Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein einfaches Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren zur Lokalisierung von Viren und Bakterien in Insekten-und Pflanzengeweben. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung von mRNA in ganze Berg und mikroskopische Abschnitte erweitert werden.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ein Name, der einer Vielzahl von Techniken, die üblicherweise für die Visualisierung Gentranskripten in eukaryotischen Zellen und kann weiter modifiziert werden, um andere Komponenten in der Zelle, wie eine Infektion mit Viren und Bakterien zu visualisieren verwendet gegeben. Räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Viren und Bakterien während der Infektion ist ein wesentlicher Schritt, die Genexpressionsexperimente wie Microarrays und RNAseq ergänzt in Reaktion auf verschiedene Reize. Das Verständnis der raumzeitlichen Infektionen mit diesen Mitteln ergänzt biologische Experimente auf das Verständnis ihrer Wechselwirkung mit zellulären Komponenten ab. Verschiedene Techniken zur Visualisierung von Viren und Bakterien, wie Reportergen-Systeme oder immunhistochemische Verfahren sind zeitaufwendig, und einige sind auf die Verwendung mit Modellorganismen und arbeiten mit komplexen Methoden. Fische, die RNA oder DNA-Spezies Ziele in der Zelle ist eine relativ einfache und schnelle mirthode zur Untersuchung der raum-zeitlichen Lokalisierung von Genen und für diagnostische Zwecke. Diese Methode kann robust und relativ einfach zu implementieren, wenn die Protokolle beschäftigen kurze Hybridisierungs, im Handel gekauft Sonden, die nicht teuer sind, sein. Dies ist besonders robust, wenn die Probenvorbereitung, Fixierung, Hybridisierung und mikroskopische Visualisierung beinhalten keine komplexe Schritte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien und Viren in Insekten-und Pflanzengeweben. Die Methode basiert auf einfachen Zubereitung, Fixierung und Hybridisierung von Insekten ganzen Halterungen und seziert Organe oder handgefertigte Anlagenteile, mit 20 Basenpaaren kurzen DNA-Sonden zur Fluoreszenzfarbstoffe auf ihren 5 'oder 3' konjugiert endet basiert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in einer Reihe von Insekten-und Pflanzengewebe aufgebracht wird, und kann verwendet werden, um die Expression von mRNA oder anderen RNA-oder DNA-Spezies in der Zelle zu analysieren.

Einleitung

Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Pflanze Viren und andere Pathogene mit infizierten Wirtspflanzen ist es wichtig, die Pathogene und ihre entsprechenden Nukleinsäuren in situ sichtbar, egal ob sie negative Auswirkungen auf ihre Wirte führen. Dies ist besonders wichtig bei der Untersuchung Pathogen Bewegung in und zwischen den Pflanzenzellen. In situ-Lokalisierung von Genprodukten des Pathogens ist ein wesentlicher Schritt, die andere Ansätze zur Untersuchung der Pathogenität Verfahren ergänzt. Viele Pflanzenkrankheitserreger, insbesondere Viren, werden von Insekten übertragen werden, mit komplexen und intimen Interaktionen mit ihren....

Protokoll

1. Allgemeine Whitefly, Pflanze, Virus und Vorbereitungen für die FISH-Analyse

1. Rück B-und Q-Biotyp Weiße Fliegen auf Baumwolle Sämlinge (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) und innerhalb insektendichte Käfige und Wachstums Zimmer unter Standardbedingungen von 25 ± 2 ° C, 60% relativer Luftfeuchtigkeit zu halten und eine 14-Stunden Licht / 10-Stunden-Photoperiode dunkel.
2. Führen Sie die PCR auf eine Infektion mit Endosymbionten mit Endosymbionten-spezifische Primer, wie oben beschrieben ^15-19 testen.
3. Kaufen Sie Tomatensetzlinge (Solanum esculentum cv. Beefsteak) von einer kommerziellen Kindergarten oder ....

Ergebnisse

Das System untersucht in diesem Manuskript ist in Abbildung 1 dargestellt und enthält eine infizierte Pflanze mit TYLCV, eine Erwachsenen-und eine Nymphe der Weißen Fliege B. tabaci und der inneren Anatomie der Weißen Fliege, die den Weg für TYLCV Translokation in der Insekten. Abbildung 2 zeigt Doppel FISH in einem erwachsenen Weißen Fliege für den primären Symbionten Portiera und der sekundären Symbionten Arsenophonus. Abbildung 3 zeigt Dopp.......

Diskussion

Die für die Lokalisierung eines Pflanzenvirus in ihrer Wirtspflanze und Insektenvektor und endosymbiontischen Bakterien in ihrem spezifischen Weiße Fliege Wirts hier beschriebene Protokoll kann zur Lokalisierung von anderen Viren in Pflanzen und auch im tierischen Gewebe angepasst werden. Weiterhin kann das Protokoll verwendet, um endosymbiontischen und pathogene Bakterien und andere Mikroorganismen in Pflanzen-und Tiersystemen zu lokalisieren. Die beschriebenen Verfahren beruhen auf einfache Konzept der Hybridisierung .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fluoreszierend markiert  Sonden	Metabion	20 bp HPLC gereinigte	Sequenz vom Kunden entworfen
Toluidin blau	Sigma-Aldrich	89640
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich	L3771	Molekularbiologie Grade
Formamid	Sigma-Aldrich	F9037	Molekularbiologie Grade
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	Molekularbiologie Grade
Eisessigsäure	Sigma-Aldrich	320099	Flüssigblocker in molekularbiologischer Qualität
	Ted Pella Inc.	Artikel-Nr.: 22309