verbindung Entwicklung und somit führt zu erhöhten Kosten für den Verbraucher gegeben. Während traditionell viel von dieser Screening tierischen Patienten genutzt hat, um als Stellvertreter für den menschlichen Gastgeber fungieren, hat sich diese zu einer großen finanziellen Belastung werden, mit einem geschätzten $ 2800000000 jährlich aufgewendet auf ADME / Tox (Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und Toxizität ) Screening allein 2 und Montage Hinweise darauf, dass Tiermodellen nicht verlässlich vorhersagen humantoxikologischen Antworten 3. Daher wurde in vitro menschliche Zellkultur-basierten Tests Popularität in den letzten zwei Jahrzehnten wegen seiner relativ niedrigen gewonnenKosten, höheren Durchsatz und eine bessere Darstellung von menschlichen Bioverfügbarkeit und Toxikologie 4. Aktuelle Zellkultur-basierte Screening-Methoden beschäftigen Toxizität verschiedenen Endpunkten, wie die Messung der ATP-Spiegel, das Screening der Aktivität von endogen verfügbar zytoplasmatischen Enzyme, die Erforschung der Integrität der Zellmembran, oder die Verfolgung der Ebene der mitochondrialen Aktivität, zu evaluieren zellulären Lebensfähigkeit 5 , 6. Unabhängig von dem Endpunkt gewählt alle diese Verfahren erfordern die Zerstörung der Probe vor der Messung entnommen werden, wodurch nur Erzeugen von Daten in einem einzigen Zeitpunkt. Als Folge müssen eine große Anzahl von Proben vorbereitet zu sein und behandelt parallel zur grundlegenden toxikologischen Studien Kinetik, erneute Zugabe zu den Kosten und Arbeit für neue Verbindung Entwicklung erforderlich. Alternativ Assays mit Luziferase wie Gaussia Luciferase 7, Vargula Luciferase 8 und 9 Metridia Luciferase abgesondertentwickelt worden, die die Beseitigung der Notwendigkeit zur Zelllyse und einen Bruchteil der Medien für die Endpunktbestimmung, werden diese jedoch noch Abtastung zu vorbestimmten Zeitpunkten beschränkt und erfordern die Zugabe von exogenen lichtaktivierenden Substraten.
Um den Nachteil der erforderlichen Probe Zerstörung sowie die Kosten für die Beseitigung Substrate zu vermeiden, wurde eine menschliche Zelllinie entwickelt, dass drückt die volle bakterielle Biolumineszenz (lux) Gen-Kassette (luxCDABEfrp), die für die kontinuierliche Überwachung von lebenden Zellen, die ähnlich ist zu ermöglichen fluoreszierende Farbstoff-basierte Live Cell Imaging, aber ohne die zusätzlichen Photon-aktivierenden und mikroskopische Untersuchungsverfahren. Diese Zelllinie kann konstitutiv Erzeugen eines optischen Signals zur kontinuierlichen, direkten Nachweis ohne äußere Stimulation, wodurch die Zerstörung der Probe. Mechanistisch führen die Biolumineszenz-Signal aus diesen Zellen erzeugts, wenn die luxAB gebildete Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation einer langkettigen Fettsäure Aldehyd (synthetisiert und von den luxCDE Genprodukte mit endogenen Substraten regeneriert) in Gegenwart von reduziertem Riboflavinphosphat (FMNH 2, die von FMN durch die FRP-Gens zurückgeführt Produkt) und molekularem Sauerstoff 10. Expression des lux-Kassette in der Wirtszelle ermöglicht somit Licht erzeugt und detektiert werden, ohne Zellzerstörung oder exogene Substratzugabe. Ebenso stellt die Interaktion zwischen den Genen und der lux endogen verfügbar FMN und O 2 Cosubstrate, und der Forderung nach Aufrechterhaltung einer Umgebung, die die Umwandlung von FMN zu FMNH 2 unterstützen kann, dass die resultierende Biolumineszenz-Signal kann nur von lebenden nachgewiesen werden , metabolisch aktiven Zellen.
Diese Anforderungen wurden bisher ausgenutzt werden, um die lux-bas demonstrierened bioluminescent Ausgang korreliert stark mit zellulären Bevölkerung Größe 11 und dieser toxischen Verbindung Exposition beeinträchtigt autobioluminescent Produktion in einer Dosis-Wirkungs-weise 12. Wir verwenden hier eine bisher dadurch autobioluminescent humane embryonale Nierenzellen (HEK293)-Zelle 11 an die automatisierte toxikologischen Screening eines Antibiotikums aus der Bleomycin Familie mit bekannten DNA-schädigenden Aktivität als ein repräsentatives Beispiel der Anwendung von autobioluminescent Säugetierzellen zur Toxizität validieren demonstrieren.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Zellpräparation
- Recover ein Fläschchen bioluminescent HEK293 Zellen aus flüssigem Stickstoff gefroren Lager und wachsen sie in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 0,01 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 1x Antibiotikum-Antimykotikum und 0,01 mM Natriumpyruvat in einem T 75 Zellkulturflasche bei 37 ° C und 5% CO 2.
Hinweis: Die Medien und ergänzende Komponenten auf Zelllinien variieren und sollte daher entsprechend gewählt werden. - Aktualisieren Medium alle 2-3 Tage bis zum Erreichen ~ 80% Konfluenz.
Hinweis: Die Anzahl der Zellen benötigt wird auf dem experimentellen Design basieren. Bei Bedarf können weitere Zellen durch Subkultivierung erhalten werden. - Ernten Sie die Zellen für die Prüfung.
- Entfernen Sie das Medium und die Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch vorsichtiges Schwenken des Kolbens und dann Verwerfen des PBS verbracht.
- In Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 2 min,oder bis die Zellen vom Kolben abgelöst.
- Sammeln Sie die abgelösten Zellen in PBS und übertragen sie in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
Hinweis: Wenn nonadherent Zelllinien, separate Zellen durch Zentrifugation verwendet und einmal mit PBS waschen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämazytometer oder andere Zelle Zählsystem.
- Zentrifuge die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min. Überstand verwerfen und die Zellen in frischem, vorgewärmten Medium.
- Seed gleiche Anzahl von Zellen in einzelnen Vertiefungen einer opaken Multi-Well-Platte. In diesem Beispiel Platte 5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 1 ml pro Vertiefung in eine schwarze 24-Well-Platte. Platte ein gleiches Volumen des Mediums in drei Vertiefungen, die als negative Kontrolle dienen.
Hinweis: Die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung beschichtet ist flexibel und kann bei einzelnen Versuchen optimiert werden. Für jede Zelllinie Biolumineszenz, experimentell die Beziehung zwischen Zellzahl und bioluminescent Ausgang, sowie die minimal nachweisbare Zelle vor allen Prüfungen der Toxizität zählen. Um diese, messen Biolumineszenz in einem breiten Spektrum von Bevölkerung Größen (z. B. 1 × 10 3 bis 1 x 10 6 Zellen) tun unter standardisierten Bedingungen Bildgebung. - Gönnen Zellen mit Tests Verbindung (en), wie unten beschrieben.
2. Chemische Vorbereitung
- Bereiten Sie die Chemikalie als konzentrierte Stammlösung getestet. In diesem Beispiel verwenden Sie eine 100 mg / ml Stammlösung eines Antibiotikums der Bleomycin Familie.
Hinweis: Um potenzielle Fahrzeug basierte toxischen Effekte zu minimieren, vor allem, wenn ein organisches Lösungsmittel als Vehikel für chemische Zusatz verwendet wird, empfiehlt es sich, dass die Aktie Konzentration mindestens 1.000 Mal die gewünschte Anwendung post-Konzentration sein. - In den vorbereiteten chemischen Aktien direkt zu den Zellen. In diesem Beispiel Dosis des Antibiotikums von Interesse in Endkonzentrationen von 100, 200, 300 und 400 pg / ml in triverkomplizieren Brunnen. Lassen Sie drei Brunnen von Zellen unbehandelt als Kontrollen.
Hinweis: Die Endkonzentration des Zielchemikalie sollte auf spezielle experimentelle Ziele ausgewählt werden. Eine breite Palette von Konzentrationen getestet, um normalerweise das volle Spektrum der toxischen Effekte zu erzielen.
3. Imaging und Data Analysis
- Unmittelbar nach Anlagerung wird die Platte in der Imaging-Kammer geeignete Instrument für die Bildaufnahme und Biolumineszenz-Messung.
- Measure Biolumineszenz alle 15 min über einen Zeitraum von 24 Std. mit einem 10 min Integrationszeit für jede Lesung.
Hinweis: Die Integrationszeit in diesem Beispiel verwendet wird, ist auf einer Pro-Platte zur Verfügung und können für die Messung auf einer pro-und Basis mit anderen Luminometer der Wahl eingestellt werden. Die Integrationszeit kann auch basierend auf der gewählten Biolumineszenz-Zelllinie eingestellt werden. Weil Biolumineszenz autonom ohne Zell-Zerstörung oder externe Stimulation erzeugt, gelesengen kann an jeder beliebigen Zeitpunkt gemacht werden, um bestimmte Ziele zu erfüllen experimentellen. - Quantifizierung der Biolumineszenz Intensität aus jeder Vertiefung durch die Identifizierung eines Bereichs von Interesse mit kompatibler Software. Anzeige der Lichtleistung entweder als Gesamtfluß (Photonen / Sekunde) oder der durchschnittlichen Strahlung (Photonen / Sekunde / cm 2 / steridian) jeder Probe.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In dieser Studie wurden die Dynamik autobioluminescent HEK293 Zellen kontinuierlich über einen Zeitraum von 24 Std. in Reaktion auf die Antibiotika Exposition (Abbildung 1) überwacht. Die toxischen Wirkungen dieses Antibiotikums, die ein Mitglied der Familie bekannt, Bleomycin lebenden Zellen durch Bindung an DNA und spalten 13 töten ist, wurden über eine Abnahme der Biolumineszenz-Produktion im Vergleich zu unbehandelten Zellen, die direkt visualisiert werden können durch die Pseudocolor Bil...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses Verfahren zeigt die Verwendung von autonom Biolumineszenz Säugerzellen als ein in vitro-Zytotoxizität Screening-Assay, der lebende Zellen kontinuierlich über ihre Lebensdauer verfolgt werden kann. Dieses Protokoll ist flexibel und kann modifiziert werden, um spezielle experimentelle Bedingungen aufzunehmen, wie erforderlich. So stellte das Experiment hier eignet sich für die Verfolgung von akuten toxischen Wirkungen, kann aber angepasst träge oder langfristigen Auswirkungen durch wiederholtes Bildgebung ...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
DM Close, SA Ripp, und GS Sayler sind Gründer und Inhaber von 490 BioTech, Inc.
Danksagungen
Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation Division of Chemical, Bioengineering, Umwelt und Transport (CBET) Systeme unter award Zahlen CBET-0853780 und CBET-1159344 und die National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt unter Verleihungsnummer 1R43ES022567-01, und dem National Cancer Institute, Cancer Imaging Program unter Verleihungsnummer CA127745-01. Die Lumina IVIS Instrument in dieser Arbeit verwendet wurde, von der US Army Defense University Research Instrumentation Programm erhalten.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Andere IVIS-Modelle und PMT-basierte Plattenleser können ebenfalls verwendet werden | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Neuere Updates dieser Software sind verfügbar | |
| 75 cm2 mit Zellkulturen behandelte Kolben | Corning | 430641 | |
| 6-Well-Platten mit Gewebekultur | behandelt Costar | 07-200-83 | |
| Schwarze 24-Well-Platte | Greiner Bio-One | 662174 | 96- oder 384-Well-Platten können für Anwendungen mit höherem Durchsatz verwendet werden |
| : Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenolrotfreies | Hyclone | SH30284 | |
| fötales Rinderserum | Hyclone | SH3091003 | |
| nichtessentielle Aminosäuren, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotikum, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Natriumpyruvat, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0,05% | Life Technologies | 25300062 |
Referenzen
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441(2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
