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Methodenartikel

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

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DOI:

10.3791/51055

⸱

27. Oktober 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Amöben Kokultur ein Zellkultursystem mit adhärenten Amöben, selektiv wachsen intrazelluläre Pathogene in der Lage, phagozytische Zellen wie Amöben und Makrophagen zu widerstehen. Es stellt somit ein wichtiges Instrument, um neue Infektionserreger entdecken. Amöben Bereicherung ermöglicht Entdeckung neuer Amöbenarten und ihrer spezifischen intrazellulären Bakterien.

Zusammenfassung

Die intrazelluläre Erreger wie Legionellen, Mykobakterien und Chlamydien-ähnlichen Organismen sind schwierig zu isolieren, weil sie schlecht oder gar nicht wachsen oft überhaupt auf selektiven Medien, die üblicherweise verwendet werden, um Bakterien zu kultivieren. Aus diesem Grund sind viele dieser Krankheitserreger wurden erst vor kurzem oder folgenden wichtigen Ausbrüche entdeckt. Diese Erreger sind oft mit Amöben, die als Wirtszelle dienen und ermöglichen es, das Überleben und das Wachstum der Bakterien verbunden. Wir wollen hier, um eine Demonstration von zwei Techniken, die Isolierung und Charakterisierung von intrazellulären Erregern in der klinischen oder Umweltproben vorhanden ermöglichen bieten: die Amöben Co-Kultur und die Amöben Bereicherung. Amöben Co-Kultur ermöglicht die Wiederherstellung der intrazellulären Bakterien, die durch Impfen der untersuchten Probe auf einem Rasen, der Amöben infiziert werden können und lysiert durch die in der Probe vorhanden sind intrazelluläre Bakterien. Amöben Anreicherung ermöglicht die Wiederherstellung von Amöben in einer klinischen oder Umweltprobe vorhanden. Thwird, kann auf Entdeckung von neuen Amöbenarten, sondern auch von neuen intrazellulären Bakterien wachsen speziell in diesen Amöben führen. Zusammen helfen diese beiden Techniken, um neue intrazelluläre Bakterien in der Lage, in Amöben wachsen zu entdecken. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Amöben infizieren und wider Phagozytose, intrazelluläre Bakterien könnten diese auch zu entkommen Phagozytose durch Makrophagen und somit sein pathogen für höhere Eukaryonten unterschieden.

Einleitung

Vor dem Aufkommen der molekularen Diagnostik, wurden in der Umwelt Nischen oder in klinischen Proben vorhandenen Mikroorganismen oft durch Kultivierung auf verschiedenen selektiven Medien, vor allem auf Agar in Petrischalen nachgewiesen. Der Phänotyp der Bakterienkolonien und ihre Stoffwechselaktivität erlaubt dann bakterielle Einstufung auf Artenebene. Brühe kann auch verwendet werden, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Allerdings haben beide Techniken erlauben die Gewinnung von Bakterien, die langsam oder gar nicht auf diesen Medien wachsen. Dies ist der Grund, warum molekulare Ansätze werden so heute weit verbreitet. Dennoch Nachweis von DNA bietet keine Ahnung, auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Darüber hinaus im Gegensatz zu Kultur, Molekularbiologie Ansätze nicht in einem Stamm, der ferner dadurch gekennzeichnet ist, führen.

Studieren Krankheitserreger, die schlecht wachsen auf festen Medien oder dass Bedarf Zellen wachsen ist kompliziert. Die meisten dieser "schwierig zu wachsen" Bakterien sind anspruchsvoll intrazellulären Bakterien, oft entdeckt und folgende große Ausbrüche, wie es der Fall bei Legionella pneumophila war gekennzeichnet. Dieses Bakterium wurde nach einem Ausbruch, die während eines American Legion Convention aufgetreten ist. So viel, wie 182 Menschen wurden infiziert und 29 starben an einer schweren Lungenentzündung 1,2. Es wurde später gezeigt, dass Amöben waren die natürlichen Wirte dieses Bakteriums und dass ihre Anwesenheit im Hotelklimaanlage und Wassernetze war der Ursprung des Ausbruchs der sogenannten Legionärskrankheit 3.

Amöben sind weltweit präsent und wurden aus Boden, Luft, Wasser und die Nasenschleimhaut von Freiwilligen (in 4 Bewertung) isoliert. Diese "freilebenden" Amöben sind in der Regel selbstständig Aufteilung in die Umwelt, sondern kann gelegentlich dringen zügigen Gastgeber fünf. Amöben ernähren sich von verschiedenen Mikroorganismen durch Phagozytose und anschließende lysosomale Verdauung durch hydrolases 6. Viele fakultativ oder obligat intrazelluläre Bakterien sind in der Lage, um die Verdauung zu widerstehen und damit zu infizieren und zu teilen in Amöben wie beispielsweise Legionellen, Chlamydien-verwandten Bakterien oder Mykobakterien (in 7 überprüft und 8). Freilebende Amöben wahrscheinlich eine wichtige potenzielle Reservoir für die intrazelluläre Bakterien, die noch nicht entdeckt wurden. Dies führte unsere Gruppe in Lausanne implementieren zwei Haupttechniken, die so genannte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, die verschiedenen Gruppen zu mehreren neuen obligat intrazelluläre Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltproben zu isolieren 9-15 erlaubt.

Da Amöben sind professionelle Phagozyten Beweidung auf Bakterien, könnte ein Bakterium in der Lage, die Phagozytose zu widerstehen und innerhalb dieser Protisten wachsen auch kolonisieren menschlichen Phagozyten und sein gegenüber Menschen pathogen. Dies wurde teilweise für einige Chlamydia-verwandten Bakterien, wie gezeigt Waddlia chondrophila. W. chondrophila nicht nur in Amöben, sondern auch in verschiedenen Zelltypen, wie Säuger Epithelzellen, Makrophagen und Fischzelllinien 16-18 wachsen. Die Amöben Kokultur erscheint auch zum Nachweis von intrazellulären Bakterien in klinischen Proben 19,20, darunter Stühle, die stark mit verschiedenen Bakterienarten 21 verunreinigt sind relevant.

Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, einschließlich (a) Behandlung von Umwelt-oder klinischen Proben, (b) das Wachstum von Amöben auf axenischen Medien und auf einem Bakterienrasen von Escherichia coli und (c) der Auswahl und Charakterisierung intrazelluläre Bakterien.

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Protokoll

1. Amöben Cokultur

1.1 Probenvorbereitung

  1. Umweltproben
    1. Wasserproben
      Filtern Sie die Wasserprobe (500 ml auf 1 L) durch einen 0,22 um Porengröße Membran. Dann schütteln Sie die Membran in Pages Amöbe Salzmedium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSO 4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4 und 136 mg KH 2 PO 4 in 1 l destilliertem Wasser).
    2. Feste Proben
      Resuspendieren festen Proben wie Erde oder Sand Proben und halbfesten Proben wie Belebtschlamm in destilliertem Wasser oder PBS und filtern sie durch einen 0,22 um Porengröße Membran. Dann schütteln Sie die Membran in PAS.
    3. Proben mit endogenen Amöben und Protozoen hoch belasteten
      Erste sedimentieren die Proben durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (180 xg) for 10 min oder filtern sie durch eine 5 um Porengröße Membran. Weiterzuverarbeiten den Überstand (bzw. Filtrat), wie in 1.1.1.
      Hinweis: Andere Dekontaminationsverfahren könnte verwendet werden, um weiter zu dekontaminieren Umweltproben werden: Erhitzen Sie die Probe bei 50 ° C für 30 min oder Behandlung mit sauren oder basischen Lösungen 14.
  2. Klinische Proben
    Verarbeitung klinischer Proben in Abhängigkeit von ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften. Filter oder Zentrifuge Flüssigkeiten zu großen Verunreinigungen zu entfernen. Resuspendieren festen Proben. Um Gewebe zu verwenden, schleifen sie zum Beispiel durch die Verwendung eines Dounce homogeneiser oder Glasperlen und Lyse der Zellen, die intrazellulären Bakterien zu befreien.

1.2 Amöben Vorbereitung

  1. Bouillon Vorbereitung
    Bereiten Sie die folgenden Medien: eine reiche Medien mit Pepton, Hefeextrakt und Glucose (PYG, 100 g Proteosepepton, 10 g Hefeextrakt, 4,9 g MgSO 4 • 7H 2O, 5 g Natriumcitrat • 2H 2 O, 0,1 g Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g KH 2 PO 4, 1,97 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g Glucose und 0,295 g CaCl 2 in 5 l destilliertem Wasser) und einem nicht-Nährmedium wie PAS für Acanthamoeba Spezies.
  2. Amöbenkultur
    1. Pflegen Amöben (vorzugsweise Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 oder A. polyphaga Linc-AP1) bei 25 ° C in Zellkulturflaschen mit 30 ml PYG Medium.
    2. Ernten Sie die Amöben durch kräftiges Schütteln der Flasche und Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 1.500 x g. Zweimal Waschen des Pellets mit PAS Medium. Zählen Sie die Zellen in einer Kova Rutsche und die Lautstärke anpassen, um eine Suspension von 5 x 10 5 Zellen pro ml zu erhalten.
    3. Übertragen Sie die Amöbensuspension in Mikroplatten. Verwenden Sie 1 ml pro Vertiefung für 12 - und 24-well Platten, 500 ul für 48-Well-Platten und 300 ul für 96-Well-Platten. Die Mikrotiterplatte für mindestens 2 h bei 25 ° C. Dies ermöglicht Sedimentation und Anhaftung der Amöben zum Boden jeder Vertiefung.

1.3 Cokultur

  1. Beispiel Impfung
    1. Inokulieren die Platte aus 2.3.3 mit seriellen Verdünnungen der Probe von 1.1 oder 1.2 in der Regel mit 10-fach-Verdünnungsreihe, beginnend mit 100 ul der unverdünnten Probe.
    2. Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte bei 1.800 g für 10 min auf Sediment auf dem Rasen Amöben die Mikroorganismen möglicherweise in der Probe vorhanden. Dies erhöht die Kontakt und Phagozytose von Mikroorganismen durch Amöben.
    3. Die Inkubation für 45 min bei 25 ° C und dreimal mit PAS durch Austausch der Medien mit frischen PAS. 1 ml pro Vertiefung von PAS mit oder ohne Zusatz von Antibiotika (Streptomycin, Penicillin, Gentamycin und / oder Vancomycin), abhängig von den bakAl-Spezies, nach dem gesucht werden.
    4. Die Mikrotiterplatte bei 32 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre, um Verkapselung der Amöben vermeiden. Beachten Sie jeweils auch täglich mit einem 20x-Objektiv, um die Anwesenheit von Bakterien eindringen und Lyse Amöben zu erkennen.
    5. Im Falle der Lyse führen eine Subkultur auf frischen Amöben durch Inokulation von 100 &mgr; l von Kokulturen auf einer Monoschicht von etwa 10 5 Amöben / cm 2. Um speziell isolieren eine gegebene Bakterienarten, impfen auch spezifische Agar-Medien für diese Bakterien (dh BCYE-Agar für Legionella spp.) Ausgelegt.
    6. In Abwesenheit von Lyse, nehmen Sie 100 ul Cokulturen vier bis sieben Tage nach der ersten Impfung und impfen einen frischen Amöben Kultur von 900 ul in einer 24-Well-Platte. Wenn schnelle Lyse der Amöben ohne Vermehrung von Bakterien beobachtet, könnte ein Virus vorhanden sein. In diesem Fall, filtern die Stand bei 0,22 um und verwenden Sie die Suspension filtriert, frische Amöben infizieren.

1.4 Bakterielle Isolierung und Charakterisierung

  1. Bakterielle Färbung
    Führen Cokulturen direkt auf Deckgläschen in 24-Well-Mikroplatten. Entfernen Sie das Medium und durchzuführen, Färbung oder Immunfluoreszenz.
    1. Geändert Romanowsky Färbung
      1. Lassen Sie das Deckglas trocken. Tauchen Sie die Deck fünf Mal in der Fixierungslösung (2 mg / L Fast Green in Methanol).
      2. Tauchen die Deck fünfmal in der Färbungslösung I (1,22 g / L Eosin G in Phosphatpuffer pH 6.6)
      3. Schließlich tauchen die Deckglas 5 Mal in der Farblösung II (1,1 g / L Thiazin in Phosphat-Puffer pH 6.6).
      4. Mit destilliertem Wasser spülen die Probe. Trocknen lassen und beobachten durch Mikroskopie.
    2. Ziehl-Neelsen-Färbung
      1. Lassen Sie das Deckglas trocken. Decken Sie die Probe mit Ziehl Fuchsin. Heizen Sie den Farbstoff mit einer Flamme, bis Dämpfe auftreten.
      2. Kühlen bei Raumtemperatur für mindestens 5 minund mit destilliertem Wasser spülen. Decken Sie die Probe mit 3% iger Salzsäure-Lösung in Isopropanol für 2 Minuten und spülen mit destilliertem Wasser.
      3. Abdeckung für 30 Sekunden mit Methylenblau und mit destilliertem Wasser spülen. Trocknen lassen und beobachten durch Mikroskopie 22.
    3. Gimenez-Färbung
      1. Vorbereitung einer Fuchsin-Stammlösung durch Vermischen von 100 ml 10% basisches Fuchsin (10 g basisches Fuchsin in 100 ml 95% Ethanol), 250 ml 4% ige wässrige Phenol und 650 ml destilliertem Wasser. Inkubieren bei 37 ° C für 48 Stunden vor dem Gebrauch.
      2. Lassen Sie das Deckglas zu trocknen und zu beheben, indem es durch Flamme. Decken Sie die Probe mit frisch gefiltert Basisfuchsinlösung (4 ml Fuchsin Stammlösung in 10 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,45) für 2 min.
      3. Mit Wasser spülen die Probe und Inkubation in Malachitgrün (0,8% in destilliertem Wasser) für 10 Sekunden. Wieder mit Wasser spülen und wiederholen Malachitgrün Färbung. Wieder mit Wasser spülen. Lassen Sie das Deckglas trocken, mount, und beobachten durch Mikroskopie 23.
    4. Immunfluoreszenz
      1. Befestigen Sie das Deckglas durch Inkubation in Methanol für 5 min oder mit Paraformaldehyd 4% für 10 min.
      2. Dreimaliges Waschen mit PBS und Inkubation für 2 h in Blockierungslösung (5% BSA, 0,1% Saponin in PBS) bei Raumtemperatur.
      3. Inkubieren Sie die Deckglas für 1 h in Blockierlösung Antikörper gegen den Mikroorganismus von Interesse angehoben enthält.
      4. Nachwaschen dreimal in PBS und Inkubation für 1 h mit einem gegen den primären Antikörper gerichtet und an einen Fluorophor gebunden sekundären Antikörper. Dreimal mit PBS waschen, montieren Sie die Deckglas und beobachten durch Fluoreszenzmikroskopie.
  2. DNA-Nachweis durch PCR
    Extrahieren DNA von 100 bis 200 ul Amöben Kokultur. Erkennen Mikroorganismen mit universelle Primer gezielt den 16S rRNA-Gen oder spezifische Primer für Arten von Interesse, wie Mykobakterien 24, Legionellen oder 25 Mitglieder des Chlamydiales 26.

2. Amöben Enrichment

2.1. Probenvorbereitung

Resuspendieren festen und halbfesten Proben in PAS durch Vortexen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei niedriger Geschwindigkeit (180 × g) für 10 min. Dies ermöglicht die Anreicherung von frei lebenden Amöben im Pellet. Der Überstand kann Amöben Co-Kultur und das Pellet für 21 Amöben Anreicherung verwendet werden.

2.2. Mittelzubereitung

  1. Hinzufügen von 1,5 g Agar zu 100 ml PAS und autoklaviert das Medium 15 min bei 121 ° C. Gießen Sie die warmen Medium in Petrischalen erstarren und lassen bei Raumtemperatur.
  2. Wachsen Escherichia coli (ATCC 25922) in LB oder Thioglykolat Brühe über Nacht bei 37 ° C Waschen Sie die Bakterien mit PBS resuspendieren und sie in PAS Medium. Verdünnen 10x in PAS und breitete 2-3 ml dieser Verdünnung auf eine PAS-Agar-Platte und trocknen lassen.

2.3. Beispiel Impfung

Fügen Sie einen Tropfen der Probe (oder ein Stück Filter) auf einer Seite der Platte und ließ es über der Petrischale zu fließen, um eine Linie in der Mitte der Schale zu bilden.

2.4. Amöbenwachstum und Amöben Subkultur

  1. Beachten Sie die Petrischale täglich. Wenn eine Amöbenmigrationsfront erkannt wird, schneiden Sie ein kleines Stück Agar bei der Migration vor und impfen NNA eine frische Petrischale mit einem Rasen von E. bedeckt coli.
  2. Wiederholen Sie die Reinokulation mehrmals in Abhängigkeit von der Reinheit der Probe, um eine reine Kultur eines bestimmten Stammes Amöben haben.

2.5. Amöben und Bakterien Charakterisierung

  1. Kratzen Sie die Zellen und resuspendieren sie in PAS.
  2. DNA zu extrahieren und zu bestimmen, die Identität von Amöben und / oder bakteriellen Symbionten durch PCR und Sequenzierung (16S rRNA-Amplifikation für Bakterien, resp. 18S rRNA für die Amöben und Sequenzierung, zum Beispiel).
  3. Verwenden Sie diese abgekratzt Zellen in PAS an die frische Amöben impfen und führen Sie eine Amöben Co-Kultur, um Bakterien möglicherweise in der Probe zu erkennen.

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Ergebnisse

Mit Amöben Co-Kultur und Amöben Anreicherung, wurden eine ganze Reihe von Umwelt-und / oder pathogene Bakterien entdeckt (Tabelle 1).

Amöben Co-Kultur wurde von unserer Gruppe und andere verwendet werden, um Umweltproben, Wasseraufbereitungsanlagen und Wasserverteilungssystemen zu analysieren. Ein breites Spektrum von Mikroorganismen könnten mit dieser Technik isoliert werden. Die häufigsten Bakterien durch Amöben Co-Kultur isoliert sind Mitglieder der Gattung Mycobacter...

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Diskussion

Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind effiziente Methoden, die die Trennung von vielen neuen Bakterien-und Amöbenarten erlaubt. Ergebnisse mit diesen Methoden erhaltenen bestätigen die allgegenwärtige Präsenz der beiden Amöben und Amöbe beständigen Bakterien in der Umwelt und am interessantesten in künstlichen Wassernetze, die als durch chemische Behandlungen wie Chlorung und Ozonierung gesteuert werden. Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind wesentliche Instrumente zu isolieren und kultivieren diese pote...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Wir danken Pr. Bernard La Scola für hilfreiche technische Ratschläge und interessante Diskussion über Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung. Wir danken auch Dr. Vincent Thomas für seine Hilfe bei der Umsetzung der Technik in unserem Labor.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GlukosemonohydratMerck, Darmstadt, Deutschland108342
0,22 μ m Porengröße MembranMerck Millipore, Darmstadt, DeutschlandSCVPU11RE
Proteose PeptonBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ211693
HefeextraktBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ212750
ZellkulturflaschenBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ353135
Kova SlideHycor, Indianapolis, IN87144
Zellkultur-MikrotiterplattenCorning Inc, Corning, NY3524
Diff-Quik FärbekitSiemens Healthcare diagn., München, Deutschland130832
Ziehl fuchsinFluka, St-Louis, MI21820
basic fuchsinSigma, St-Louis, MI857843
PhenolSigma, St-Louis, MIP1037Korrosives und mutagenes
MalachitgrünoxalatFluka, St-Louis, MI63160
Paraformaldehyd 16%ige LösungElektronenmikroskopie, Hatfield, PA15710
SaponinSigma, St-Louis, MI84510

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