Methodenartikel

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte

DOI:

10.3791/51033

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23. August 2013

 ,  , 
1Plant Biology Division, The Samuel Roberts Noble Foundation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.

Zusammenfassung

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Nichtwirt Krankheitsresistenz von Pflanzen gegen bakterielle Erreger wird durch komplexe Verteidigung Bahnen gesteuert. Das Verständnis dieses Mechanismus ist für die Entwicklung von dauerhaften Krankheit-resistente Pflanzen gegen breites Spektrum von Krankheitserregern wichtig. Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-basierte Screening vorwärts Genetik ist ein sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von pflanzlichen Abwehr Gene verleihen Nichtwirtresistenz. Tobacco Rattle Virus (TRV)-basierte VIGS Vektor ist die effizienteste VIGS Vektor aktuell und wurde effizient genutzt auf endogene Zielgene in Nicotiana benthamiana Schweigen zu bringen.

In diesem Manuskript, zeigen wir eine vorausschauende Genetik Screening-Ansatz zum Schweigen einzelner Klone aus einer cDNA-Bibliothek in N. benthamiana und Bewertung der Reaktion Gen zum Schweigen Pflanzen für kompromittiert Nichtwirtresistenz gegen Nichtwirt Krankheitserreger Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea und X. campestris pv. vesicatoria. Diese bakterielle Pathogene sind ausdrücklich GFPuv Protein entwickelt und ihre grün fluoreszierende Kolonien können mit bloßem Auge unter UV-Licht in den Nichtwirt Pathogen inokulierten Pflanzen gesehen werden, wenn das Schweigen Zielgens in der Vermittlung Nichtwirtresistenz beteiligt ist. Dies erleichtert zuverlässigere und schnellere Identifizierung von Gen-Pflanzen anfällig für Schweigen Nichtwirt Krankheitserreger. Ferner kann aussichtsreicher Kandidat Gen-Informationen durch Sequenzierung der Anlage Geninsert in TRV Vektor bekannt sein. Hier zeigen wir die hohen Durchsatz Fähigkeit VIGS-vermittelte vorwärts Genetik, um Gene in Nichtwirtresistenz beteiligt sind. Etwa kann 100 cDNAs einzeln in etwa zwei bis drei Wochen und ihre Relevanz in Nichtwirtresistenz gegen mehrere bakterielle Erreger Nichtwirt zum Schweigen gebracht werden kann in einer Woche danach untersucht werden. In diesem Manuskript, aufzuzählen wir die einzelnen Schritte in diesem Screening beteiligt. VIGS-vermittelte vorwärts Genetik screening Ansatz kann nicht nur zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz beteiligt, sondern auch auf das Studium Gene verleihen mehreren biotischen und abiotischen Stress Toleranzen in verschiedenen Pflanzenarten verlängert werden.

Einleitung

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Nichtwirtresistenz ist der Widerstand aller Pflanzenarten gegen Rassen eines bestimmten Erregers 1,2. Dies verleiht breites Spektrum und dauerhafte Resistenz gegen Krankheiten bei Pflanzen 2,3. Allerdings ist der Mechanismus, insbesondere gegen bakterielle Krankheitserreger, nicht gut 4 verstanden. Screening nach Mutanten oder Pflanzen, die zum Schweigen gebracht Kompromiss Nichtwirtresistenz und hohen Durchsatz Transkript-Profiling zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene während Nichtwirtresistenz 5-9 zwei wichtige Ansätze zuvor zum Präparieren bakterielle Nichtwirtresistenz verwendet werden. Weil Nichtwirtresi....

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Protokoll

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1. Plant Growth and Target Gene Silencing

  1. Pflanzenwachstum Bedingungen:
    1. Sow N. benthamiana Samen auf erdlosen Blumenerde Mischung, Metro-Mix 350 und keimen die Samen in einer Klimakammer. Jede andere Boden-oder Boden-less Medium kann auch anstelle von Metro-Mix verwendet werden.
    2. Transplant drei Wochen alte Sämlinge in einzelne Töpfe und wachsen sie in einem Gewächshaus bei 21 ± 2 ° C zusammen mit anderen Wachstumsbedingungen wie in früheren Literatur 12. Zwei bis drei Tage nach dem Umpflanzen, können Pflanzen für TRV Impfung verwendet werden.
  2. Wachsende TRV2 Klone:
    TRV ist eine zweigeteilte V....

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Ergebnisse

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Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zur einfachen und genauen Identifizierung von Gen zum Schweigen N. demonstrieren benthamiana Pflanzen, die für Nichtwirtresistenz gefährdet sind. Es gibt vier große Schritte in diese Methodik. Erster Schritt ist einzeln Schweigen Vielzahl von Genen mit TRV-VIGS. Wir hatten Schweigen etwa 5000 Gene 6,18 über einen Zeitraum von ca. 1,5 Jahre unter Verwendung des Protokolls in Abbildung 1 dargestellt. Einige der Gen zum Schweigen Pf.......

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Diskussion

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Pflanze Immunität begrenzt das Wachstum von Krankheitserregern Nichtwirt und daher wenig oder gar keine grüne Fluoreszenz von Vektor-Kontrolle Anlage emittiert verlässt geimpft mit Nichtwirt Erreger unter langwelligen UV-Licht (3D). Allerdings, wenn ein Gen in Nichtwirtresistenz beteiligt Schweigen gebracht wird, bevorzugen die Gen-Pflanzen Schweigen das Wachstum der Erreger Nichtwirt und grüne Fluoreszenz zu sehen ist (Abbildung 3E). Dies ist das Grundprinzip des Verfahrens in diesem M.......

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Offenlegungen

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Dieses Projekt wurde von der Samuel Roberts Edle Foundation finanziert. Autoren danken Mss. Janie Gallaway und Colleen Elles für exzellente Pflanzenpflege und Frau Katie Brown für das Artwork. Wir würden auch gerne Mss danken. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda und Mr. Isaac Greenhut für technische Hilfe bei der Einrichtung dieses Protokoll.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-U-BodenplattenBecton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)35-3077
96-poliger Replikator EdelstahlNalge Nunc International (Naperville, IL, USA)250520
Hochintensitäts-UV-Inspektionslampen, Modell B-100apThomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)6283K50Hersteller-ID 95-0127-01
Stuart SC6 KoloniezählerBibby Scientific Limited, Staffordshire, UKSC6PLUS
Erdlose Blumenerdemischung, Metro-Mix 350SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Grundierungen:
attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT)
attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAAGCTGGGT)		Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)Kundenspezifisch synthetisiertes
MES, Monohydrat VWR international (Radnor, PA, USA)CAS Nr. 145224-94-8
Acetosyringon (Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenon) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)VIS-30

Referenzen

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  1. Heath, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).
  2. Mysore, K. S., Ryu, C. -M. Nonhost resistance: how much do we know. Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).
  3. Ellis, J.

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Schlagwörter

VIGS Forward Genetikvirusinduziertes Gene SilencingTobacco Rattle VirusGFP UV ExpressionPseudomonas syringaeGene Silencing ScreeningcDNA Bibliothek ScreeningPflanzenabwehrgenebakterieller Pathogen Assay

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