Methodenartikel

Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus Gewebe der fleischfressenden Pflanze Nepenthes

4.4K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/50993

⸱

22. Dezember 2013

 ,  ,  , 
1Laboratoire Agronomie et Environnement, Université de Lorraine, 2Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3aura optik

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Pflanzendrüsen sind spezialisierte Strukturen, die für die Biosynthese und Sekretion vieler Verbindungen verantwortlich sind, die an Wechselwirkungen mit der biotischen Umwelt beteiligt sind. Um Untersuchungen zu ihren molekularen und biochemischen Eigenschaften zu ermöglichen, wurde eine mechanische Mikropräparationstechnik etabliert, um einzelne stoffwechselaktive Drüsen, hier aus der fleischfressenden Pflanze Nepenthes, zu isolieren.

Zusammenfassung

Viele Pflanzen besitzen spezialisierte Strukturen, die an der Produktion und Sekretion von spezifischen niedermolekularen Verbindungen und Proteinen beteiligt sind. Diese Strukturen sind fast immer auf Pflanzenoberflächen lokalisiert. Darunter befinden sich Nektarien oder Drüsentrichome. Die sezernierten Verbindungen werden häufig in Wechselwirkungen mit der biotischen Umwelt eingesetzt, zum Beispiel als Lockstoffe für Bestäuber oder zur Abschreckung von Pflanzenfressern.

Drüsen, die in mehreren Aspekten einzigartig sind, finden sich in fleischfressenden Pflanzen. Bei sogenannten Kannenpflanzen der Gattung Nepenthes scheiden bifunktionale Drüsen im Inneren der Fallgrube einerseits die Verdauungsflüssigkeit einschließlich aller für die Beuteverdauung notwendigen Enzyme aus und nehmen andererseits die freigesetzten Nährstoffe auf. Somit stellen diese Drüsen ein ideales, spezialisiertes Gewebe dar, das prädestiniert ist, die zugrunde liegenden molekularen, biochemischen und physiologischen Mechanismen der Proteinsekretion und Nährstoffaufnahme in Pflanzen zu untersuchen. Darüber hinaus könnte generell die Biosynthese von Sekundärverbindungen, die von vielen Pflanzen produziert werden, die mit Drüsenstrukturen ausgestattet sind, direkt in Drüsen untersucht werden.

Um an solchen spezialisierten Strukturen arbeiten zu können, müssen sie effizient, schnell, metabolisch aktiv und ohne Kontamination mit anderen Geweben isoliert werden. Daher wurde eine mechanische Mikropräparationstechnik entwickelt und für Studien an Nepenthes-Verdauungsflüssigkeit eingesetzt. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das zur erfolgreichen Präparierung einzelner bifunktioneller Drüsen aus Nepenthes-Fallen verwendet wurde, basierend auf einer mechanisierten Mikroprobenahmeplattform. Die Drüsen konnten isoliert und nach Präparation der RNA direkt für die Genexpressionsanalyse mittels PCR-Techniken weiterverwendet werden.

Einleitung

Pflanzen produzieren eine große Vielfalt an Verbindungen mit unterschiedlichen industriellen und pharmazeutischen Anwendungen, die von Molekülen mit geringem Molekulargewicht bis hin zu Polymeren reichen. Solche Verbindungen werden häufig von hochspezialisierten Strukturen produziert und abgesondert, von denen viele an der Oberfläche der Pflanzen lokalisiert sind, wie beispielsweise drüsenförmige Trichome oder Nektarien, oder innerlich, wie Idioblasten bzw. Latex- und Harzkanäle. Über die Biologie dieser spezialisierten sekretorischen Strukturen ist jedoch vergleichsweise wenig bekannt, obwohl alle Arten dieser Drüsen zahlreiche Merkmale aufweisen, die auf einen aktiven Stoffwechsel hindeuten. Insbesondere Drüsen fleischfressender Pflanzen wie Nepenthes können als Modellsysteme in der Pflanzenzellbiologie angesehen werden1.

Fleischfressende Pflanzen sind seit 1875 Gegenstand zahlreicher Studien, als Charles Darwins Werk „Insectivorous Plants“ veröffentlicht wurde.2. Allerdings wurde erst in den letzten Jahren auf molekularer Ebene geforscht, und nach wie vor sind unsere Erkenntnisse begrenzt. Zum Beispiel die Proteinzusammensetzung der Verdauungsflüssigkeit in den Kannenpflanzen der Gattung Nepenthes ist noch nicht vollständig bekannt. Erst kürzlich wurden mehrere hydrolytische Proteine identifiziert sowie einige der entsprechenden Gene3. In den Pheromone-Fallen von Nepenthes (Abbildung 1), mehrzellige Drüsen befinden sich an der inneren Unterseite der Kannen. Diese Drüsen produzieren und sezernieren Verdauungsenzyme in die Kannerflüssigkeit und absorbieren gelöste Nährstoffe aus der Kannerflüssigkeit4Daher stellen diese bifunktionellen Drüsen ein einzigartiges Mikrogewebe mit zentraler Position und Funktion in der Carnivorie von Nepenthes das einer detaillierten Untersuchung wert ist.

Anatomie einer fleischfressenden Pflanze, Detail des Kannenblatts von Nepenthes, botanische Untersuchung, Fangmechanismus, Anpassung.
Abbildung 1. Kannenblatt von Nepenthes alata. Der untere Teil der Kanne enthält die Verdauungsflüssigkeit sowie Drüsen an der Innenseite. Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

In der Pflanzenwissenschaft beruhen viele experimentelle Ansätze auf „Bulk-Material“, da nicht ein definiertes Gewebe, sondern ganze Organe untersucht werden. Folglich können ihre Homogenisierung und Analyse nur Ergebnisse liefern, die im Hinblick auf einzelne Gewebe und Zellen verdünnt und anteilig sind5. Um dieses Problem zu lösen, wurden Mikropräparationstechniken wie beispielsweise die sogenannte Laser-Kapture-Mikrodissektion (LCM) entwickelt und erfolgreich zur Gewinnung spezifischer Pflanzengewebe sowie zur Analyse ihrer individuellen Inhalte eingesetzt6. Allerdings ist die LCM häufig eingeschränkt, wenn instabile und/oder schnell abbaubare zelluläre Komponenten wie RNA im Fokus stehen. In solchen Fällen ist die Notwendigkeit einer vorherigen Gewebefixierung, die zeitaufwändig ist und oft mit einem Abbau der Biomoleküle einhergeht, von Nachteil. Zudem scheitert die LCM aufgrund des hohen Wasseranteils vieler Pflanzengewebe und der Festigkeit der Zellwände häufig bei der direkten Präparation aus frischem Gewebe7. Jeder Ansatz zur Untersuchung zellulärer Komponenten, die in Drüsen vorkommen – von Genen, mRNA und Proteinen bis hin zu sekundären Verbindungen und deren Biosynthese – erfordert alternative Techniken für die spezifische Präparation. Daher sind spezielle Methoden zur Isolierung einzelner Zellen oder sogar mehrzelliger Drüsen, die nach der Präparation intakt bleiben, notwendig.

Hier wird eine Methode vorgestellt, die eine automatisierte Mikroprobenahme-Plattform mit direkter mikroskopischer Visualisierung verwendet. Diese Technik ist sowohl schnell als auch effizient bei der Gewinnung einzelner Drüsen aus den Kannen von Nepenthes-Arten. Diese vielzelligen Drüsen sind bifunktional, d. h. sie sind sowohl an Sekretions- als auch an Aufnahmeprozessen beteiligt, sie sitzen fest und nicht exponierte Zellschichten sind durchtränkt, um eine Endodermis zu bilden. Ganze Drüsen können ohne angrenzendes Gewebe isoliert und gezielt in eine PCR-Röhre überführt werden. Diese Technik wird angewandt, um spezifische Gene sowie die Genexpression in den Geweben der Drüsen zu untersuchen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung von Pflanzenmaterial

  1. Alle Nepenthes-Arten wurden entweder in den Gewächshäusern des MPI für chemische Ökologie oder im Botanischen Garten in Jena gezüchtet.
  2. Für die Vorbereitung des sezernierenden Gewebes wird ein Krug entnommen und das obere Drittel einschließlich Deckel, Peristom und rutschige Zone entfernt. Der Krug kann entweder frisch oder in flüssigem Stickstoff eingefroren verwendet und bei -80 °C gelagert werden.

2. Mikrodissektion von Kannengewebe

  1. Die Microsampling-Plattform besteht aus einem Stereomikroskop und einem Mikromanipulator, der direkt am Mikroskopkörper befestigt ist und über einen 3D-Joystick bedient wird. Hier wurde ein früher Prototyp der Aureka verwendet, wie dokumentiert (Abbildung 2A).
  2. Für die Dissektion der Sekretdrüsen aus Nepenthes-Kannen verwenden Kannen eine Mikrozange und befestigen sie am Manipulator (Abbildungen 2A und 2B).
  3. Für die RNA-Extraktion sind alle Instrumente (Rasierklingen, Pinzette, Mikromanipulator, Mikrozange, Objektträger) mit RNaseZAP zu behandeln.
  4. Bereiten Sie die Entnahmeröhrchen vor, indem Sie 9 μl nukleasefreies Wasser und 1 μl RNase-Inhibitor in ein PCR-Röhrchen für die RNA-Extraktion geben. Für die direkte PCR aus Gewebeproben verwenden Sie ausschließlich nukleasefreies Wasser (10 μl).
    1. Nehmen Sie den frischen oder gefrorenen Krug und entfernen Sie mit einer Rasierklinge und einer Pinzette ein 1-2 cmgroßes Stück Gewebe, das die Sekretdrüsen enthält. Waschen Sie das Taschentuch mit Wasser; 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) hinzufügen, wenn RNA extrahiert wird.
    2. Befestigen Sie das Pflanzenmaterial mit doppelseitigem Klebeband auf einem Objektträger (die mit Stopfbuchsen bedeckte Oberfläche sollte nach oben zeigen, Abbildungen 2C und 2D) und befestigen Sie den Objektträger mit Klebeband auf einem Universaltisch, der mit einem beweglichen Tisch angebracht werden sollte.
    3. Für die Extraktion von Nukleinsäuren sollte die Zubereitung auf Eis erfolgen. Nehmen Sie dazu eine flache Styropordose, stellen Sie den Universaltisch mit der Probe hinein und füllen Sie die Box mit Eis. Legen Sie anschließend die Box unter das Mikroskop.
    4. Für die Vorbereitung ist die Positionierung der Drüsen sehr wichtig. Die Sekretdrüsen sind teilweise mit einer Schutzhaube bedeckt (Abbildung 3) und nur von einer Seite über die Pinzette zugänglich. Des Weiteren muss der Winkel der Probe zur Pinzette eingestellt werden, indem der Tisch des Universaltisches je nach Nepenthes-Spezies um ca. 135° gekippt wird.
    5. Die Mikrodissektion erfolgt unter visueller Kontrolle. Verwenden Sie für die Isolierung der Drüsen einen Nicht-UV-Filter, um den Abbau von DNA und RNA zu begrenzen.
    6. Mikromanipulator und Pinzette über das Bedienfeld auf die ausgewählte Drüse bewegen. Wenn du die Drüse erreicht hast, lege jeden Arm der Pinzette auf beide Seiten der Drüse. Entfernen Sie die Drüse aus dem restlichen Gewebe, indem Sie die Pinzette schließen (Abbildung 4A).
    7. Richten Sie die an der Pinzette befestigte Verschraubung vom Objekt weg und zum Sammelrohr. Bringen Sie die Spitzen der Pinzette mit der Lösung im Röhrchen in Kontakt (Abbildung 4B). Das Lösen der Drüse durch Öffnen der Pinzette muss gut beobachtet werden, da die Drüsen dazu neigen, an der Werkzeugspitze zu kleben. Das Gewebe kann bei -80 °C bis zur PCR oder RNA-Extraktion gelagert werden.

3. Direkte PCR-Amplifikation aus Nepenthes-Gewebe

  1. Um die Wirksamkeit der Präparationsmethode nachzuweisen, kann ein PCR-Ansatz direkt aus dem Drüsengewebe ohne DNA-Extraktionsschritt durchgeführt werden.
  2. Für die PCR-Amplifikation werden genspezifische Primer verwendet, die hier für die Sequenz eines Thhaumatin-ähnlichen Proteins (TLP) kodieren (vorwärts: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', rückwärts: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
    1. Sammeln Sie 1-5 Drüsen in einem PCR-Röhrchen mit 10 μl nukleasefreiem Wasser. Für eine 50-μl-Reaktion fügen Sie 5 μl 10x Taq-Puffer, 1 μl 10 mM Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) Taq-DNA-Polymerase, 1 μl (100 pmol) jedes Primers und 28,6 μl nukleasefreies Wasser hinzu.
    2. Führen Sie PCR-Reaktionen in einem Thermocycler mit folgendem Programm durch: Erstdenaturierung 94 °C für 3 Minuten, 35 Zyklen Denaturierung (94 °C für 30 Sekunden), Glühen (59 °C für 30 Sekunden) und Verlängerung (72 °C für 1 Minute) und ein letzter Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C.
    3. Weisen Sie die Amplifikation des PCR-Produkts mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese nach. Verwenden Sie daher 1,5% (w/v) Agarose und lösen Sie sie in 1x TAE (40 mM Trisbase, 20 mM Eisessigsäure, 1 mM EDTA, pH 8) Puffer auf. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose aufgelöst hat. Zu 100 ml Agaroselösung 1 μl Ethidiumbromid (10 μg/μl) für die nachgeschaltete Visualisierung hinzufügen. Lassen Sie das Gel in 1x TAE-Puffer bei 300 V, 115 mA für ca. 20 min in einer Elektrophoresekammer laufen. Die korrekte Größe des TLP-Amplikons muss bei 690 bp liegen.

4. RNA-Extraktion aus kleinen Gewebeproben und reverse Transkription

  1. Führen Sie die folgenden Schritte auf Eis aus. Für die Extraktion von RNA wurden zwei Extraktionsmethoden verwendet, ein Micro Kit für die Extraktion von Gesamt-RNA und ein mRNA-Isolationskit, das mit magnetischen Beads aufgetragen wurde.
  2. Sammeln Sie mindestens 30 sekretorische Drüsen durch Mikropräparation in einem PCR-Röhrchen, das 1 μl RNase-Inhibitor und 9 μl nukleasefreies Wasser enthält. Anschließend wird das Gewebe in einem Thermocycler 10 min bei 75 °C lysiert.
  3. Extraktion der Gesamt-RNA.
    1. Nach der Vorbereitung 90 μl Lyselösung in die Probe geben und 10 min bei 75 °C inkubieren. Anschließend das Reaktionsgemisch auf die Säule (im Lieferumfang des Kits enthalten) laden und mit den Waschschritten fortfahren, wie in der Bedienungsanleitung des Herstellers beschrieben.
    2. Eluieren Sie die RNA zweimal mit jeweils 10 μl Elutionslösung und fahren Sie mit der DNase I-Behandlung fort.
    3. Zu 20 μl extrahierter RNA 2 μl 10x DNase I Puffer und 1 μl DNase I (im RNA-Extraktionskit enthalten) geben und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 2 μl DNase Inaktivierungsreagenz hinzufügen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einem Zentrifugationsschritt von 1,5 min bei maximaler Geschwindigkeit kann die RNA in ein frisches RNase-freies Röhrchen überführt werden. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration jeder Probe mit einem Spektralphotometer. Die Proben sollten bei -80 °C gelagert werden.
  4. Extraktion von mRNA mit magnetischen Kügelchen.
    1. Das Probenvolumen mit Lyse-/Bindungspuffer (im Kit enthalten) auf 100 μl einstellen und 10 Minuten bei 75 °C inkubieren. 20 μl magnetische Kügelchen mit einem Oligo (dT)25-Überhang hinzufügen und die Reaktion 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mischen. Die mRNA bindet über den Poly(A)-Schwanz an den Oligo (dT)25-Überhang der Kügelchen.
    2. Führen Sie die Waschschritte der an die magnetischen Kügelchen gebundenen mRNA gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Lösungen können mit Hilfe eines Magneten entfernt werden. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5).
    3. Entfernen Sie Verunreinigungen der genomischen DNA, indem Sie die Probe 1 Stunde lang bei 37 °C mit 2 μl (1 μl) DNase (2 μl 10x DNase-Puffer und 17 μl nukleasefreies Wasser) behandeln. Anschließend wird die Enzymlösung durch den Magneten entfernt und die Kügelchen werden in 20 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer resuspendiert. Es ist nicht möglich, die RNA-Konzentration zu messen, da sie an die Kügelchen gebunden ist. Die Proben sollten bei -80 °C gelagert werden.
  5. Für die reverse Transkription verwenden Sie ein cDNA-Synthesekit. Die Reaktionen wurden nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
    1. Für die reverse Transkription der Gesamt-RNA fügen Sie 1 μl (100 pmol) Oligo (dT)20 Primer oder 1 μl (0,4 μg) Random Hexamere, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl 10 mM dNTP hinzu Mischen Sie 1 μg RNA und passen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 14 μl an. Bei 65 °C 5 min inkubieren und anschließend die Proben auf Eis legen. Fügen Sie 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl reverse Transkriptase und 4 μl 5x RT-Puffer hinzu. Die Reaktionen werden 55 min lang bei 50 °C inkubiert, gefolgt von einem Inaktivierungsschritt bei 70 °C für 10 min. Nach der reversen Transkription können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
    2. Bei mRNA, die an magnetische Beads gebunden ist, ersetzen Sie den Tris-HCl-Puffer durch den ersten Reaktionsmix (1 μl RNase-Inhibitor, 1 μl 10 mM dNTP-Mix und 12 μl nukleasefreies Wasser) und inkubieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 65 °C. Aufgrund des Oligo (dT)25-Überhangs der Kügelchen ist es nicht erforderlich, den Proben einen Oligo (dT)20 Primer oder Random Hexamers zuzusetzen. Folgen Sie anschließend dem obigen Protokoll (Schritt 4.5.1).
    3. Messen Sie die cDNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.

5. Echtzeit-PCR

  1. Für die Analysen mit Real-time PCR verwenden Sie die mit dem Micro Kit extrahierte Gesamt-RNA und einen SYBR Green QPCR Master Mix. Um eine gleiche Menge an Transkripten zu gewährleisten, stellen Sie die cDNA-Konzentration jeder Probe nach der reversen Transkription auf den gleichen Wert ein.
  2. Zusätzlich zu den Proben Kontrollreaktionen einfügen. Verwenden Sie eine Nicht-Schablonenkontrolle, um die Reagenzien auf Verunreinigungen zu untersuchen und die Qualität Ihrer Primer zu überprüfen. Um das Fehlen genomischer DNA zu überprüfen, führen Sie eine Nicht-RT-Kontrolle durch. Beide Reaktionen sollten in der Real-time PCR negativ sein (kein Fluoreszenzsignal).
  3. Um ein gleiches Transkriptniveau zwischen den verschiedenen Proben zu gewährleisten, verwenden Sie mindestens ein Referenzgen. Hierbei wurden designte Primerpaare verwendet, die für ein Aktin (forward: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', reverse: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') und eine 18SrRNA (forward: 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTGGTG-3', reverse: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3') kodieren. Als Zielgen wurde das TLP (forward: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', reverse: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3') gewählt. Die Größe jedes amplifizierten Fragments betrug etwa 100 bp.
  4. Für eine 25-μl-Reaktion fügen Sie 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM jedes Primers und 30 nM des passiven Referenzfarbstoffs ROX (im Kit enthalten) hinzu. Stellen Sie das Probenvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 25 μl ein.
  5. Die Reaktionen wurden in einem QPCR-Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 min, um die Polymerase zu aktivieren; 40 Zyklen Denaturierung (95 °C für 30 sec), Glühen (61 °C für 60 sec) und Verlängerung (72 °C für 1 min); gefolgt von der Dissoziationskurve (95 °C für 60 sec, 55 °C für 30 Sekunden, 95 °C für 30 Sekunden). Die Dissoziationskurve ist notwendig, um das Fehlen von Primer-Dimeren zu bestimmen, was durch einen zusätzlichen Peak nachgewiesen werden kann.
  6. Bestimmen Sie die Effizienz (E) jeder PCR-Reaktion mit der Methode von Liu und Saint8. Der Wirkungsgrad kann vom linearen Teil der Verstärkungskurve abgelenkt werden. Dabei wird die relative Amplikonzahl (Rn, A) eines Zykluspunktes (CPA) mit der Anzahl der Amplikons (Rn, B) eines anderen Zyklus (CPB) verknüpft.
  7. Analysieren Sie die Real-time-PCR-Ergebnisse mit dem Relative Expression Software Tool (REST 2009, http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) oder einer ähnlichen Software. Verwenden Sie das Programm, um das Expressionsverhältnis eines Gens in einer behandelten Probe im Vergleich zu einer Kontrolle zu berechnen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Für die Gewinnung einzelner Drüsen aus Nepenthes-Kannengewebe wurde eine mechanisierte Mikrodissektionstechnik entwickelt und angewandt. Die Mikropräparationsplattform muss mit einer an den Mikromanipulator angebrachten Mikrozange ausgestattet sein, die wiederum über ein Bedienfeld gesteuert wird. Einzelne, unter dem Mikroskop sichtbare Drüsen konnten mit der Zange gezielt erfasst und mechanisch entfernt werden (Abbildung 4A).

Das Drüsengewebe wurde direkt in ein PCR-...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Lange Zeit wurden Studien über sekretorische Strukturen von Pflanzen, insbesondere Trichome, im Wesentlichen anatomisch durchgeführt und waren rein deskriptiv. Es gibt eine große Anzahl von Veröffentlichungen dieser Art, wie sie in Rezensionen von9-11 zusammengefasst sind. Unser biochemisches und molekulares Wissen über die sekretorischen Strukturen von Pflanzen ist immer noch begrenzt, trotz einiger früher bemerkenswerter Arbeiten , z.B. an Minzdrüsentrichomen, die zeigen, dass Drüsentrichome der Ort...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem Gewächshausteam am MPI-CE im Botanischen Garten der Friedrich-Schiller-Universität Jena für die Kultivierung der Pflanzen und Wilhelm Boland und der Max-Planck-Gesellschaft für die Unterstützung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RNAqueous-Micro KitLife Technologies GmbH, DeutschlandAM1931Isolierung von Gesamt-RNA, 50
Proben Dynabeads mRNA DIRECT Micro KitLife Technologies GmbH, Deutschland610115 ml Dynabeads Oligo (dT)25
DynaMag-2 MagnetLife Technologies GmbH, Deutschland12321D
SuperScript CellsDirect cDNA SynthesesystemLife Technologies GmbH, Deutschland18080-20025 Reaktionen
RNaseOUTLife Technologies GmbH, Deutschland10777-019Rnase Inhibitor, 5.000 Einheiten
Zufällige Hexamere (0,4 μ g/μ l)QIAGEN GmbH, Deutschland79236100 μ l
10 mM dNTP Mix, molekularbiologische QualitätFermentas GmbH, DeutschlandR01921 ml
Taq DNA-Polymerase, (rekombinant)Fermentas GmbH, DeutschlandEP0402Lieferung mit 10x Taq Puffer (mit KCl oder (NH4)2SO4) und 25 mM MgCl2
TURBO DNaseLife Technologies GmbH, DeutschlandAM22381.000
Einheiten AgaroseCarl Roth GmbH Co. DeutschlandT846.3
GeneRuler Low Range DNA Leiter, gebrauchsfertigFermentas GmbH, DeutschlandSM119350 μ g
Brilliant II SYBR Green QPCR Master MixAgilent Technologies, Inc., USA600828Einzelset
RNaseZAPSigma-Aldrich, Taufkirchen, DeutschlandR2020
RasierklingeCarl Roth GmbH Co., DeutschlandCK08.1
PinzetteCarl Roth GmbH Co., Deutschland2801.1 / 2855.1
GE NanoVue SpektralphotometerGE Healthcare Europe GmbH, Deutschland28-9569-62
Mastercycler gradientEppendorf AG, Hamburg, Deutschland5331 000.010
Mx3000P Real-Time PCR SystemStratagene, USA401403
Agagel Standard Horizontal Gelelektrophorese KammerBiometraAuslaufartikel
Micromanipulatoraura optik gmbhaurekaAusgestattet mit einer Mikrozange
StereomikroskopCarl Zeiss Microscopy, Jena, DeutschlandSteREO Lumar.V12Ausgestattet mit einem AxioCam
Lumar Filterset 01Carl Zeiss, Mikroskopie, Jena, Deutschland485001-0000-000UV-Filter
Lumar Filter Set 09Carl Zeiss, Mikroskopie, Jena, Deutschland485009-0000-000Nicht-UV-Filter

Referenzen

  1. Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research. Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).
  2. Darwin, C. Insectivorous plants. , John Murray. London. (1875).
  3. Mithöfer, A. Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic. Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).
  4. Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant. Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).
  5. Brandt, S. P. Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels. J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).
  6. Hölscher, D., Schneider, B. Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites. Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).
  7. Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes. Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).
  8. Liu, W. H., Saint, D. H. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).
  9. Werker, E. Trichome diversity and development. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).
  10. Fahn, A. Structure and function of secretory cells. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).
  11. Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. The carnivorous plants. , Academic Press. London. (1989).
  12. Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products. Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).
  13. Rontein, D., Onillon, S., et al. CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane. J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).
  14. Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants. Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).
  15. Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. Chemical ecology of plant-insect interactions. Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).
  16. Kennedy, G. G. Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon. Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).
  17. Mithöfer, A., Boland, W. Plant defense against herbivores: Chemical aspects. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).
  18. Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes. J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Nepenthes Dr senmechanische MikrobeprobennahmeDr senisolationGewebefixierungRNA Extraktionquantitative PCRGenexpressionsanalyseProteomikMetabolomik

Verwandte Artikel