Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Zusammenfassung

Embryonale Endothelzellen des Gehirns kann als ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Angiogenese und neurovaskulären Entwicklung und Wechselwirkungen dienen. Die beiden Gefäßnetze der embryonalen Vorderhirn, Pia und periventrikuläre, räumlich markante und haben unterschiedliche Ursprünge und Wachstumsmuster. Endothelzellen aus der Pia-und periventrikuläre Gefäßnetze haben einzigartige Genexpressionsprofilen und Funktionen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reine Populationen von Endothelzellen aus der periventrikulären Gefäßnetz (PVECs) der embryonalen Vorderhirn (Telencephalon). In diesem Ansatz wird Telen ohne Pia Membran aus embryonalen Tag 15 Mäusen zerkleinert, mit Collagenase / Dispase verdaut und mechanisch in eine Einzelzellsuspension dispergiert. PVECs werden aus Zellsuspension mit positiven Selektion mit anti-CD-31/PECAM-1 Antikörper MicroBeads konjugiert mit einem starken Magnet gereinigtTrennverfahren. Gereinigte Zellen auf Kollagen 1 beschichtet Kulturschalen in endothelialen Zellkulturmedium kultiviert, bis sie konfluent und weitere Subkultur geworden. PVECs erhalten mit diesem Protokoll Ausstellung mit Kopfsteinpflaster und spindelförmigen Phänotypen, wie Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Reinheit der Kulturen wurde mit PVEC Endothelzellmarker etabliert. In unseren Händen, diese Methode zuverlässig und konsequent ergibt reine Populationen PVECs. Dieses Protokoll wird mechanistische Studien an gewinnen Einblicke in Vorderhirn Angiogenese, Verständnis PVEC Wechselwirkungen und Quer Gespräche mit neuronalen Zelltypen und hält ein enormes Potenzial für therapeutische Angiogenese gerichtet profitieren.

Einleitung

Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind kritische Ereignisse im zentralen Nervensystem (ZNS), Entwicklung, Reparatur und Regeneration. Mehrere elegant Studien haben gezeigt, dass Endothelzellen neuronalen Proliferation und umgekehrt stimulieren durch Freisetzung von löslichen Faktoren und durch direkten Kontakt. Wir fanden es merkwürdig, dass in der Mehrzahl dieser Studien ^1-3, während die neuronalen Vorläuferzellen / neuralen Stammzellen aus dem embryonalen Gehirn isoliert, sie sind mit Endothel-Zellen aus dem erwachsenen Gehirn, andere erwachsene Gewebequellen oder mit einer endothelialen Zelllinien kokultiviert. Dies kann zum Teil aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung und Kultivierung reine Populationen von Endothelzellen aus dem embryonalen Gehirn. , Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind jedoch gleichzeitigen Veranstaltungen in Größenordnungen robuster im embryonalen Gehirn auftreten als in der normalen erwachsenen Gehirn. Die periventrikulärer Gefäßnetz des embryonic Vorderhirn (Telencephalon) stammt von einem Schiff in den Basalganglien Primordium gelegen und entwickelt sich in Form einer geordneten Gradienten von ventral Telen von embryonalen Tag 11 (E11) ^4,5 dorsal. Dieses Geflecht von Schiffen der periventrikulären Gefäßnetz unterscheiden sich von Pia-Gefäße basierend auf Herkunft, anatomische Lage, Wachstumsmuster und Entwicklungsregulation ^4,5. Die Ausbreitungsrichtung der periventrikulären Angiogenese Steigung entspricht der neurogenetischen Quer telencephalic Steigung. Innerhalb der Telen, die periventrikuläre Angiogenese Steigung und das Gefälle der GABA-Neuronen Migration tangential überlappt räumlich als auch ^6. In Bezug auf Timing, ist die Angiogenese Gradienten im Vorfeld der neurogenetischen Gradienten-und GABA-Neuronen Gradienten von etwa einem Tag. So sind periventrikuläre Endothelzellen räumlich und zeitlich gut positioniert, um kritische Hinweise liefern, um telencephalic Neurogenese zu unterstützen undneuronalen Migration ^4,6. Daher würde die Verwendung von embryonalen periventrikulärer Endothelzellen in Kokultur Experimente mit neuronalen Vorläuferzellen und / oder Neuronen eines günstigeren Modell zum Studium der Wechselwirkungen neurovaskuläre und Entwicklung neuer Wege für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen oder ischämischer / traumatische Gehirnverletzung ist.

Wir unterstreichen die Bedeutung der Entfernung der Pia-Membran, nicht nur um epithelialen Zellkontamination zu begrenzen, sondern auch auf Pia-Endothelzellen, die molekular und funktionell von Endothelzellen der Gefäßnetz periventrikulärer ^4,6 (bezeichnet als PVECs von Pia-ECs zu unterscheiden) sind zu trennen . Hier beschreiben wir die Methode, die wir verwenden in unserem Labor routinemäßig, um einen reichen und Reinausbeute von PVECs erhalten. Diese Endothelzellen aus embryonalen Vorderhirn von einem Einzelzeit-schwangeren Maus isoliert vorbereitet. Sie können für die zukünftige Nutzung erweitert werden, subkultiviert und frorene erfolgreich.

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen

1. Beschichtung von 35 mm Kulturschale: Kollagen Typ 1-Lösung wird als wässrige Lösung in 20 mM Essigsäure (~ 100 mg Protein / Röhrchen) zugeführt. Verdünnen Sie eine entsprechende Volumen der Kollagenlösung zu einer Arbeitskonzentration von 0,01% mit sterilen Gewebekultur-Wasser. Mantel Gerichte mit 1 ml Kollagenlösung für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder 37 ° C oder über Nacht bei 2-8 ° C. Entfernen Sie überschüssige Lösung von der beschichtete Schale und lassen Sie es über Nacht trocknen. Spülen Sie die Schale mit Gewebekultur-Wasser oder PBS vor der Zugabe Medien. Beschichtete Platten können bei 4 ° C für einen Monat gelagert werden.
2. Bereiten komplette Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM). Ergänzen das DMEM (500 ml) mit 10% FBS und Antibiotika-Antimykotika-Lösung (1x Konzentration; 1 ml/100 ml). Komplettem DMEM bei 4 ° C für zwei Monate gelagert werden.
3. Vorbereitung eines Aliquots (50 ml) DMEM mit DNase I (0,001 mg / ml) (als D bezeichnetMEM-DNase I).
4. Vorbereitung weiteres Aliquot (10 ml) DMEM mit Kollagenase und Dispase (1 mg / ml) (als DMEM-collagenase/dispase bezeichnet).
5. Vorbereitung Endothelzell-Kulturmedium (ECCM, 500 ml), mit EGF (5 &mgr; g) ergänzt, ECGS (100 mg) und 5 &mgr; l von Antibiotika-Antimykotika-Lösung. ECCM können bei 4 ° C für zwei Monate gelagert werden.
6. Vorwärmen alle Medien vor dem Gebrauch.
7. Vorbereitung Reinigungspuffer: PBS, pH 7,2 mit 0,5% BSA und 2 mM EDTA. Halten Puffer kalt (2-8 ° C).

2. Entfernung von Embryonen und Präparation der Telen

Alle Experimente mit Labortieren durch die Tierpflege und die Nutzung Ausschüsse des McLean-Krankenhaus zugelassen und entsprechen den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Verwenden zeitlich schwanger CD1-Mäuse (embryonalen Tag 15). Der Tag der Vaginalpfropf Entdeckung gilt als embryonale Tag 0 (E0). CD1 Staudämme produzieren im Allgemeinen große Würfe, so 10-12 Embryos werden von einer schwangeren Damm erwartet.
2. Für hysterotomy, betäuben trächtige Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg). Bei Mäusen ca. 20-30 g, liefern 0,3 ml einer 10 ml / kg Ketamin / Xylazin Anästhesielösung und sicherzustellen, dass Schmerzen und Leiden ist minimal, während die intraperitoneale Injektion des Narkosemittels. Verwenden Sie Handstütze für die Injektionen.
3. Überprüfen tiefe Narkose durch Zehe Prise. Embryonen entfernen tief narkotisierten Mäusen. Köpfen jedem Embryo sofort nach der Entfernung von der Mutter. Legen Sie die embryonalen Köpfe in sterilen Petrischalen in eiskaltem PBS.
4. Folgen Hysterektomie durch sofortige Euthanasie mit Narkosedosis (130 mg / kg Pentobarbital, ip), ein Verfahren zur Euthanasie, die im Einklang mit den Richtlinien für die AVMA Euthanasie von Tieren ist: 2013 Edition.
5. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf mit feinen Mikro Schere und feinen Pinzette. Hinweis: Eine hohe Qualität sezierenIonen ist wichtig, die Pia-Membran erfolgreich aus dem embryonalen Gehirn zu entfernen. Dies wird durch die Praxis erreicht. Feinen Pinzette und Schere Mikrospitze sind ebenfalls wichtige Werkzeuge für einen guten Präparation.
6. Verwenden Sie die Pinzette, um einen festen Griff auf das Gehirn und die Mikro Schere bekommen abziehen der Pia-Membran. Entfernen Sie die Hirn und metencephalon und Isolierung des Telen. Übertragen Pia frei Telen von allen Embryonen auf eine 35 mm Kulturschale mit 2 ml PBS im Eis.

3. Zellisolierung

1. Mince das Telen in 1-2 mm Fragmente mit einer Skalpellklinge und sammeln Gewebe in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 2 ml komplettem DMEM.
2. Distanzieren Gewebe vorsichtig, aber gründlich mit einer 1 ml-Pipette bis Klumpen verschwinden und eine milchige Suspension erreicht.
3. Zentrifuge dissoziierte Zellen bei 800-1.000 x g für 5 min bei RT.
4. Den Überstand und Pellet erneut in DMEM-DNase I. vorsichtig entfernen Sie vorsichtig distanzieren die cells erneut mit 1 ml Pipette und Zentrifuge bei 800-1.000 x g für 5 min bei RT.
5. Das Pellet in warmen kompletten DMEM. Filterzellen durch ein steriles 70 um Nylon-Mesh. Sammeln gefiltert Zellen und halten im Eis.
6. Sammle die Zellen-Bereiche auf dem Sieb zurückgehalten und zu verdauen ferner mit DMEM-collagenase/dispase (2 ml) für 1-2 min bei RT. Waschen der Zellen 3x in DMEM-DNase durch Zentrifugation bei 800-1000 x g für 5 min bei RT. Bündeln diese Zellen mit dem filtrierten Zellen in Schritt 3.5 gesammelt. Waschen Gesamt Zellen einmal mit komplettem DMEM. Gehen Sie auf die Zellzahl und magnetischen Markierungsschritte bestimmen. Hinweis: Es ist wichtig, um eine Einzelzellsuspension vor der magnetischen Markierung zu erhalten.

4. Magnetische Beschriftungs

1. Dieses Protokoll zeigt die magnetische Kennzeichnung 10 ⁷ Zellen. Für Zellzahlen von weniger als 10 ^7, das gleiche Volumen und Reagenz für Zellzahlen von mehr als 10 ^7, Scale-up alle Reagenzienvolumina und Gesamtvoluminaentsprechend (zB für 2 x 10 ⁷ Zellen insgesamt, verwenden Sie zweimal die Lautstärke aller angegebenen Reagenzien). Halten Sie alle Reagenzien und Zellen im Eis.
2. Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer.
3. Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei RT. Absaugen des Überstandes.
4. Hinzufügen 90 μl/10 ⁷ Zellen Reinigungspuffer zu dem Zellpellet, gefolgt von 10 ul CD31-MicroBeads. Die vom Hersteller bereitgestellten Mikroperlen sind konjugierte monoklonale anti-Maus-CD31-Antikörpers.
5. Gut mischen und die Proben für 15 min in den Kühlschrank stellen. Hinweis: Höhere Temperaturen und / oder längere Inkubationszeit während magnetische Markierung kann unspezifische Bindung führen.
6. Waschen der Zellen durch Zugabe von 1-2 ml/10 ^7-Zellen der Reinigung Puffer und Zentrifuge bei 300 g für 10 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in 500 &mgr; l Reinigungspuffer. Gehen Sie zur magnetischen Trennung oder Reinigungsschritt.

5. Purification

1. Platzieren MS Säule in das Magnetfeld des MACS Separator.
2. Spülen Säule mit 500 ul Reinigungspuffer.
3. Gelten Zellsuspension auf die Säule. Legen entsprechende Anzahl von Zellen in MS-Spalte als höhere Zellzahl kann die Spalte verstopfen. Achtung: Jeder MS-Spalte kann eine maximale Anzahl von 2 x 10 ⁷ Zellen, für eine höhere Zellzahl aufnehmen, verwenden Sie mehr Spalten.
4. Sammeln und entsorgen Durchfluss unmarkierten Zellen enthält.
5. Mit 500 ul Reinigungspuffer dreimal waschen Spalte. Während der Waschschritte, stellen Sie sicher, dass die Spalte Behälter leer ist, bevor die anschließende Reinigung Puffer Aliquots.
6. Entfernen Spalte aus der MACS-Separator und legen Sie es auf einem 15 ml Falcon-Röhrchen.
7. Ein Kolben ist mit dem MS-Säule zugeführt. Je 1 ml Reinigungspuffer auf die Säule MS und sofort spülen die magnetisch markierten Zellen durch festes Drücken Sie den Kolben in die Spalte.
8. Teller cells auf einer 35 mm Kulturschale mit Kollagen Typ 1 schwemmt und wachsen Zellen in ECCM in einem Inkubator auf 37 ° C mit 95% O ₂ und 5% CO ₂ eingestellt.
9. Ändern Sie das Medium alle vier Tage. Verwenden PVECs für Experimente oder Subkultur nach 10-12 Tagen, wenn der Teller ist konfluent.

6. Subkultur von PV-ECS

1. Entfernen Sie die ECCM und spülen Sie die Monolage von PVECS mit 1-2 ml sterilem PBS.
2. Sanft fügen 1,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, um die Zellschicht zu bedecken.
3. Gibt die Schale in den Inkubator. Innerhalb von 5-7 Minuten, werden die Zellen von der Oberfläche der Schale zu lösen.
4. Nachdem die Zellen abgelöst, sofort das gleiche Volumen von Trypsin-Inhibitor und verreiben mehrmals.
5. Übertragen der Zellen in ein steriles 15 ml Falcon-Röhrchen. Das Röhrchen bei 500 xg für 5 min.
6. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml vorgewärmten ECCM.
7. Samen, die Zellen für den Ausbau der Kultur, imAlterung oder andere Tests.

Ergebnisse

Die phänotypische Charakterisierung von PVECs von Tag 1-12 wird durch Phasenkontrast-Lichtmikroskopie (Abbildung 2) gezeigt. Die Zellen in die Schale am Tag 1 zeigen charakteristische Morphologie der Zellteilung (2A) befestigt. Zwischen 5-8 Tage, PVECs Übergang von Kopfstein typisch für Endothelzellen und eher an seine in vivo-Zustand (2B und 2C) förmige Morphologie an der Spindel. Am Tag 12 der Kultur erreicht PVEC volle Zusammenfluss ...

Diskussion

PVEC sind mehr als physiologisch relevanten erwachsenen Gehirn Endothelzellen und ECs von anderen Gewebequellen für Studien, die sich auf neurovaskulären Interaktionen und auch therapeutisches Potenzial. Für PVEC Vorbereitung ist es wichtig, zu Beginn mit Dissektion um schneller zu arbeiten, um eine gute Rentabilität zu erreichen, da tote Zellen unspezifisch an CD31 MicroBeads binden. Darüber hinaus, wenn Einzelzellsuspension wird nicht vor der magnetischen Markierungsschritt erreicht, wird diese bei der Fehlersuche füh...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DNase I	Sigma	D-4527
Kollagen, Typ-1-Lösung aus Rattenschwanz	Sigma	C3867
DPBS	Quality Biologicals	114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
MS-Säule	Miltenyi Biotech	130-042-201
CD31 Mikrokügelchen	Miltenyi Biotech	130-097-418
MACS-Separator	Miltenyi Biotech	130-042-102
MACS Mehrständer	Miltenyi Biotech	130-042-303
Zellsieb 70 & Mikro; m	BD Bioscience	352350
Antibiotische und antimykotische Lösung	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
Kollagenase/Dispase	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
35 mm Kulturschale	BD Bioscience	353001
15 ml Falcon Tube	BD Bioscience	352097
50 ml Falcon Tube	BD Bioscience	352098
ECCM-Kit	BD Bioscience		355054-Kit enthält Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen, EGF und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor
Endothelzellwachstumsergänzung (EKGS)	BD Bioscience	354006
RBECGM-Zellanwendungen		R819-500
DMEM F12	Lebenstechnologien	10565-018
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061
Wasser in Gewebekulturqualität	Life Technologies	15230162
0,25% Trypsin	Life Technologies	15050
Sojabohnen-Trypsin-Hemmer	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 Zellmarkierungskit	Life Technologies	Q25021
CellLight Plasmamembran-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
Biotinylierter Isolektin B4 Antikörper	Sigma	L2140
Anti-Von-Willebrand-Faktor	Sigma	F3520
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
VECTASHIELD Hardset Eindeckmedien mit DAPI	Vector Laboratories	H-1500	nbsp;
Ketamin	Butler Schein Animal Health Supply	44028
Xylazine	Lloyd Laboratorien	1009
Stereomikroskop	Motic	SMZ-168
Hämozytometer	Fisher Scientific	267110
Inverses Mikroskop	Olympus CK-40	CK-40
Fluoreszenzmikroskop	Olympus FSX-100	FSX-100	nbsp;
Feine Pinzette	Roboz Chirurgisches Instrument	7 inox
Feine Mikrospitzenschere	Roboz Chirurgisches Instrument	RS5611

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