Wir beschreiben hier ein einfaches Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren zur Lokalisierung von Viren und Bakterien in Insekten-und Pflanzengeweben. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung von mRNA in ganze Berg und mikroskopische Abschnitte erweitert werden.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ein Name, der einer Vielzahl von Techniken, die üblicherweise für die Visualisierung Gentranskripten in eukaryotischen Zellen und kann weiter modifiziert werden, um andere Komponenten in der Zelle, wie eine Infektion mit Viren und Bakterien zu visualisieren verwendet gegeben. Räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Viren und Bakterien während der Infektion ist ein wesentlicher Schritt, die Genexpressionsexperimente wie Microarrays und RNAseq ergänzt in Reaktion auf verschiedene Reize. Das Verständnis der raumzeitlichen Infektionen mit diesen Mitteln ergänzt biologische Experimente auf das Verständnis ihrer Wechselwirkung mit zellulären Komponenten ab. Verschiedene Techniken zur Visualisierung von Viren und Bakterien, wie Reportergen-Systeme oder immunhistochemische Verfahren sind zeitaufwendig, und einige sind auf die Verwendung mit Modellorganismen und arbeiten mit komplexen Methoden. Fische, die RNA oder DNA-Spezies Ziele in der Zelle ist eine relativ einfache und schnelle mirthode zur Untersuchung der raum-zeitlichen Lokalisierung von Genen und für diagnostische Zwecke. Diese Methode kann robust und relativ einfach zu implementieren, wenn die Protokolle beschäftigen kurze Hybridisierungs, im Handel gekauft Sonden, die nicht teuer sind, sein. Dies ist besonders robust, wenn die Probenvorbereitung, Fixierung, Hybridisierung und mikroskopische Visualisierung beinhalten keine komplexe Schritte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien und Viren in Insekten-und Pflanzengeweben. Die Methode basiert auf einfachen Zubereitung, Fixierung und Hybridisierung von Insekten ganzen Halterungen und seziert Organe oder handgefertigte Anlagenteile, mit 20 Basenpaaren kurzen DNA-Sonden zur Fluoreszenzfarbstoffe auf ihren 5 'oder 3' konjugiert endet basiert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in einer Reihe von Insekten-und Pflanzengewebe aufgebracht wird, und kann verwendet werden, um die Expression von mRNA oder anderen RNA-oder DNA-Spezies in der Zelle zu analysieren.
Einleitung
Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Pflanze Viren und andere Pathogene mit infizierten Wirtspflanzen ist es wichtig, die Pathogene und ihre entsprechenden Nukleinsäuren in situ sichtbar, egal ob sie negative Auswirkungen auf ihre Wirte führen. Dies ist besonders wichtig bei der Untersuchung Pathogen Bewegung in und zwischen den Pflanzenzellen. In situ-Lokalisierung von Genprodukten des Pathogens ist ein wesentlicher Schritt, die andere Ansätze zur Untersuchung der Pathogenität Verfahren ergänzt. Viele Pflanzenkrankheitserreger, insbesondere Viren, werden von Insekten übertragen werden, mit komplexen und intimen Interaktionen mit ihren Vektoren. Lokalisierung dieser Viren in ihrer Vektoren ist wichtig für die Untersuchung der Pfad für die Übertragung, und die möglichen Wechselwirkungsstellen innerhalb des Vektors. Die Übertragung von einigen Insekten vectored Pflanzenviren wird durch Bakterien, die endosymbiontischen innerhalb dieser Insekten wohnen unterstützt. Um die Übertragung von diesen Pflanzenviren b besser studiereny deren Vektoren, ist es auch wichtig, die endosymbiontischen Bakterien im allgemeinen sichtbar zu machen, und die im Virus-Übertragung beteiligt sind, insbesondere. Kolokalisation der Viren-und Bakterien endosymbiontischen ist somit für die Untersuchung der möglichen Beziehungen zwischen diesen Organismen innerhalb ihrer Wirtsinsekten gewünscht. Abgesehen von der Übertragung des Virus, verschiedene Aspekte der Biologie der Insektenvektoren beeinflussen endosymbiontischen Bakterien, ist von hohem Interesse und Bedeutung somit räumliche Lokalisierung dieser Bakterien innerhalb von Insekten.
Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) ist die häufigste virale Krankheitskomplex der Kulturtomate weltweit 4.1. TYLCV ist eine Bast-Virus begrenzt und wird ausschließlich von der Weißen Fliege Bemisia tabaci 5,6 vektorisiert. Ein Modell, das die Translokation des Begomoviren in ihrer Weiße Fliege Vektoren beschreiben, wurde vorgeschlagen, 09.06. Zwei spezifische Barrieren aktiv während gekreuztten diese zirkulativen Übertragung: die Mitteldarm / Hämolymphe und die Hämolymphe / Speicheldrüse Barrieren. Dieser Übertragungsprozess wird angenommen, dass sie von unbekannten Rezeptoren, die das Virus-Kapsid erkennen vermittelt werden. TYLCV wird gedacht, um B. zu überqueren tabaci Darm 6,10 und wird durch die Primärspeicheldrüse 6 absorbiert, bevor es in die Anlage eingespritzt wird. In der Weißen Fliege Hämolymphe, interagiert mit einem TYLCV durch das Insekt Sekundär endosymbiontischen Bakterium produziert Hamiltonella GroEL Protein. Dieses Zusammenspiel sorgt für einen sicheren Transport von TYLCV in der Hämolymphe, und schützt sie vor Angriffen durch das Insekt Immunsystem 11. Hamiltonella und Portiera, die primäre Endosymbionten von Weißen Fliegen, sind in bacteriocytes untergebracht, Insektenzellen in der Hämolymphe und Haus endosymbiontischen 11 Bakterien. B. gefunden tabaci birgt zusätzliche endosymbiontischen Bakterien einschließlich Rickettsien, Arsenophonus, Wolbachia, und Fritschea, die innerhalb oder außerhalb der bacteriocytes lokalisiert werden kann, und haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Biologie der Insekten 12.
Mehrere Berichte haben versucht, die Lokalisierung von TYLCV in Pflanzen und Weißen Fliegen unter Verwendung der Zeit-und kostenaufwendig Protokolle wie Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Antikörper und RNA in situ auf mikroskopischer dicken Abschnitt 10,13 untersuchen, eine neue Studie beschrieben, die Lokalisierung von Pflanzenviren in ihren Anlage-und Vektor-Rechner mit einem einfachen Protokoll 14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Lokalisierung von TYLCV in B. tabaci seziert midguts und Speicheldrüsen und in Abschnitte von TYLCV-infizierten Pflanzen vorbereitet. Wir beschreiben die Lokalisation von Portiera, die primäre Endosymbionten von B. tabaci und seine Sekundär Endosymbionten Hamitonella, Rickettsien und Arsenophonus. Dieses Protokoll wird auf Verwendung von kurzen DNA-Sonden auf der Basis, dassfluoreszierend an ihrem 5'-Ende markiert ist und spezifisch an komplementäre Sequenzen in viralen oder bakteriellen Gen-Sequenzen zu hybridisieren. Die Probenverarbeitung relativ einfach ist, und das erhaltene Signal ist hoch spezifisch. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Viren, Bakterien und andere Krankheitserreger in der Pflanzen-, Tier-und Insekten Hosts zu lokalisieren, und kann weiter verwendet werden, um mRNA in einem bestimmten Gewebe zu lokalisieren.
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Protokoll
1. Allgemeine Whitefly, Pflanze, Virus und Vorbereitungen für die FISH-Analyse
- Rück B-und Q-Biotyp Weiße Fliegen auf Baumwolle Sämlinge (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) und innerhalb insektendichte Käfige und Wachstums Zimmer unter Standardbedingungen von 25 ± 2 ° C, 60% relativer Luftfeuchtigkeit zu halten und eine 14-Stunden Licht / 10-Stunden-Photoperiode dunkel.
- Führen Sie die PCR auf eine Infektion mit Endosymbionten mit Endosymbionten-spezifische Primer, wie oben beschrieben 15-19 testen.
- Kaufen Sie Tomatensetzlinge (Solanum esculentum cv. Beefsteak) von einer kommerziellen Kindergarten oder Pflanzentomatensamen.
- Pflegen Sie unter den oben beschriebenen gleichen Haltungsbedingungen, bis die Pflanzen erreichen die vier echten Blattstadium, das Alter am besten geeignet für Weiße Fliege-vermittelte Inokulation von TYLCV 15 (siehe Abschnitt 4.1).
2. Insekten-Handling, Fixierung, Design-Sonde, Hybridisierung und Visualisierung für EndoSymbionten FISH
- Sammeln Sie 10 erwachsenen Weißen Fliegen durch Aspiration von Baumwollpflanzen, oder wählen 10 3. oder 4. Larvenstadium Nymphen aus Baumwolle Blätter.
- Unmittelbar in Carnoy-Fixiermittel (Chloroform-Ethanol-Eisessig, 06.03.01, v / v) in Eppendorf-Röhrchen eintauchen. Fix für 2 h bis über Nacht (am besten über Nacht).
- Vollständig entfernen Sie die Fixiermittel und entfärben in 6% H 2 O 2 in Ethanol für 2 Stunden.
- Aufbewahren der Proben in absolutem Ethanol für mehrere Tage bis mehrere Wochen bei Raumtemperatur oder zum nächsten Schritt.
- Design Sonden komplementäre DNA Reverse Primer auf der Grundlage der 16S-ribosomalen RNA-Genen von jedem Bakterium. Für die Gestaltung der Sonden, nehmen Sie das Konto die gleichen Überlegungen für die Gestaltung von PCR-Primern. Verwenden Sie die Oligonukleotid-Sonden BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Cy3 RB1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'und 5'-ARS2 cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'für spezifische Ausrichtung der Portiera, Rickettsien, Hamilonella und Arsenophonus sind.
- Hybridisieren Proben über Nacht im Dunkeln in Hybridisierungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [w / v] Natriumdodecylsulfat, 30% [Vol / Vol] formamid), enthaltend 10 pmol fluoreszierenden Sonde pro ml . Kombinieren mehr als eine Sonde mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, falls erforderlich. Verwenden Sie nicht-infizierten Weißen Fliegen mit der gezielten Bakterium und kein-Sonde Proben als negative Kontrollen.
- Montieren Sie die Proben insgesamt, auf einen Objektträger, mit einer Flüssigkeit in Blocker enthalten Hybridisierungspuffer, Abdeckung mit einem Deckglas, Dichtung mit Nagellack, und Blick unter einem Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop.
3. Whitefly Orgel Dissection, Fixierung, Hybridisierung und Visualisierung für TYLCV FISH
- Sammeln erwachsenen Weißen Fliegen kontinuierlich auf TYLCV-infizierten Tomatenpflanzen durch Aspiration und ane aufgezogensthetize durch Bestrahlung mit Papiertuch mit Aceton getränkt. Expose Weiße Fliegen nur für 1-2 Minuten wie zu lange Einwirkung von Aceton Weiße Fliegen Gewebe zu beheben. Verwenden nonviruliferous Weiße Fliegen auf nicht-infizierten Tomatenpflanzen und keine Sonde Proben für Kontrollen aufgezogen, um spezifische Hybridisierung bestätigen.
- Berg Weiße Fliegen auf die Depression Objektträger für Orgel Dissektion mit einem Stereo-Mikroskop.
- Ziehen Sie die Insektenkopf von der prothorax sezieren und Speicheldrüsen in 1x PBS, ergänzt mit 1% Toluidinblau-Färbung für eine bessere Visualisierung, die aufgrund ihrer geringen Größe. Lassen Absorption der Fleck für 2-3 min.
- Ziehen Sie den Insekten auseinander an der Verbindungsstelle zwischen dem Brustkorb und den Bauch zu beobachten und zu vertreiben die Mitteldarm. Vertreibt die Inhalte des Bauches durch Drücken mit der Zange auf den Bauch Spitze.
- Entfernen Sie vorsichtig das PBS und Toluidinblau von erfolgreichen Dissektionen und sanft hinzufügen 300 ul Carnoy-Fixiermittel, die Organe für 5 min zu beheben.
- Add die Fixiermittel von einer Seite der gedrückten gut und nicht von oben nach unkontrollierte Bewegung der präparierten Organe zu verhindern. Nach Berühren der Fixiermittel, werden die Organe auf das Glas halten, und während des gesamten Prozesses sie sich nicht bewegen.
- Entfernen Fixiermittel und füge 500 &mgr; l Hybridisierungspuffer mit 10 pmol des fluoreszierenden DNA-Sonde 5'-Cy5-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', die komplementär zu einer Sequenz in TYLCV-Hüllprotein-Gen ergänzt.
- Hybridisierung über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln durch Inkubation der Objektträger mit der Probe in einem kleinen feuchten Kammer von kleinen Kunststoff-Box zusammen mit nassem Tuch Papier an der Unterseite.
- Nach der Hybridisierung, holen die Organe mit einem feinen Dissektionsinstrument und schnell verschieben Sie sie in einem frischen Mikroskop-Objektträger mit 30 ul der neuen Hybridisierungspuffer mit DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) ergänzt und mit Flüssigkeit Blocker enthalten.
- Decken Sie die Proben mit einem Deckglas, Dichtung Witzh Nagellack und Ansicht unter einem Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop.
4. Pflanzenbehandlung, Hand-Schnitte, Fixierung und Hybridisierung für TYLCV FISH
- Impfen Tomatenjungpflanzen mit TYLCV mit virustragender Weiße Fliege-vermittelte Impfung. Das Virus kann mit dieser FISH-Methode in Pflanzen symptomlos eine Woche nach der Impfung nachgewiesen werden. Typische Krankheitssymptome sichtbar sind 3 Wochen nach der Inokulation. Verwenden Sie nicht-infizierten Tomatenpflanzen und keine Sonde Proben für die Kontrollen an spezifische Hybridisierung bestätigen.
- Mit einem scharfen histologischen Rasierklinge für die Herstellung von Hand geschnitten 2-4 cm lange Längs-oder Querschnitte von Tomaten Stängel und Blätter.
- In Eppendorf-Röhrchen, fixieren Sie die Abschnitte in Carnoy-Fixiermittel für 2 Stunden, über Nacht bei Raumtemperatur.
- Entfernen Fixiermittel und bewahren Sie die Abschnitte in absolutem Ethanol für mehrere Tage bis mehrere Wochen bei Raumtemperatur, oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt.
- Waschen Sie die Abschnittedreimal, jeweils 1 min, in Hybridisierungspuffer.
- Hybridisieren die Abschnitte mit 500 ul Hybridisierungspuffer mit 10 pmol des fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonde 5'-Cy3-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', die komplementär zu einer Sequenz in TYLCV-Hüllprotein-Gen ergänzt.
- Dreimal mit je 1 min Waschen Sie die Abschnitte, in Hybridisierungspuffer.
- Berg ganze Abschnitte in Hybridisierungspuffer mit DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) ergänzt und mit Flüssigkeit Blocker enthalten, decken Sie mit einem Deckglas, mit Nagellack versiegeln und Blick unter einem Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop.
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Ergebnisse
Das System untersucht in diesem Manuskript ist in Abbildung 1 dargestellt und enthält eine infizierte Pflanze mit TYLCV, eine Erwachsenen-und eine Nymphe der Weißen Fliege B. tabaci und der inneren Anatomie der Weißen Fliege, die den Weg für TYLCV Translokation in der Insekten. Abbildung 2 zeigt Doppel FISH in einem erwachsenen Weißen Fliege für den primären Symbionten Portiera und der sekundären Symbionten Arsenophonus. Abbildung 3 zeigt Dopp...
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Diskussion
Die für die Lokalisierung eines Pflanzenvirus in ihrer Wirtspflanze und Insektenvektor und endosymbiontischen Bakterien in ihrem spezifischen Weiße Fliege Wirts hier beschriebene Protokoll kann zur Lokalisierung von anderen Viren in Pflanzen und auch im tierischen Gewebe angepasst werden. Weiterhin kann das Protokoll verwendet, um endosymbiontischen und pathogene Bakterien und andere Mikroorganismen in Pflanzen-und Tiersystemen zu lokalisieren. Die beschriebenen Verfahren beruhen auf einfache Konzept der Hybridisierung ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Forschung im Labor Ghanim wurde von Forschungsstipendium nicht unterstützt. 908-42.12/2006 von der Deutsch-Israelischen Stiftung (GIF), gewähren keine. IS-4062 bis 07 aus den Vereinigten Staaten und Israel Binationale Agrarforschung und Entwicklungsfonds (BARD) und Forschungsförderung nicht. 884/07 aus Israel Science Foundation (ISF) in MG
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fluoreszierend markiert Sonden | Metabion | 20 bp HPLC gereinigte | Sequenz vom Kunden entworfen |
| Toluidin blau | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma-Aldrich | L3771 | Molekularbiologie Grade |
| Formamid | Sigma-Aldrich | F9037 | Molekularbiologie Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molekularbiologie Grade |
| Eisessigsäure | Sigma-Aldrich | 320099 | Flüssigblocker in molekularbiologischer Qualität |
| Ted Pella Inc. | Artikel-Nr.: 22309 |
Referenzen
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