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Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

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DOI:

10.3791/51060

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20. Dezember 2013

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1Department of Oncological Sciences, University of Utah

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Bestimmte genetische Störungen oder die Exposition gegenüber Toxinen können normale Entwicklungsprozesse stören, die zum Tod bestimmter Zelltypen führen. Die Analyse von aktivierter Caspase 3 durch Whole-Mount-Immunfluoreszenz in Zebrafischembryonen zeigt eine stadien- und gewebespezifische Lokalisation von Zellen, die spezifisch Apoptose durchlaufen.

Zusammenfassung

Whole-Mount Immunfluoreszenz zum Nachweis von aktivierter Caspase 3 (Casp3 Assay) ist nützlich, um Zellen zu identifizieren, die in Zebrafischembryonen entweder intrinsische oder extrinsische Apoptose durchlaufen. Die Whole-Mount-Analyse liefert räumliche Informationen über die Gewebespezifität apoptosierender Zellen, obwohl letztendlich eine Sektion und/oder Co-Markierung erforderlich ist, um die genauen Zelltypen zu bestimmen, die Apoptose durchlaufen. Der Casp3-Assay ist für die Analyse fixierter Embryonen zwischen dem 4-Zell-Stadium und 32 Stunden nach der Befruchtung optimiert und eignet sich für eine Reihe von Anwendungen, darunter die Analyse von Zebrafischmutanten und -morphanten, die Überexpression von mutierten und Wildtyp-mRNAs und die Exposition gegenüber Chemikalien. Im Vergleich zur Acridinorange-Färbung, bei der apoptotische Zellen in lebenden Embryonen innerhalb weniger Stunden identifiziert werden können, dauern Casp3- und TUNEL-Assays erheblich länger (2-4 Tage). Aufgrund der dynamischen Natur der Bildung und Clearance apoptotischer Zellen gewährleistet die Analyse fixierter Embryonen jedoch einen genauen Vergleich apoptotischer Zellen über mehrere Proben zu bestimmten Zeitpunkten. Wir haben auch festgestellt, dass der Casp3-Assay der Analyse apoptotischer Zellen mit dem TUNEL-Assay in Bezug auf Kosten und Zuverlässigkeit überlegen ist. Insgesamt stellt der Casp3-Assay einen robusten, hochgradig reproduzierbaren Assay dar, um apoptotische Zellen in frühen Zebrafischembryonen zu analysieren.

Einleitung

Hier beschreiben wir, wie man eine Ganz-Mount-Immunfluoreszenz in frühen Zebrafischembryonen durchführt, um Zellen mit aktivierter Caspase 3 zu erkennen (im Folgenden als Casp3-Assay bezeichnet). Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die relative Häufigkeit und Lokalisation apoptotischer Zellen im Zebrafisch vom 4-Zell-Stadium bis 32 Stunden nach der Befruchtung (hpf) zu identifizieren.

Sowohl intrinsische (Mitochondrien-vermittelte) als auch extrinsische (Todesrezeptor-vermittelte) apoptotische Signalwege vermitteln den Zelltod durch Aktivierung der Caspase-Kaskade1-2. Initiator-Caspasen existieren normalerweise als Monomere in der Zelle, und sobald sie als Reaktion auf ein pro-apoptotisches Signal zu signalwegspezifischen Plattformen rekrutiert werden, werden sie zu aktivierten Dimeren. Aktivierte Initiator-Caspasen (Caspase 9; intrinsischer Signalweg und Caspase 8; extrinsischer Signalweg) zielen dann auf die prädimerisierten, inaktiven Effektor-Caspasen (Caspase 3, 6, 7) ab, um sie zu spalten und aktive Heterotetramere zu bilden. Aktive Effektor-Caspasen spalten dann zelluläre Ziele mit spezifischen Tetrapeptidresten, um die spezifische proteolytische Zerstörung zu initiieren, die in den ultrastrukturellen Kennzeichen der Apoptose gipfelt, wie z. B. Chromatinkondensation und Membran-Blebbing, sowie in Zelloberflächensignalen, die die Verpackung der Zelle für die Verschlingung durch Phagozyten auf immunstumme Weise vermitteln. Es wird angenommen, dass aktive Effektor-Caspasen in Säugetierzellen die Mehrzahl der zellulären Spaltungsereignisse durchführen, die die Apoptose sowohl über den intrinsischen als auch über den extrinsischen Wegvermitteln 1-2. Das hierin beschriebene Protokoll verwendet einen Antikörper, der spezifisch an die gespaltene, heterotetramere Form von Caspase 3 bindet, jedoch nicht an das inaktive Caspase-3-Dimer.

Einer der Vorteile des Casp3-Assays ist die Möglichkeit, die räumliche Verteilung apoptotischer Zellen im Kontext des gesamten Embryos zu visualisieren. Daher können Gewebe von Interesse auf das Vorhandensein apoptotischer Zellen untersucht werden, und wenn Antikörper oder fluoreszierende transgene Stämme existieren, die bestimmte Zelltypen markieren, dann ist es möglich, die genaue Identität von Zellen, die Apoptose durchlaufen, durch Co-Markierungsexperimente zu bestimmen. Mehrere Gruppen haben aktivierte Caspase 3 erfolgreich als Marker für Apoptose in Zebrafischembryonen (z.B. 3-7) verwendet. Weitere Whole-Mount-Techniken zur Identifizierung apoptotischer Zellen in Zebrafischembryonen sind der TUNEL-Assay8 und die Acridinorange (AO)-Färbung9. Wir haben alle drei Methoden verwendet, um apoptotische Zellen in Zebrafischembryonen zu identifizieren4,6,10.

TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) Färbung nutzt die Vorteile des terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT) Enzyms, das verwendet wird, um Nukleotide an 3'-Hydroxylenden der DNA während der VDJ-Rekombination in Lymphozyten hinzuzufügen11. TdT fügt dUTP-Biotin zu freien 3'-Hydroxylgruppen in der DNA hinzu, die vor allem in apoptotischen Zellen reichlich vorhanden sind. Das Gewebe wird dann der Avidin-Peroxidase ausgesetzt, und apoptotische Zellen werden unter Zugabe des Substrats 3-Amino-9-ethylcarbazol gefärbt. Der TUNEL-Assay wurde verwendet, um eine umfassende Analyse apoptotischer Zellen während der Embryonalentwicklung in Wildtyp-Zebrafischgeweben durchzuführen12. Ähnlich wie der Casp3-Assay wird der TUNEL-Assay nur an fixierten Embryonen durchgeführt. Wir haben festgestellt, dass der Casp3-Assay konsistenter und kostengünstiger ist als der TUNEL-Assay.

AO-Färbung wurde erstmals als Mechanismus zur spezifischen Identifizierung apoptotischer Zellen in Drosophila13 beschrieben. AO färbt sowohl das Zytoplasma als auch den Zellkern apoptotischer, aber nicht nekrotischer Zellen. Es ist allgemein bekannt, dass AO Nukleinsäuren14 bindet, und es wird angenommen, dass dies für die Kernfärbung verantwortlich ist. AO färbt jedoch nicht das Chromatin lebender Zellen; Vielmehr scheint es, dass spezifische Veränderungen, die während der Apoptose auftreten, die Interkalation und Färbung kondensierter apoptotischer Kerneermöglichen 15. Die AO-Färbung hat den Vorteil der schnellen apoptotischen Analyse lebender Embryonen. Die Dokumentation der Proben muss jedoch aufgrund der dynamischen Natur der apoptotischen Zellbildung und -clearance schnell durchgeführt werden. Auf der anderen Seite liefert die gleichzeitige Fixierung aller Proben eine Momentaufnahme der Apoptose zu einem bestimmten Zeitpunkt über alle Proben hinweg und unterliegt nicht dieser zeitlichen Variablen. Da die Analyse apoptotischer Zellen durch AO-Färbung nicht mit fixierten Embryonen kompatibel ist, ist der Casp3-Assay für Experimente vorzuziehen, bei denen eine fotografische Dokumentation und/oder Quantifizierung über mehrere Proben erforderlich ist.

Protokoll

1. Vorbereitung von Lösungen

  1. Bereiten Sie 500 ml 1x PBST (1x PBS, 0,1 % Tween-20) vor und sterilisieren Sie den Filter. 1x PBST kann unbegrenzt bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden, solange keine Anzeichen von Bakterienwachstum vorhanden sind.
  2. ACHTUNG: Bereiten Sie 50 ml 4%iges Paraformaldehyd (PFA) in einer chemischen Haube vor, indem Sie pulverförmiges PFA in 1x PBS bei 60 °C für 1 Stunde auflösen und zum Schutz vor Licht mit Aluminiumfolie abdecken. 1 Monat lang bei 4 °C oder 2 Jahre bei -20 °C lagern.
  3. Bereiten Sie 500 ml frische 1x PDT (1x PBST, 0,3 % Triton-X, 1 % DMSO) vor. 1x PDT kann bei 4 °C bis zu einem Monat gelagert werden.
  4. Bereiten Sie 50 ml Blockierungspuffer vor (1x PBST, 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 2 % Rinderserumalbumin). 10 ml Aliquote herstellen und bis zu 1 Jahr bei -20 °C lagern. Nach dem Auftauen kann der Blockierungspuffer bis zu 48 Stunden bei 4 °C gelagert werden.
  5. 100 ml 4%ige Methylcellulose durch Erhitzen von 30 ml Wasser auf 80 °C zubereiten. 4 g Methylcellulose in das heiße Wasser geben und mit einem Rührstab auf einer raumwarmen Rührplatte mischen. Das gründliche Mischen dauert in der Regel zwischen 4 Stunden und über Nacht. Den Rest des (nicht erhitzten) Wassers dazugeben und 1 Stunde bei 4 °C erhitzen. Bei RT lagern.
  6. Wenn Sie Embryonen zwischen dem Schwanzknospenstadium und 32 hpf verwenden, bereiten Sie 50 ml 10 mg/ml Pronase vor und lagern Sie sie bis zu 1 Woche bei 4 °C. Andernfalls lagern Sie sie in 10 ml Aliquoten bei -20 °C für bis zu 1 Jahr.
  7. 50 ml 100%iges Methanol auf -20 °C stellen.
  8. Bereiten Sie 60x Eiwasser zu, indem Sie 280 g Instant Ocean Sea Salt in 2 L destilliertem Wasser auflösen (wie in Westerfield16). Bereiten Sie 1x Eiwasser zu, indem Sie die 60x Brühe in entionisiertem Wasser verdünnen.

2. Vorbereitung von Embryonen

  1. Sammeln Sie Zebrafischembryonen in einer Petrischale in 1x Eiwasser zwischen dem 4-Zell-Stadium und 32 hpf.
    1. Bei Embryonen zwischen dem 4-Zellen- und dem Schwanzknospenstadium fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
    2. Bei Embryonen zwischen dem Schwanzknospenstadium und 32 hpf entfernen Sie Chorionen, indem Sie den Embryonen 100 μl 10 mg/ml Pronase in 10 ml 1x Eiwasser hinzufügen.
    3. Hinweis: Die Pronaseaktivität kann zwischen den Chargen unterschiedlich sein. Daher sollte die endgültige Pronasekonzentration für die Dechorionierung optimiert werden, wenn neue Chargen erhalten werden.
        Bei
      1. Raumtemperatur 30 min inkubieren lassen.
      2. Gießen Sie Eiwasser / Pronaselösung in den Abfall und fügen Sie langsam wieder frisches 1x Eiwasser hinzu.
      3. Spülen Sie 2x ab, indem Sie vorhandenes Eiwasser (und frei schwimmende Chorionen) abgießen und vorsichtig neues Eiwasser hinzufügen.
      4. Hinweis: Die meisten Chorionen sollten an dieser Stelle entfernt werden. Saugen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette sanft auf und ab, bis die restlichen Chorionen entfernt sind.
  2. Übertragen Sie bis zu 40 Embryonen in ein 1,5-ml-Röhrchen. 2 Mal mit 1 ml 1x PBST spülen.  
  3. Entfernen Sie PBST und lassen Sie die Flüssigkeit knapp über den Embryonen (ca. 100 μl Volumen sollten im Röhrchen verbleiben). 1 ml 4% PFA hinzufügen. Legen Sie die Röhrchen auf die Seite (so dass die Embryonen über die Länge des Röhrchens verteilt sind) in einen Behälter geeigneter Größe, um den Transport zu erleichtern (z. B. eine Petrischale oder einen Pipettenkasten), und legen Sie ihn über Nacht oder bis zu einer Woche bei 4 °C auf eine sanfte Wippe.  
    1. Bei Embryonen zwischen dem 4-Zellen- und dem Schwanzknospenstadium dechorionieren Sie die fixierten Embryonen manuell mit einer Pinzette.

3. Immunfluoreszenz-Verfahren

  1. Legen Sie die Eileiter so in ein Röhrchengestell, dass alle Embryonen auf den Boden des Röhrchens sinken. Entfernen Sie PFA (in einen geeigneten Abfallbehälter) und lassen Sie die Flüssigkeit knapp über der Höhe der Embryonen zurück. Nach der Fixierung (Schritt 2.3) sollten Embryonen niemals an der Luft ausgesetzt werden, um eine Verfärbung von Antikörpern im Hintergrund zu vermeiden.
  2. 1 ml eiskaltes 100%iges Methanol (zum Permeabilizieren) tropfenweise hinzufügen. Die Embryonen sind nun nach der Fixierung zerbrechlich, und es muss besonders darauf geachtet werden, dass sie bei allen nachfolgenden Entnahmen/Zugaben von Flüssigkeiten nicht in den Schlauch taumeln. Legen Sie die Schläuche auf die Seite und stellen Sie sie 2 Std. lang bei -20 °C auf. Alternativ können die Embryonen bis zu 24 Stunden bei -20 °C belassen werden.
  3. Lege die Eileiter in ein Gestell, um die Embryonen am Boden der Röhre zu entnehmen. Entfernen Sie das Methanol und lassen Sie die Flüssigkeit knapp über dem Niveau der Embryonen.
  4. Vorsichtig 1 ml 1x PDT zugeben. Entfernen Sie die PDT und fügen Sie 1 ml frische 1x PDT hinzu. Legen Sie die Röhren auf die Seite und schaukeln Sie 30 Minuten lang sanft bei RT. Entfernen Sie die PDT und wiederholen Sie die 30-minütige Wäsche mit frischer PDT.
  5. Entfernen Sie die PDT, bis sich die Flüssigkeit knapp über dem Niveau der Embryonen befindet, und fügen Sie 500 μl Blockierungspuffer hinzu.
    1. Legen Sie die Embryonen auf die Seite in einen Transportbehälter und stellen Sie sicher, dass die Embryonen nicht mehr als 2/3 der Länge des Eileiters nach oben wandern. Andernfalls verfangen sich die Embryonen im Deckel des Röhrchens und außerhalb der Flüssigkeit.  
    2. Stellen Sie den Transportbehälter mit den Schläuchen vorsichtig für 1 Std. auf eine sehr sanfte Wippe bei RT.
  6. Stellen Sie die Röhrchen aufrecht in ein Röhrchengestell und öffnen Sie alle Röhrchen, um zu prüfen, ob Embryonen am Deckel kleben. Bei Röhrchen mit Embryonen auf dem Deckel schließen Sie den Deckel und schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig mit der Hand, um alle Embryonen wieder in die Flüssigkeit zu bringen.
  7. 1 μl antiaktivierter Kaninchen-Caspase-3-Antikörper (1:500 Verdünnung) zugeben.
    1. Wenn Sie ein Co-Labeling-Experiment durchführen, fügen Sie einfach die entsprechende Verdünnung des zweiten nicht aus Kaninchen gewonnenen Antikörpers zusätzlich zum antiaktivierten Caspase-3-Antikörper hinzu.
  8. Legen Sie die Embryonen vorsichtig auf die Seite und wiegen Sie sie 2 Stunden lang vorsichtig bei Raumtemperatur. Alternativ können die Embryonen über Nacht bei 4 °C inkubiert werden.
  9. Stellen Sie die Röhrchen in ein Röhrchengestell. Block-/Antikörperlösung entfernen. 1 ml 1x PDT hinzufügen. Achten Sie darauf, das Röhrchen von Hand umzudrehen, um alle Embryonen zu sammeln, die am Deckel des Röhrchens festsitzen. Öffnen Sie dann alle Röhrchen, um sicherzustellen, dass alle Embryonen aus dem Deckel entfernt wurden.
  10. Wiederholen Sie Schritt 3.4.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.10, ersetzen Sie jedoch den antiaktivierten Caspase-3-Antikörper durch die geeignete Verdünnung eines anti-Kaninchen-Fluorophor-konjugierten Antikörpers, der blaues Licht absorbiert und grünes Licht emittiert. Hier kann jedoch jeder Fluorophor-konjugierte Antikörper mit einem vom Benutzer bevorzugten Absorptions-/Emissionsspektren verwendet werden. Nach der Zugabe des Sekundärantikörpers ist es wichtig, die Embryonen für den Rest des Assays im Dunkeln zu halten. Decken Sie den Transportbehälter während der Inkubationsschritte mit Alufolie ab, aber machen Sie sich keine Gedanken über die Lichteinwirkung beim Wechsel der Puffer.
    1. Wenn Sie ein Co-Labeling-Experiment durchführen, fügen Sie in diesem Schritt einfach die entsprechende Verdünnung eines komplementären Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers hinzu.
    2. Hinweis: Wenn der Benutzer aktive Caspase 3 mit Gfp-exprimierenden Zellen co-markieren möchte, sollte hier auf den antiaktiven Kaninchen-Antikörper Caspase 3 ein nicht grün fluoreszierender anti-Kaninchen-Sekundärantikörper folgen, und auf den Anti-GFP-Antikörper sollte ein grün fluoreszierender Nicht-Kaninchen-Sekundärantikörper folgen. Dies verhindert Verwechslungen, wenn nach der Fixierung von Embryonen eine gewisse Gfp-Fluoreszenz sichtbar bleibt.

4. Analyse apoptotischer Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie

  1. Analysieren Sie Embryonen in 1x PDT in einer kleinen Petrischale oder Glasspotplatte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit dem entsprechenden Lichtfilter. Wenn Positivkontrollen eine helle Fluoreszenz mit minimalem Hintergrund aufweisen, fahren Sie mit Schritt 4.2 fort. (Wenn nicht, konsultieren Sie den Abschnitt zur Fehlerbehebung in der Diskussion und wiederholen Sie das Protokoll mit neuen Embryonen.) Embryonen können bei 4 °C in 1x PDT bis zu 48 Stunden gelagert werden.
  2. Gießen Sie 4 % Methylcellulose in eine 3,5 cm große Petrischale, gerade genug, um den Boden der Schale zu bedecken. Alternativ kann eine Glasspotplatte oder ein Vertiefungsobjektträger mit einem großen Tropfen Methylcellulose in der Vertiefung verwendet werden. Saugen Sie die Embryonen vorsichtig vom Boden des Röhrchens in eine saubere Transferpipette und übertragen Sie sie zur Visualisierung auf die Petriplatte.
  3. Richten Sie einen Embryo von Interesse für die Dokumentation mit einer abgewinkelten Sonde aus. Es wird wahrscheinlich eine gewisse Variabilität zwischen Embryonen aus derselben Probe geben, daher ist es wichtig, Bilder zu machen, die die Fluoreszenzintensität und das Muster darstellen, die bei der Mehrheit der Embryonen aus dieser Probe beobachtet wurden. Die Dokumentation sollte innerhalb von 48 Stunden nach Abschluss des Assays durchgeführt werden, um eine Anhäufung von unspezifischer Hintergrundfluoreszenz zu verhindern. Reste von 4 % Methylcellulose beeinträchtigen nicht die nachfolgenden PCR-Reaktionen, die für die Genotypisierung von Embryonen erforderlich sind.
  4. Hinweis: Um die Immobilisierung eines Embryos in einem bestimmten Winkel zu erleichtern, ist es hilfreich, den Embryo vorsichtig auf den Boden der Schale zu schieben, so dass das Eigelb oder ein anderer Teil des Embryos (je nach gewünschter Aussicht) auf dem Boden der Schale aufliegt. Verwenden Sie dann die Sonde, um entweder den Embryo oder die unmittelbar umgebende Methylcellulose zu bewegen (während Sie gleichzeitig unter dem Mikroskop sichtbar machen), um den gewünschten Winkel für die Dokumentation zu erhalten.

Ergebnisse

Der Casp3-Assay liefert eindeutige Hinweise auf apoptotische Zellen vom 4-Zell-Stadium bis 32 hpf. Abbildung 2A zeigt, dass die Injektion von Embryonen mit hohen Konzentrationen von mRNA, die für potente pro-apoptotische BH3-only-Proteine wie Bim oder Noxa kodiert, bereits im 4-Zell-Stadium der Entwicklung schnell zur Bildung von aktivem Caspase-3 führt. Der embryonale Tod tritt anschließend innerhalb von 1 Stunde ein.4. Beachten Sie, dass die Fluoreszenzintensität moderat ist, die Ergebnisse jedoch eindeutig. In späteren Entwicklungsstadien ist die Fluoreszenzintensität stärker. Beispielsweise Abbildung 2B zeigt helle, aktiv-Caspase-3-positive Zellen in kugelstadiumsartigen Embryonen, die mit mäßig toxischen Konzentrationen4 mRNA, die für das pro-apoptotische Protein kodiert, injiziert wurden nur-bh3 Gen Puma. Boten-RNA, die das anti-apoptotische Protein bcl-2 Gen wurde koinjiziert, um zu beweisen, dass die Injektion von Puma mRNA induziert Apoptose über den intrinsischen, mitochondrienvermittelten Weg.

Die IR-induzierte Apoptose in Zebrafischen erfordert die p53-vermittelte Transkription von BH3-Only-Genen wie puma5-6. Die Verzögerung der IR-induzierten Apoptose in Abbildung 3 entspricht dem Erfordernis einer p53-vermittelten Transkription.

Das Casp3-Protokoll sollte ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis ergeben. Abbildung 4 vergleicht das optimale Ergebnis des Casp3-Assays mit zwei häufig auftretenden suboptimalen Ergebnissen, die entstehen, wenn kritische Schritte beeinträchtigt sind (siehe Diskussion): Ein schwaches Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund von Hintergrundfluoreszenz im Tiergewebe und Fluoreszenz des Dottermaterials, die von dem Signal von Interesse ablenkt.

Ko-Labelfarbenexperimente unter Verwendung transgener GFP-exprimierender Linien approximieren Gewebe, die Apoptose durchlaufen (Abbildung 5).

Ablaufdiagramm der Embryo-Immunfärbung: Methanol-Permeabilisierung, Antikörperbehandlung, Abbildungsverfahren.
Abbildung 1. Vereinfachtes Schema des Casp3-Protokolls.

Zebrafish embryonic development, 4-cell and sphere stages, bright-field microscopy with gene expression analysis.
Abbildung 2. (A) Analyse der Apoptose in Embryonen des 4-Zell-Stadiums. Die Embryonen wurden im Ein-Zell-Stadium der Entwicklung mit 50 pg mRNA, die für codiert, injiziert. egfp (Kontrolle) oder pro-apoptotisch nur bh3 Gene bim und Noxa. Im 4-Zell-Stadium (ca. eine Stunde nach der Injektion, hpi) wurden die Embryonen mittels Immunfluoreszenz auf aktiviertes Caspase 3 analysiert. Bim und noxa mRNA induzieren eine schnelle Apoptose in Zebrafisch-Embryonen unmittelbar nach der Injektion, was, falls die Embryonen sich weiterentwickeln dürfen, bis 2 hpi zum Tod führt. Zur Vergleich wird ein Helligkeitsfeldbild eines Wildtyp-Embryos im 4-Zell-Stadium gezeigt. (B) Analyse der Apoptose in Kugelstadium-Zebrafischembryonen. Embryonen wurden im Ein-Zell-Stadium der Entwicklung mit mRNA injiziert, die entweder 50 pg kodiert egfp (Kontrolle), 5 pg Puma plus 45 pg egfp (puma), oder 5 pg Puma plus 45 pg bcl-2 (bcl-2). Im Sphärenstadium (ca. 4 hpi) wurden die Embryonen mittels des Casp3-Assays analysiert. Sowohl laterale als auch Ansichten vom Animalepol werden gezeigt, um apoptotische Zellen sichtbar zu machen. Die Wiederherstellung der durch puma induzierten Apoptose durch bcl-2 zeigt an, dass die Injektion von Puma mRNA induziert Apoptose spezifisch über den intrinsischen, mitochondrienvermittelten Weg. Zur Vergleich wird ein Hellfeldbild eines wildtypischen Embryos im Sphärenstadium gezeigt.

Sequentielle embryonale Entwicklung, Fluoreszenzbildgebung; Embryonalentwicklungsstadien 0–3 hpfIR, 17–20 hpf.
Abbildung 3. Zeitlicher Verlauf der durch ionisierende Strahlung (IR) induzierten Apoptose zwischen 17 und 20 hpf. Zebrafischembryonen wurden mit 8 Gy IR bei 17 hpf bestrahlt und mittels Casp3-Assay nach 0, 1,5, 2 und 3 Stunden post-IR (hpIR) analysiert. Die Pfeile bei 20 hpf zeigen die Anreicherung apoptotischer Zellen im Rückenmark nach 3 hpIR. Zur Vergleichbarkeit ist ein Hellfeldbild eines 17 hpf alten Embryos dargestellt.

Analyse der Embryofluoreszenz; vergleichende Mikroskopiebilder von Kontroll- und behandelten Proben.
Abbildung 4. Optimale und suboptimale Ergebnisse der Casp3-Immunfluoreszenz bei 27 hpf alten Embryonen. Zebrafish-Embryonen wurden mit 15 Gy entweder bestrahlt oder nicht bestrahlt (Kontrolle) und anschließend mittels des Casp3-Assays analysiert. Die „optimale“ Gruppe zeigt ideale Ergebnisse, bei denen apoptotische Zellen intensiv fluoreszieren, während nicht-apoptotische Zellen und das Eigelb eine minimale Hintergrundfluoreszenz aufweisen. Pfeile in der Gruppe „Hintergrundfluoreszenz in der Kontrolle“ kennzeichnen eine übermäßige Hintergrundfluoreszenz im Tiergewebe unbehandelter Embryonen. Sterne in der Gruppe „Eigelbfluoreszenz“ zeigen übermäßige unspezifische Fluoreszenz im Eigelb.

Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie; Expression von α-Gfp, α-Casp3; Nachweis von Zellapoptose; Überlagerungsdiagramm.
Abbildung 5. Doppelfärbungsexperimente zur Abschätzung der Gewebespezifität der strahleninduzierten Apoptose. Die transgene Linie Tg(olig2:egfp)vu12 markiert Motoneurone und Oligodendrozyten17, während die Linie Tg(elavl3:egfp) alle differenzierenden Neurone markiert18. Jede transgene Linie wurde mit 15 Gy bei 24 hpf bestrahlt und 3 Stunden danach mittels primärer Antikörper gegen GFP (Maus) und gegen aktives Caspase 3 (Kaninchen) sowie anschließend mit grün- bzw. rotfluoreszierenden sekundären Antikörpern analysiert. Eine Vergrößerung des Rückenmarks (dorsal zum Ende der Dotterverlängerung von 27 hpf, 3 h nach Bestrahlung) wird gezeigt. Apoptotische Zellen scheinen teilweise in beiden Populationen Tg(elavl3:egfp) und Tg(olig2:egfp)vu12 lokalisiert zu sein (siehe Pfeilspitzen in der Überlagerung), was darauf hindeutet, dass Neurone und Oligodendrozyten empfindlich gegenüber strahleninduzierter Apoptose sind.

Diskussion

Der Casp3-Assay, wie er in diesem Protokoll vorgestellt wird, soll einfach sein und sollte, wenn er wie hierin angewiesen durchgeführt wird, zu einem robusten Signal-Rausch-Verhältnis führen. Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören die Verwendung von frischem 1x PDT-Puffer für alle Waschvorgänge, eine ausreichende Länge der Waschschritte im PDT-Puffer nach der Inkubation der Embryonen im primären Antikörper, die schonende Behandlung der Embryonen und die sorgfältige Abrechnung aller Embryonen in Röhrchen oder Transferpipetten während aller Schritte des Protokolls.

Unserer Erfahrung nach sind die folgenden Gründe die häufigsten Gründe für das Fehlen eines Positivkontrollsignals: 1) 1x PBST wird während der Waschschritte durch 1x PDT ersetzt, 2) 1x PDT-Puffer ist älter als einen Monat, 3) es wurde der falsche Sekundärantikörper verwendet, 4) Embryonen sind älter als 32 hpf und/oder 5) mehr als 40 Embryonen wurden in einem Röhrchen analysiert. Wenn inkonsistente Ergebnisse oder Variabilität innerhalb der Proben auftreten, liegt dies in der Regel daran, dass 1) nicht darauf geachtet wurde, dass alle Embryonen während des Eingriffs zu jeder Zeit in Flüssigkeit blieben, und/oder 2) die Embryonen nicht unter ausreichendem Schaukeln inkubiert wurden. Hohe Pegel von Hintergrundrauschen werden oft als allgemeiner Fluoreszenzschleier dargestellt, der im gesamten tierischen Gewebe des Embryos entsteht (siehe Abbildung 4, "Hintergrundfluoreszenz"). Ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis kann entstehen, wenn 1) die Embryonen nach der Verabreichung des Primärantikörpers nicht ausreichend lange gewaschen wurden und/oder 2) die Embryonen länger als die empfohlene Zeit in PFA oder Methanol belassen wurden. Wenn die Embryonen am Ende des Assays nicht intakt bleiben: 1) Die Lösungen wurden nach der Fixierung mit PFA nicht tropfenweise zugegeben und/oder 2) die Wippengeschwindigkeit während der Inkubationsschritte war zu hoch eingestellt.

Die dem Casp3-Assay inhärente Whole-Mount-Visualisierung ist hilfreich für die räumliche Lokalisierung apoptotischer Zellen. Die Gewebespezifität ist jedoch ungefähr und wird wahrscheinlich auf Co-Markierungstechniken (siehe Abbildung 5) und/oder Embryonenschnitten beruhen, um die genaue Identität von Zellen zu bestimmen, die sich einer Apoptose unterziehen. In dem hier beschriebenen Protokoll ist die Co-Markierung durch die Anforderung des spezifischen Kaninchen-Antikörpers begrenzt, der in unserem Assay verwendet wird. Wir haben keinen kommerziell erhältlichen anti-aktivierten Caspase-3-Antikörper identifiziert, der apoptotische Zellen spezifisch durch Immunfluoreszenz in Zebrafischembryonen markiert. Daher sind zelltypspezifische Antikörper, die in Kaninchen gezüchtet werden, nicht mit dem Casp3-Assay für Co-Markierungsexperimente kompatibel. Eine Alternative besteht darin, einen TUNEL-Assay durchzuführen, bei dem ein von der Maus abgeleiteter Antikörper zur Markierung apoptotischer Zellen erforderlich ist6. Wir haben jedoch festgestellt, dass der TUNEL-Assay, der an Zebrafischembryonen durchgeführt wurde, sehr empfindlich auf eine Reihe von Variablen in der Reaktion reagiert, einschließlich der Konzentration des TdT-Enzyms, der Dauer der Inkubation des Embryos im TdT-Enzym und der Anzahl der pro Röhrchen vorhandenen Embryonen (unsere unveröffentlichten Beobachtungen). Daher ist es schwierig, ein Gleichgewicht der Enzyme zu finden, das eine konsistente Interpretation der Ergebnisse ermöglicht. Daher ist eine bevorzugte Alternative die Analyse apoptotischer Zellen in transgenen Zebrafischembryonen, die ein Fluorophor (mit kommerziell erhältlichen robusten Antikörpern) wie GFP in einem bestimmten Zelltyp exprimieren. Anschließend können Co-Labeling-Experimente mit einem primären Maus-Anti-Gfp-Antikörper durchgeführt werden, gefolgt von einem grün fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper. Ein Beispiel finden Sie in Abbildung 5 .

Während das Casp3-Protokoll eine robuste, zuverlässige Färbung apoptotischer Zellen in Embryonen vom 4-Zell-Stadium bis 32 hpf ermöglicht, ist es über 32 hpf hinaus nur begrenzt anwendbar, da die Antikörper nicht in der Lage sind, die Haut älterer Embryonen zu durchdringen. Zusätzliche Techniken zur Permeabilisierung der Embryonen, einschließlich der Behandlung mit Kollagenase, Trypsin, Aceton oder Ethanol, könnten möglicherweise optimiert werden, um diesen Assay an die Analyse älterer Embryonen anzupassen. Die Färbung mit AO kann jedoch an lebenden Zebrafischen bis zu einem Alter von mindestens 5 Tagen durchgeführt werden9. Somit umgeht der AO-Assay die Restriktion des embryonalen Stadiums und stellt einen Schnelltest zur Analyse apoptotischer Zellen (1-2 Stunden) dar. Im Gegensatz dazu erfordert der Casp3-Assay eine Fixierung der Embryonen über Nacht und dauert 2-4 Tage, bis er abgeschlossen ist. Zu den Nachteilen des AO-Assays gehört, dass eine effiziente fotografische Dokumentation von Embryonen bei mehreren Proben eine Herausforderung darstellen kann, da die Embryonen lebendig sind und apoptotische Zellen schnell gebildet und gereinigt werden. Dies kann besonders problematisch sein, wenn Embryonen montiert werden müssen, um eine bestimmte Ausrichtung für die Dokumentation zu erhalten. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die AO-Färbung nach der Fixierung mit PFA abnimmt, so dass sie nicht mit Co-Markierungsexperimenten mit Immunfluoreszenz kompatibel ist.

Die quantitative Analyse von aktivierter Caspase 3 kann mit Hilfe von Softwareprogrammen durchgeführt werden, die die Fluoreszenzintensität dokumentierter Bilder messen. Wir haben die IR-induzierte Apoptose im Nervengewebe quantifiziert, eine Methode, die wir an anderer Stelle ausführlich beschriebenhaben 10. Je nach Experiment kann die quantitative Analyse von aktivierter Caspase 3 weitere Manipulationen von Embryonen erfordern, wie z. B. Flat-Mounting, um die richtige Ausrichtung für eine optimale Gewebeanalyse zu erhalten. Darüber hinaus hängt die Linearität der Analyse von der Dicke des zu analysierenden Gewebes ab. Zum Beispiel analysierten wir die IR-induzierte Apoptose im Nervengewebe, indem wir die Immunfluoreszenz der aktiven Caspase 3 im flachen Nervengewebe des Rückenmarks und nicht im neuronendichten Gewebe des Gehirns maßen4,10.

Unserer Erfahrung nach ist der Casp3-Assay der robusteste und zuverlässigste Assay für die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen zwischen dem 4-Zell-Stadium und 32 hpf, wenn die Analyse viel Zeit für die Dokumentation erfordert. Wenn geeignete Antikörper oder transgene Linien zur Identifizierung spezifischer Zellen verfügbar sind, ist dieser Assay auch sehr gut für die Co-Markierung geeignet, um die spezifischen Zelltypen zu identifizieren, die Apoptose durchlaufen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung erfolgte durch die Huntsman Cancer Foundation (CJ, CT), das Stipendium der American Cancer Society #RSG-13-025-01-CSM (RS) und das NIH T32 GM007464-36 (SS).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml Tuben Denville Scientificc2170Ungefährlich. Ähnliche 1,5 m lange Kunststoffrohre reichen aus.
10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma AldrichP5493Ungefährlich.
a-aktivierter-human-Caspase-3-AntikörperFisher ScientificBDB559565Kann beim Einatmen oder Verschlucken schädlich sein.
a-GFP monoklonaler Antikörper (Maus)Life Technologies33-2600Kann beim Einatmen oder Verschlucken schädlich sein.
a-HuC/HuD humanes neuronales Protein, Maus IgG2b, monoklonal 16A11 - UNCONJLife TechnologiesA21271Kann beim Einatmen oder Verschlucken gesundheitsschädlich sein.
Albumin, BSA-Hitzeschockisolierung bei RindernAmrescoCAS 9048-46-8Nicht gefährlich. Kann auch über Bioexpress erworben werden: 0332-1006
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Maus IgGLife TechnologiesA11029Verwendung bei 1:200 Verdünnung. Kann beim Einatmen oder Verschlucken schädlich sein.
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgGLife TechnologiesA21206Verwendung bei 1:200 Verdünnung.  Kann beim Einatmen oder Verschlucken schädlich sein.
Alexa Fluor 568 Esel Anti-Kaninchen IgGLife TechnologiesA10042Verwendung bei 1:200 Verdünnung.  Kann beim Einatmen oder Verschlucken schädlich sein.
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma AldrichD8418Entzündlich.
Dumont #5 Inox Pinzette (Standardspitzen/gerade)Fine Science Tools11251-20Sharp!
FBS HyClone Fötales Rinderserum Thermo-FisherSH3091003ungefährlich.
Fisher Scientific Ocelot RotatorFisher Scientific05-450-21Jeder Rotator mit manueller Drehzahlregelung ist geeignet.
Instant Ocean Aquarium Salz Petco1373684ungefährlich.
Methanol (acetonfrei)Sigma AldrichM1775Entzündlich: giftig durch Einatmen, Verschlucken und Berührung.
MethylcelluloseSigma AldrichM0387-1006Nicht gefährlich.
ParaformaldehydSigma AldrichP6148Entzündlich: giftig durch Einatmen, Verschlucken und Kontakt.
Sonde (abgewinkelt 80 kurz/15,5 cm/0,15 mm Spitzendurchmesser)Fine Science Tools10140-02Scharf!
PronaseRoche11459643001ungefährlich.
Pyrex SpotplatteFisher Scientific13-748BUngefährlich.
Transferpipetten, Samco AllzweckThermo-Scientific204Ungefährlich.
Triton X-100Sigma AldrichT8787Reizend: gesundheitsschädlich durch Verschlucken oder Kontakt.
Tween-20Sigma AldrichP7949Ungefährlich. Weitere Marken sind VWR #97063-872.

Referenzen

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