Die Milchgewinnung aus Tiermodellen erleichtert verschiedene Forschungswege: das Verständnis der passiven Immunität, die Identifizierung von Krankheitserregern, die für die vertikale Übertragung verantwortlich sind, und durch die Verwendung transgener Mäuse sogar die kommerzielle Produktion von Proteinen, die in menschlicher Muttermilch vorkommen. Hier veranschaulichen wir eine einfache Methode zur Milchgewinnung bei Mäusen und Reeves-Muntjakhirschen.
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Methodenartikel
Milchauffangmethoden für Mäuse und Reeves Muntjac Deer
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tiermodelle werden häufig in Forschungslaboratorien verwendet, um das zu erreichen, was normalerweise im nativen Wirt eines Krankheitserregers als unpraktisch angesehen würde. Die Milchgewinnung von Tieren gibt Wissenschaftlern die Möglichkeit, viele Aspekte der Fortpflanzung zu untersuchen, einschließlich vertikaler Übertragung, passiver Immunität, Biologie der Brustdrüse und Laktation. Die Gewinnung ausreichender Milchmengen für diese Studien ist eine schwierige Aufgabe, insbesondere aus Kleintiermodellen. Hier veranschaulichen wir eine kostengünstige und einfache Methode zur Milchgewinnung bei Mäusen und Reeves-Muntjakhirschen, die keine spezielle Ausrüstung oder umfangreiche Schulung erfordert. Für diese spezielle Methode sind zwei Forscher erforderlich: einer, um die Milch abzupumpen und das Tier zu stabilisieren, und einer, der die Milch in einem geeigneten Behälter aus einem Muntjak- oder Mausmodell sammelt. Das Mausmodell erfordert außerdem die Verwendung eines P-200-Pipettierers und entsprechender Pipettenspitzen. Obwohl diese Methode kostengünstig und relativ einfach durchzuführen ist, sollten die Forscher darauf hingewiesen werden, dass eine Betäubung des Tieres für eine optimale Milchgewinnung erforderlich ist.
Einleitung
Tiermodelle geben Einblick in Krankheitspathologie, die nicht durch in vitro-Analyse gewonnen werden können. Um die wirksamsten Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, ein Tiermodell, das eng mit der Krankheit und verwandte Spezies von Interesse verwendet wird. Zum Beispiel, die Reeves 'muntjac (Muntiacus reevesi), eine kleine asiatische Hirsche 1,2 und transgenen Mäusen, die Hirsch Prion-Protein (CerTgPrP) 3 exprimieren sind nützlich, Tiermodelle für Hirscharten. Beide Arten sind polyestrous, so dass das ganze Jahr über Zucht, und somit eine konsistente Quelle für schwangerschaftsbedingten Gewebe und Flüssigkeiten, um spezifische Mechanismen in Hirsch Biologie zu studieren. Untersuchungen von Milch haben eine breite Palette von Anwendungen, die einfach (und kostengünstig) sind in Tiermodellen erreicht als beim Menschen. Forscher könnten Milch und Kolostrum als eine potenzielle Quelle von 1) Übertragung von Infektionskrankheiten zu untersuchen, 2) Immunglobuline von Mutter zu Kind in die Entwicklungs übertragenpment der passiven Immunität 4 und 3) Lactoferrin, ein Protein in der menschlichen Muttermilch in passive Immunität, die Forscher versuchen derzeit, beteiligt gefunden kommerziell produzieren 5.
Sammeln eine erhebliche Menge an Milch von Kleintieren kann sich als eine schwierige Aufgabe sein. Rogers vorgeschlagen, einen Ansatz für die Milch von Ratten 6, die anschließend in Mäuse verwendet wurde, zu sammeln. DePeters und Hovey vorgeschlagen zwei Verfahren zur Milchsammlung, eine mit einer manuell erzeugten Unterdruck durch ein Gummipipettenkolben in eine Pasteur-Pipette befestigt erzeugt, und einem zweiten, das den Aufbau einer Melkeinheit, die dann an eine Vakuumquelle angeschlossen (wie erforderlich wie einen Wasserhahn), um Maus Milch 7 ernten. Hier schlagen wir eine einfache, kostengünstige Methode zur Erfassung von Milch von Mäusen und Reeves 'muntjac Rehe, die nur leicht verfügbaren Laborausstattung und grundlegende technische Fähigkeiten erfordert. Unsere Methode liefert ausreichend Milchmengen für verschiedeneAnwendungen.
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Protokoll
1. Maus Melken Protokoll
Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden durch IACUC genehmigt.
1. Trennung des Dam von Offspring
- Wählen Sie den Damm, um gemolken zu werden. Wählen Sie einen Damm mit einem Wurf von 4 oder mehr Welpen, die 8-12 Tage nach der Geburt zu bieten maximale Milchsammel-Sammlung ist zwar zu jedem Zeitpunkt nach der Geburt bis zu 21 Tagen möglich.
- Trennen Sie die Staumauer aus ihrem Wurf mindestens 2 Stunden vor dem Melken.
Hinweis: Sollte ein Wunsch, mehr als ein Damm in einem bestimmten Zeitraum zu melken, ist es akzeptabel, die Dämme getrennt im gleichen Käfig mit ausreichend Nahrung und Wasserversorgung unterzubringen.
2. Verabreichung von Oxytocin, Anästhesie und Augen Schmiermittel
- Verwalten Sie 2 IE / kg von Oxytocin intraperitoneal (IP). Oxytocin ist ein Hormon, das in den Milchdrüsen von säugende Weibchen wirkt, um die Freisetzung von Milch zu stimulieren. Oxytocin kann fr erworben werdenom ein Tierarzt.
- Verwalten eines Narkosemischung, die 80 bis 100 mg / kg Ketamin in Kombination mit 5-10 mg / kg Xylazin IP. So könnte beispielsweise eine 10 ml Stamm Anästhetikagemische im Voraus für Mäuse mit einem Gewicht ca. 30 g vorbereitet werden und würde 0,1 ml Xylazin, 8,9 ml H 2 O und 1,0 ml Ketamin enthalten. 0,25 ml Gesamt Betäubung wird eine Maus dieser Größe für ca. 20-30 min zu sedieren, die ausreichend Zeit für Milchsammel bieten sollte.
Hinweise: Um festzustellen, dass das Tier betäubt wurde erfolgreich ist, setzen sie auf dem Bauch auf einer festen Oberfläche; sie sollte nicht zu bewegen ihre Füße oder der Versuch, auf die Füße steigen, wenn sie vollständig betäubt wird. Im Falle einer Maus nicht vollständig mit der ursprünglichen Dosis betäubt, kann der Forscher ein weiteres verwalten ¼ oder ½ der ursprünglichen Dosis des Narkosegemisch je nach Größe der Maus und / oder das Niveau der Sedierung, die die Maus bereits erreicht hat . Allerdings könnte dies increase die Chance auf eine negative Reaktion auf Anästhesie, und kann auch in der Maus ist mehr tief anästhesiert und / oder für eine längere Zeit betäubt führen.
Hinweis: Wenn mehr als ein Melken Damm, ist es notwendig, Oxytocin und Betäubungsspritzen aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Oxytocin und Sedierung Zeiten für Ketamin und Xylazin staffeln. - Eine kleine Menge von Augen Schmiermittel auf die Ecke jedes Auge und verbreiten, um die Augen der Maus vor dem Austrocknen während der Narkose zu vermeiden.
3. Milchauffang
Die Milchsammlung wird am einfachsten mit zwei Forschern durchgeführt: ein Forscher, um die narkotisierten Maus zu halten, während die Milch (als R1 bezeichnet) und ein Forscher, um die Milch (R2) sammeln manuell abzugeben. Dieses Verfahren kann auch mit einer Person durchgeführt werden, wenn die Maus auf einer ebenen Fläche befestigt ist, um Schaden zu vermeiden.
- R2 sollte mit sterilem Alkoholtupfer ausgestattet werden, einen P-200 pipEtman, eine saubere Pipettenspitze für jede Maus und einen Behälter, um die Milch, wie ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen oder einem 1,2 ml Kryoröhrchen (siehe Tabelle der Materialien) zu halten.
- Wie der Oxytocin zu wirken beginnt, wird Milch in den Brustbereich Enttäuschung der Maus die sichtbar werden (siehe Abbildung 1A). R1: Packen Sie eine sterile Alkohol Prep Pad und wischen Sie die Brustfläche der Maus den Bereich vor dem Melken reinigen. Manuell Ausdruck Milch aus der Zitze mit dem Daumen und Zeigefinger, um sanft zu massieren und drücken die Brustgewebe in einer Aufwärtsbewegung, bis ein sichtbarer Wulst Milch beginnt an der Basis des Saugers bilden.
- Drücken Sie die P-200 Pipetman Kolben, um seine erste Station, um Luft aus der Pipettenspitze freizugeben und die Vorbereitungen für Milchsammel.
- Positionieren Sie die Pipettenspitze an der Spitze der Tropfen Milch, und ziehen Sie die Milch in die Pipettenspitze durch langsames Lösen Druck auf den Kolben. Achten Sie darauf, um die Spitze zu nahe an der Zitze oder die Haut gesetzt (sieheAbbildung 1b). Es ist nicht notwendig, um den Kolben vollständig zu lösen, da dies die Milch bis hin zu der Oberseite der Pipettenspitze zu ziehen und wird es schwierig, die oft viskose Milch in den Aufnahmebehälter auszustoßen.
- Vertreibt die Milch in den Behälter mit dem Daumen, um den Kolben über den ersten Anschlag drücken (siehe Abbildung 1C). Zur Vertreibung von Kleinmengen zu erleichtern, drücken Sie die Pipettenspitze an der Seite der Röhre, so dass keine Flüssigkeit verloren geht.
- Weiterhin Milch aus jeder Zitze manuell auszudrücken, Bewegen entweder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, um nicht alle Zitzen überspringen. Es ist akzeptabel und sinnvoll, zurück zu kommen und immer wieder ausdrücken Milch aus der Zitze gleiche sollte es mehr Milch als andere zu produzieren.
4. Betäubungsmittel Reversal in der Dam
- In den meisten Fällen ist es für die Mutter zu beginnen zu beginnen, während des Melkvorgangs aufwachen. Ist dies nicht der Fall, legen Sie die Staumauer in einem cage indirekt unter einer Wärmequelle, wie einen beheizten zirkulierenden Decke, bis sie beginnt, um aufzuwachen.
Hinweis: Da die Mutter beginnt zu erwachen, halten genaue Beobachtung ihrer Tätigkeit, bis sie in der Lage, über ihren Käfig auf ihrem eigenen Fuß ist. - Nachdem der Damm über den Käfig in Bewegung, ohne Kampf, legen Sie sie zurück in ihre ursprüngliche Käfig mit ihrem Wurf. Keine negativen Auswirkungen haben, in Bezug auf die Welpen 'Fähigkeit, nach Milchsammel füttern festgestellt worden.
2. Muntjaks Melk-Protokoll
Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden durch IACUC genehmigt.
1. Trennung der Doe von Offspring
- Wählen Sie das doe gemolken werden. Reeves 'muntjac Hirsche in der Regel geben Geburt ein Kitz 2. Milch Die Hirschkuh am Tag nach der Geburt, um das Kitz Möglichkeit, den Zugang zu essentiellen Nährstoffe im Colostrum 8 gewinnen können.
Hinweis: Die Kitz in der Regel versteckt und nicht während der proc wiederEDURE; Trennung von der Mutter-Kind-Paar ist nicht erforderlich.
2. Verabreichung von Oxytocin, Anästhesie und Augen Schmiermittel
- Verwalten 10 IU / kg Oxytocin intramuskulär (IM). Oxytocin ist ein Hormon, das in den Milchdrüsen von säugende Weibchen wirkt, um die let-down von Milch zu stimulieren. Oxytocin kann von einem Tierarzt erworben werden.
- Verwalten Sie die BAM Betäubung IM Butorphanol 11 enthält 0,45 mg / kg, Azaperon 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Eine Dosis des Narkose BAM Mischung eine muntjac für ca. 20-30 Minuten, die genügend Zeit für die komplette Milchsammlung bietet sedieren. Eine weitere Option für Narkose ist Midazolam bei 1-2 mg / kg, die eine muntjac für ca. 10-15 min beruhigen wird. Während dies eine angemessene Zeit für Milchsammlung, ist diese Betäubung schneller verstoffwechselt als BAM und das Tier kann versuchen, am Ende des kürzeren Zeitraum zu entkommen.
Hinweis: Minimale Reaktion auf Schmerz, Kleinere Reflexe bei Berührung die Ohren, gefolgt von der Fähigkeit der R1, die MJ ohne Kampf zu halten bedeutet, dass das Tier wurde erfolgreich betäubt.
Anmerkung: In dem Fall eines muntjac nicht vollständig mit der ursprünglichen Dosis anästhesiert kann der Forscher eine weitere verabreichen ¼ oder ½ der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Mischung abhängig von der Größe des Tieres und / oder das Niveau der Sedierung, die bereits hat erreicht. Dies könnte jedoch die Möglichkeit einer negativen Reaktion auf die Anästhesie zu erhöhen, und kann auch in der muntjac wobei tiefer betäubt und / oder für eine längere Zeit betäubt führen. - Tragen Sie eine kleine Menge des Schmiermittels in die Ecke eines jeden Auges und die Ausbreitung auf die Augen des muntjac die vor dem Austrocknen während der Narkose zu vermeiden.
3. Milchauffang
Die Milchsammlung wird am einfachsten mit zwei Forschern durchgeführt werden; ein Forscher, die in narkotisierten muntjac haltendie Runde, während die Milch (als R1 bezeichnet), und eine zweite Forscher, den Kopf des muntjac in einem komfortablen und sicheren Position zu halten und die Milch (R2) sammeln manuell abzugeben.
- Je nach der Narkose verwendet wird, sollte das Melken entweder 1) in ihre Stifte geführt werden, um einen sicheren Platz für sie zu sorgen sollten sie aufwachen während des Verfahrens (Midazolam-induzierten) oder 2) in einer Bettwäsche frei Vorraum Sauberkeit halten (BAM- induziert).
- R1 und R2 sollte mit Ethanol getränkten Gaze und mehrere 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen, um die Milch zu halten ausgestattet werden.
- Wie der Oxytocin zu wirken beginnt, wird Milch Enttäuschung geworden in den Brustbereich des muntjac sichtbar. R1: Sanitize behandschuhten Hände und Finger, sowie das gesamte Euter und jede einzelne Zitze des Tieres mit dem Ethanol-getränkten Gaze. R2: Halten Sie den Kopf des muntjac in einer sicheren und bequemen Position, um eine einfache Atem ermöglichen und zu verhindern, Pansen Aufstoßen. Halten Sie die Sammelröhrchen cl ose an die Zitze wird, ohne es zu berühren, Verunreinigungen zu verhindern gemolken.
- Express-Milch aus einer Zitze mit Hilfe der Daumen und Zeigefinger drücken Sie leicht die Brustgewebe in einer Aufwärtsbewegung, bis die Zitze mit Milch angeschwollen, und sanft rollen die Milch aus der Zitze und in das Rohr, das hält R2 (siehe Abbildung 2 ).
- Hinweis: Die Milch kommt in einem Bach, so ist es wichtig für R2 zu haben, das Sammelrohr so positioniert, dass wenig bis gar keine Milch verschwendet werden.
- Die muntjac Euter ist in Quadranten unterteilt. R1: Weiter zur Milch aus jedem Quadranten ausdrücken, bis die Milch nicht mehr so leicht fließt. Wenn Milch nicht von einer Zitze ausgedrückt werden, ausdrücklich von allen anderen Zitzen vor der Rückkehr in die erste. Es ist akzeptabel und sinnvoll, zurück zu kommen und immer wieder ausdrücken Milch aus der Zitze gleiche sollte es mehr Milch als andere zu produzieren.
4. Betäubungsmittel Reversal in der Doe
t "> Es ist üblich, Midazolam-induzierten doe zu beginnen, um beim Melken aufwachen. In den meisten Fällen wird das Reh versuchen, zu entkommen, bevor die gesamte Milch wurde zum Ausdruck gebracht. Minor Zurückhaltung ist in dem Bemühen, die Milch zu erhöhen Ausbeute, aber die Sicherheit und den Komfort der beiden Forscher und der Hirschkuh sind gleichermaßen wichtig.- Verwalten Atipamezol bei 2,5 mg / mg subkutan medetomadine für eine schnelle Umkehr der BAM betäubt doe.
Hinweis: Bei beiden Arten der Narkose, ist es erforderlich, eine enge Beobachtung des doe zu halten, bis sie in der Lage, auf eigene Faust, ohne zu stolpern oder fallen zu Fuß ist, und ist in der Lage zu essen und zu trinken, ohne Angst vor Aspiration oder Ersticken. Keine negativen Auswirkungen haben, in Bezug auf die Fähigkeit, Kitz nach Milchsammlung pflegen festgestellt worden.
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Ergebnisse
Maus
Aus unseren Experimenten haben wir festgestellt, dass es möglich ist, ungefähr 100-400 &mgr; l Milch einer Labormaus, hängt von mehreren Variablen zu sammeln. Diese Variablen umfassen 1) die Zeit für die Sammlung beiseite gesetzt, 2) die Dosis von Oxytocin verabreicht, 3), wie viele Jungtiere die Mutter ist derzeit Pflege und 4) die Menge der Zeit nach der Geburt. Unsere Studien haben gezeigt, dass die höchste Ausbeute erhalten wird, wenn die Dämme von ihren Nachkom...
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Diskussion
Maus
Es gibt mehrere Faktoren zu berücksichtigen, wenn das Sammeln Milch von einer Maus zu machen, einschließlich 1) die Zeit, die für die Sammlung beiseite gesetzt, 2) die Dosis von Oxytocin verabreicht, 3), wie viele Jungtiere die Mutter ist derzeit Pflege und 4) die Menge der Zeit, die seit der Geburt zum Zeitpunkt der Sammlung durchlaufen hat. Mit früheren Studien als Richtlinien, machten wir uns um die Bedingungen für die Milchleistung zu optimieren.
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Experimente wurden durch den NIH-Zuschuss #RAI093634A finanziert. Wir danken Jenny Powers, DVM, PhD, für ihre Hilfe beim Melken von Muntjaks.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materialien— | |||
| Maus-Ketamin (KetaVed 100 mg/ml) (Dosis: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazin (TranquiVed 100 mg/ml) (Dosis: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Augengleitmittel | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IE/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materialien— Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: Forscher können Midazolam entweder allein oder BAM-Kombination als Anästhetikum |
| verwenden Butorphanol-Tartrat (Torbugesic) (0,45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperon-Tartrat (0,25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadin HCl (0,07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezolhydrochlorid (Antisedan) (Dosis: 0,25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IE/kg) | Vet One | 501013 | |
| Ausrüstung— Maus | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μ l Pipettenspitzen | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml Spritzen | MWI | 005427 | |
| 27 G Nadeln | MWI | 002031 | |
| Ausrüstung— Muntjac | |||
| 15 ml konische Röhrchen | VWR | 21008-918 | |
| 22 G Nadeln | MWI | 873 | |
| 3 ml Luer-Lock-Spritzen | MWI | 001377 |
Referenzen
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
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