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Methodenartikel

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

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DOI:

10.3791/51031

⸱

2. Februar 2014

 , 
1Department of Dermatology, University Hospital Zurich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Prophylaktischen und therapeutischen Impfung oft nicht starke Immunantworten aufgrund Woche Entwässerung des Impfstoffs zu stimulieren, um Knoten und folglich schlechte Beteiligung von Immunzellen Lymphe. Durch direkte Injektion des Impfstoffes in Lymphknoten, sogenannte intralymphatischer Injektion, die Wirksamkeit des Impfstoffes kann stark verbessert werden, und Impfstoffdosen verringert werden.

Zusammenfassung

Impfstoffe werden typischerweise zur Stimulation von Immunantworten subkutan oder intramuskulär injiziert. Der Erfolg dieses erfordert effiziente Entwässerung des Impfstoffs Lymphknoten wo Antigen-präsentierenden Zellen mit Lymphozyten zur Erzeugung des gewünschten Immunantworten interagieren. Die Stärke und die Art der Immunantwort induziert auch von der Dichte oder Häufigkeit der Wechselwirkungen sowie der Mikroumgebung, insbesondere der Gehalt an Cytokinen. Da nur ein geringer Bruchteil der peripher injiziert Impfstoffe die Lymphknoten erreicht wurden Impfungen von Mäusen und Menschen durch direkte Injektion des Impfstoffes in die inguinalen Lymphknoten, dh intralymphatischer Injektion durchgeführt. Beim Menschen wird das Verfahren durch Ultraschall geführt. Bei Mäusen wird eine kleine (5-10 mm) Einschnitt in der Leistengegend des anästhesierten Tieren, die Lymphknoten lokalisiert und mit einer Pinzette immobilisiert und ein Volumen von 10-20 ul der Impfstoff unter Sichtkontrolle injiziert.Der Einschnitt wird mit einer einzelnen Masche mit chirurgischen Nähten verschlossen. Mäuse wurden mit Plasmid-DNA, RNA, Peptid-, Protein-, Partikel und Bakterien sowie Adjuvantien geimpft und starke Verbesserung der Immunantwort gegen alle Arten von Impfstoffen beobachtet. Die intralymphatischen Impfverfahren ist besonders geeignet in Situationen, in denen herkömmliche Impfung erzeugt unzureichende Immunität oder wenn die Menge der verfügbaren Impfstoff ist begrenzt.

Einleitung

Impfstoffe werden typischerweise zur Stimulation von Immunantworten subkutan oder intramuskulär injiziert. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert effiziente Entwässerung des Impfstoffs Lymphknoten, wo Antigen-präsentierenden Zellen mit Lymphozyten zur Erzeugung von T-und B-Zellantworten zu interagieren. Darüber hinaus ist die Stärke und die Art der Immunantwort induziert auch von der Dichte oder Häufigkeit solcher Wechselwirkungen sowie der Mikroumgebung selbst, insbesondere der Gehalt an Cytokinen. Da nur ein kleiner Bruchteil eines Impfstoffs in eine periphere Gewebe injiziert in einen Lymphknoten erreicht, Impfungen von Mäusen und Menschen durch direkte Injektion des Impfstoffes in den Lymphknoten, dem Ort wurden Immunantworten erzeugt werden, durchgeführt. Beim Menschen wird das Verfahren durch Ultraschall, ein Verfahren auch für die Verabreichung von Bildgebungsmittel zur Visualisierung und Diagnose in der lymphatischen Systems verwendet geführt. Bei Mäusen ist das Verfahren invasiv. Hier eine kleine (5-10 mm) incision in der Leistengegend des betäubten Tieren 1 erfolgt, wird der Lymphknoten lokalisiert und mit einer Pinzette immobilisiert, und ein Volumen von 10-20 ul der Impfstoff wird unter Sichtkontrolle injiziert; 10 ul zur ersten Injektionen verwendet und bei jungen Mäusen mit kleinen Lymphknoten, während 20 ul kann in Lymphknoten von älteren oder bereits grundiert Mäuse, die größere Lymphknoten injiziert werden. Der Schnitt kann mit einem einzelnen Stich mit chirurgischen Nähten geschlossen werden. Durch dieses Verfahren haben Mäuse mit Plasmid-DNA 2,3 Boten-RNA 4, 1,3,5,6-Peptid, Protein 7-10, 11-Partikel, Bakterien 12 sowie Hilfsstoffe 7,13 und einer starken Verbesserung der Immun geimpft Antworten gegen alle Arten von Impfstoffen beobachtet worden. Die intralymphatische Verfahren der Impfung besonders geeignet in Situationen, in denen herkömmliche Impfung produziert nicht genügend Immunität oder wo die Menge der zur Verfügung stehenden Impfstoff begrenzt ist, oder ist very teuer. Beim Menschen hat die intralymphatische Immunisierungsverfahren zur Allergiepatienten 14,15 oder um Patienten mit Krebs 16-21 angewandt. Obwohl die aktuelle Vorstellung ist, dass die intralymphatische Methode ist invasiv als andere injizierbare Methoden wie intramuskuläre und subkutane Injektionen, die Schmerzwahrnehmung nicht höher als nach einer Venenpunktion 15. Es wird erwartet, dass intralymphatische Impfung eine Alternative oder Ergänzung zu anderen Methoden der prophylaktischen und therapeutischen Impfungen besonders geworden. Dieser Artikel beschreibt im Detail, wie das Verfahren der intralymphatische Impfung bei Mäusen durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden von der Kantonstieragentur Zürich genehmigt und durchgeführt nach Schweizer Bundesrichtlinien und Richtlinien über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.

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Protokoll

1. Anästhesie Mäuse

  1. Bereiten Sie die Anästhetika durch Mischen von Ketamin (dissoziative Anästhetikum) und Xylazin (Sedativum und Analgetikum) in Kochsalzlösung. Die Konzentrationen von Ketamin und Xylazin in der fertigen Lösung werden 12,5 und 2 mg / ml.
  2. Injizieren Anästhetika an die Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung einer Spritze mit einer Nadel von 25-30 G. Verwenden Sie 0,1 ml/10 g Körpergewicht.
  3. Tragen Sie eine Augensalbe, um die Mäuse die Augen, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  4. Sicher, dass die Maus ausreichend durch Kneifen seinem Fuß-oder Zehen mit der Zange betäubt. Wenn die Maus nicht mit Reflexen auf die Prise zu reagieren, Operation fortzufahren. Wenn die Maus reagiert auf die Prise mit Reflexen oder Muskelkontraktionen, warten Sie 1-2 Minuten und wiederholen Sie den Pinch-Test. Wenn die Maus immer noch reagiert, ersetzen Sie die Maus mit einem neuen Tier, und wiederholen Sie die Prozeduren ab Schritt 1.2 ab.

2. Chirurgische ichncision der Leistengegend der Maus

  1. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken.
  2. Befeuchten Sie ein Leistenbereich mit Desinfektions Ethanol (70%). Um eine bessere Desinfektion bereitzustellen, kann der Leistenregion rasiert werden, um Fell vor der Desinfektion mit Ethanol zu entfernen.
  3. Nehmen Sie die Hinterbein und beugen das Hüftgelenk zu einem etwa 90 °-Winkel des Hüftgelenks zu produzieren.
  4. Mit einer gebogenen Pinzette microdissecting, nehmen Sie die Maus Haut in der Leistengegend, wo das Hüftgelenk gebeugt und leicht nach oben ziehen die benetzte Haut.
  5. Während bis halten die Haut mit der Zange, schneiden Sie einen kleinen Schnitt (<5 mm) durch die Haut mittels chirurgischer Schere.
  6. Setzen Sie die Spitze der geschlossenen Schere in der Schnittführung und den Schnitt weiter zu öffnen, durch das Öffnen der Schere, während es in den Schnitt halten. Dies bewirkt, dass die Haut zu reißen und sollte einen Durchmesser von weniger als 10 mm zu produzieren. Hinweis: Eine Kaltlichtquelle mit flexiblem Lichtleiter verwendet werden, um die Sichtbarkeit zu verbessern. In älterenMäuse, besonders Männern kann die Identifizierung des Lymphknotens schwierig, da viel Fettgewebe in der Leiste sein.

3. Intralymphatische Injection

  1. Bereiten Sie eine Spritze (0,5 ml oder weniger) mit einem 28-30 G Injektionsnadel, eine kurze Abschrägung kann bevorzugt sein, eine lange Kegel sein. Saugen Sie 10 ul der Impfstoff injiziert werden und sicherzustellen, dass die Spritze ist frei von Luft.
  2. Lokalisieren der Leistenlymphknoten mit Hilfe der gekrümmten Pinzette und der Spitze der geschlossenen Schere. Die Lymphknoten werden im Fettgewebe mehr weißlich grau angezeigt und kann weiter durch zu-und abführenden Kapillaren Betreten und Verlassen der Lymphknoten identifiziert werden.
  3. Immobilisieren, den Lymphknoten, indem sie zwischen den Zweigen der gebogenen Pinzette.
  4. Nehmen Sie die Spritze und die Nadel in den Lymphknoten mit der Kegel nach oben, machen, dass der ganze Kegel in den Lymphknoten.
  5. Spritzen Sie die Impfstoff (10 ul). Wenn die Lymphe Nickene Schwellungen (Sprengung), kann die Injektion erfolgreich angenommen werden. Wenn die Nadel nicht tief genug in die Lymphknoten platziert, können einige oder die gesamte Impfstoff austreten und nicht in die Lymphknoten. Wenn die Nadel zu tief eingeschoben, wird der Impfstoff subkutan injiziert unterhalb der Lymphknoten erscheinen. Im Falle der letzteren, wiederholen Sie die Injektion oder ersetzen Sie die Maus mit einem neuen unbehandelten Maus.

4. Das Schließen der Inzision durch Naht

  1. Öffnen Sie eine Packung von sterilen OP-Naht.
  2. Fassen der Nähnadel mit einem Nadelhalter an dem distalen Teil des Nadelkörpers. Ziehen Sie die Nadelhalter, indem Sie ihn bis zu den ersten Ratschen Fänge.
  3. Fassen der Haut auf einer Seite des Einschnitts mit einer Pinzette (je nach der Präferenz des Operateurs, Zahn-oder Zahn un-Zange oder Haken Haut verwendet werden können). Führen Sie die Nadel ca. 2-3 mm vom Rand des Einschnitts, der Eingabe von der Außenseite der Haut.
  4. Loosen Halt der Haut mit der Zange und erreichen die gegenüberliegende Seite des Einschnitts mit der Zange. Führen Sie die Nadel ca. 2-3 mm vom Rand des Einschnitts, der Eingabe von der Innenseite der Haut.
  5. Lösen Sie die Nadelhalter und fassen Sie den Nadelende mit der Zange. Ziehen Sie die Nadel mit der Lauffläche durch die Haut, so dass eine bequeme Länge der Lauffläche außerhalb des ersten Nadel Einfügemarke (wenn mehrere Mäuse behandelt werden sollen, lassen Sie einen kürzeren Ende, 5-10 Mäuse können mit einer Nähnadel betrieben werden / treten).
  6. Machen Sie den bevorzugten Knoten nach Standardprotokollen Chirurg. Eine Masche ist ausreichend, wenn der Schnitt nicht größer ist als 10 mm. Für größere Einschnitte, einen zweiten Stich.

5. Post-operative Behandlung

  1. Platzieren Sie die Maus in den Käfig und Abdeckung mit Gewebe warm zu halten. Bei der Behandlung von mehreren Mäusen, legen Sie sie nahe beieinander warm zu halten. Alternativ legen Sie die Mäuse an einem warmen Kissen, bis sie aufgewachtauf.
  2. Beachten Sie die Mäuse, bis sie aufwachen.
  3. Beachten Sie die Mäuse täglich mit Bezug auf die Heilung sowie andere klinische Symptome, wie Wundinfektionen gewickelt. Die Wunde wird in der Regel innerhalb von zwei Tagen ausreichend geschlossen und innerhalb von sieben Tagen nach dem Verfahren geheilt.

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Ergebnisse

Das Verfahren von intralymphatische Injektionen bei Mäusen trotz der chirurgischen Natur, ist einfach und relativ schnell. Eine ausgebildete Person kann das Verfahren in 3-4 min durchzuführen. Der Einschnitt, der mit einer Masche geschlossen heilt typischerweise innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1)

Intralymphatischer Impfung oder Immunisierung mit mRNA durchgeführt wurde, Plasmid-DNA, Peptiden, Proteinen, Viren und Bakterien. Fig. 2 veranschaulicht die Pro...

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Diskussion

Immunisierung und intralymphatische Immuntherapie hat sich gezeigt, zur Stimulation der Antikörperantworten und den beiden T-Zell-Reaktionen geeignet. Wie in diesem Video-Beitrag gezeigt hat, ist die intralymphatische Verfahren der Impfung eine schnelle und einfache Methode für die Stimulierung starke Immunantwort in Mäusen. Ein ausgebildeter Chirurg kann das Verfahren während 3-4 min durchzuführen. Die Sitzung kann auch zwischen zwei Chirurgen, wo man in der Regel tun, Anästhesie und die Naht und die zweite Chirurg mac...

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Offenlegungen

TMK ist als Erfinder der Patente, die sich mit intralymphatische Immuntherapie beim Menschen benannt. TMK ist wissenschaftlicher Berater und hat die Reisekosten von ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, Mannkind Corporation und XBiotech USA Inc. PJ hat kein Interesse Konflikt offen zu legen empfangen.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar für die experimentelle Hilfe bei der Entwicklung der Methode der intralymphatische Immunisierung bei Mäusen von Iris Erdmann, Barbara von Beust und Julia Maria Martínez-Gómez. Vielen Dank auch an Maggy Arras und Nikola Cesarovic, dass Sie uns nutzen ihre Operationssaal für diese Video-Produktion.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ketamin (Ketasol-100)Graeub AG, SchweizAnästhetika
Xylazin (Rompun)Bayer, DeutschlandAnästhetika
Viscotears Eye-GelNovartis, SchweizUm das Austrocknen der Augen während der Narkose zu verhindern.
BD Micro-Fine 0,5 mlBD Medical, Frankreich29 G Insulinspritzen mit fest angebrachten Nadeln
6-0 Dermalon Monofilament NylonCovidien, MA, USAFür Nähte (0,7 metrisch, 18 G, 45 cm, Blau)
Gebogene Pinzette, 4,5 ZollPolymed, SchweizZum Anschneiden und Halten von Lymphknoten
Gerade chirurgische Schere, 4,5 Zoll inPolymed, SchweizFür Schnitt
Nadelhalter, 5.5 inPolymed, SchweizZum Verschließen des Schnittes mit Naht

Referenzen

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