Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

Zusammenfassung

Die Speiseschaltung in Drosophila melanogaster-Larven serviert ein einfaches aber leistungsstarkes Modell, das Änderungen in der Zuführungsrate, mit Veränderungen in der neuronalen Schaltkreise stomatogastrischen korreliert werden können. Diese Schaltung wird der zentrale serotonerge Neuronen, die Projektionen auf die Mundhaken sowie die Vorderdarm senden zusammen.

Zusammenfassung

Das serotonerge Speiseschaltung in Drosophila melanogaster-Larven können auf neuronale Substrate von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung der Schaltung untersuchen. Der funktionalen Ausgang der Schaltung, Zuführen, Änderungen in der Architektur des neuronalen stomatogastrischen System visualisiert werden. Fütterungsverhalten kann durch die Beobachtung der Rate von Zurückziehen der Mundhaken, die Innervation vom Gehirn empfangen aufgezeichnet werden. Bewegungsapparat Verhalten wird als physiologischer Kontrolle für die Fütterung verwendet, da Larven nutzen ihre Mundhaken zu durchqueren über eine Agar-Substrat. Veränderungen im Ernährungsverhalten kann mit der axonalen Architektur der Neuriten korreliert werden innervieren den Darm. Immunhistochemisch ist es möglich, diese Veränderungen zu visualisieren und zu quantifizieren. Unsachgemäße Handhabung der Larven während Verhalten Paradigmen Daten zu ändern, da sie sehr empfindlich auf Manipulationen. Die richtige Abbildung der Neuriten Architektur innervierder Darm ist kritisch für eine genaue Quantifizierung der Anzahl und Größe von Krampfadern sowie der Umfang der Verzweigungsknoten. Analyse der meisten Schaltungen erlauben nur zur Visualisierung von Neuriten Architektur oder Verhaltenswirkungen, jedoch erlaubt dieses Modell ein, um das Ausgangssignal der Funktionsschaltung mit den Störungen der neuronalen Architektur korrelieren.

Einleitung

Drosophila ist ein extrem leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung neuronalen Schaltkreis Entwicklung aufgrund der schnellen Generationszeit, geringe Kosten experimentellen, und die Fähigkeit, genetische und Umweltfaktoren zu manipulieren und zu kontrollieren. Neurogenese, neuronale Wegfindung und Synapsenbildung zwischen Mensch und Drosophila konserviert, daher die Mechanismen in die Erstellung, Pflege und Änderung von neuronalen Schaltkreisen als gut erhalten.

Klassische Neurotransmitter wie Serotonin (5-Hydroxytryptamin oder 5-HT) als Wachstumsfaktoren vor der Annahme ihrer Rolle als Signalmoleküle in der reifen neuronalen Schaltkreis ^1-3 dienen Frühere Studien haben gezeigt, dass die Konzentration von 5-HT während der Embryogenese gestört verändern die Konnektivität von reifen Neuronen ^4. Andere haben gezeigt, dass die Anwendung der Eileiter 5-HT zu kultivierten Neuronen unter Helisoma Neuritenwachstum sowie Synaptogenese ^5-7. Drosophila, Entwicklungs 5-HT Pegel umgekehrt proportional zur Anzahl und Größe Krampfadern sowie der Grad der aborization, entlang der Länge der Neuriten aus dem ZNS ⁸ vorsteht, um den Vorderdarm zusammen.

Serotonergen Neurotransmission wurde gezeigt, Fressverhalten in verschiedenen Arten modulieren, einschließlich Drosophila ^8-9. Die Speiseschaltung in Drosophila ist eine relativ einfache Schaltung, die als Modell verwendet werden kann, um den Funktionsausgang (Fütterung) mit Veränderungen in der Entwicklung der axonale Projektionen aus dem Gehirn zu den Vorderdarm korrelieren. Schoofs et al. haben gezeigt, dass Drosophila Larvenfraß wird durch zentrale Mustergeneratoren, die die Muskulatur beeinflussen ¹⁰ geregelt. Während die spezifische Anatomie muskulös ist nicht vollständig verstanden hat es sich gezeigt, dass die Antennennerv, Oberkiefernerv und prothoracic Zubehör Nerven sind für die Muskel Ziele in die beteiligten verantwortlichFressverhalten. Die meisten Daten, die die Muskulatur und Nerven Anatomie der wirbellosen Fütterung auf Calliphora-Larven beschränkt.

Die Zufuhrrate des zweiten Larvenstadium kann durch Zurückziehen der cephalopharyngeal Skleriten (Mundhaken) bewertet und ist reproduzierbar und mit hohem Durchsatz. Die cephalopharyngeal Platten werden durch Fasern aus zentralen 5-HT-Neuronen über den frontalen innerviert. Das Drüsen oder Vorderdarm, wird durch serotonerge Fasern (recurrens Nerv), die im Mitteldarm fasciculate und sind verantwortlich für die Kontraktionen des Vorderdarm (Abbildung 1) ^11-12 innerviert. Änderungen der axonalen Verzweigung, und die Anzahl und Größe von Krampfadern entlang der Länge der Neuriten, kann mit immunhistochemischen Techniken quantifiziert werden. Manipulieren von neuronalen 5-HT während der Entwicklung, entweder direkt oder indirekt, kann die Funktions Ausgang dieser Speiseschaltung, die beurteilt werden können, und korreliert mit den Veränderungen in der Morphologien änderngy des Neuriten-Architektur.

Protokoll

1. Pflege der Bevölkerung Käfige

1. Pflegen Bevölkerung Käfigen bei 25 ° C auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus. Solange die Kontroll-und Versuchsgruppen sind mit den gleichen Lichtbedingungen ausgesetzt ist, kann diese Technik in einem Standard-Laborbedingungen durchgeführt werden.
2. Lassen Weibchen Eier über Nacht auf Apfelsaft-Agar-Platten zu legen.
3. Sammeln frisch geschlüpften Larven durch Aufrechterhalten Platten mit neu abgeschiedenen Eier bei 25 º C für 24 Stunden. Setzen Sie einen kleinen Klecks Hefe in der Mitte der Platte zu geschlüpften Larven zu gewinnen.
4. Sammeln ^1. Larvenstadium, die in der Mitte der Platte Apfelsaft in den Hefe-Paste migriert haben. Verwenden Sie eine Metallspachtel, um es in einem frischen Apfelsaft Platte übertragen. Zusätzliche Hefe Paste kann um sicherzustellen, dass angemessene Ernährung, bis die Tests durchgeführt werden. Traubensaft Platten können auch anstelle von Apfelsaft-Platten verwendet werden.
5. Erhalten späten ^2. und frühen ^3. Larvenstadium larvae indem ^1. Larvenstadien bis zum Alter von 40 bis 48 Stunden. Innerhalb dieses Bereichs die Futterraten sind konstant ^13. Alter kann durch Untersuchung der Mundhaken bestätigt, da es deutliche Veränderungen in dieser Struktur mit jeder Häutung der Larven werden.
6. Späten ^2. und frühen ^3. Larvenstadium werden für Tests durch vorsichtiges Verhalten und umfassend Waschen Apfelsaft Platten mit Wasser und Sammeln der Larven auf einem Mesh-Filter gesammelt. Die Larven werden dann mit einer Agar-Platte übertragen.
7. Alle Analysen sind parallel mit Kontroll-und Versuchstieren durchgeführt.

2. Behavioral Paradigm - Locomotion

1. Legen Sie eine einzelne ^3. Larvenstadium auf einem 2% Agar-Substrat in einem 100-mm-Gewebekulturschale und lassen die Larve für 30 sec akklimatisieren. Die Larven nutzen ihre cephalopharyngeal Skleriten (Mundhaken), um ihre Körper über die Oberfläche des Agar-Substrat zu treiben. Dieser wird auf einer separaten Platte getan, weil icht ist schwieriger, die Kontraktionen Körper in der Hefe-Lösung visualisiert das Tier ist fast die gleiche Farbe wie der Hefe.
2. Beobachten und Aufzeichnen jedes posterior nach anterior Bewegung über dem Substrat für einen Zeitraum von 1 min. n = 20 für jeden Genotyp. Nicht mehr als 10 Tieren pro Platte sollte untersucht werden.

3. Verhalten Paradigm - Fütterung

1. Mit stumpfen Pinzette Nr. 5 Inox, transferieren es vorsichtig die ^3. Larvenstadium von der Bewegungs Agar-Platte in der Mitte von einer Agar-Platte gefüllt mit 5 ml 2% aktiviert Bäckerhefe Lösung überlagert. Stellen Sie sicher, dass die Lösung homogen ist wie die Hefe im Laufe der Zeit zu begleichen. Wenn in der Hefe-Lösung, werden Larven weitgehend vorhanden und Futtermitteln zu bleiben, erleichtert die Beobachtung des Verhaltens. Die Rate der Mund Haken Kontraktionen korreliert direkt mit der Menge der Nahrung aufgenommen ^14.
2. Ermöglichen Larve für 30 sec akklimatisieren.
3. Beobachten und notieren Sie die Anzahl derMund Haken Kontraktionen für einen Zeitraum von 1 min. n = 20 für jeden Genotyp.

4. Larven Gut Dissektionen

1. Machen Sie eine 4% EM-Grade-Formaldehyd-Fixierungslösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und in einen 3-Spot-und Glas.
2. Sorgfältig sezieren wandern späten ^3. Larvenstadium Larven Mut in einem 3-Loch-Glasschale mit 1x PBS-Lösung, so dass Sie sicher, dass jedes Mal, dass die Drüsen bleibt intakt. Mit einer Pinzette, halten Sie das hintere Ende, und mit der anderen halten die Mundhaken. Halten Sie das hintere Ende unbeweglich, ziehen Sie vorsichtig an den Mund Haken, um Zugriff auf die Eingeweide zu gewinnen. Entfernen Sie alle dazugehörigen Gewebe (Speicheldrüsen, Gehirn, Fettkörper, etc.), dann übertragen Sie einander gut an die 3-Well-Platte, die die Formaldehyd-Lösung. Wander ^3. Larvenstadium verwendet werden, da in diesem Stadium der Entwicklung der Larve aufhören Zuführen in Vorbereitung auf Puparium und die Drüsen aus Hefe gelöscht.
3. Mut Inkubation bei 4 ° C über Nacht in einem undurchsichtigen Gewebekultur-Box.
4. Vor dem Entfernen Formaldehyd-Fixierungslösung aus Brunnen, entfernen Sie die Magen caeca und Clip den Mitteldarm ~ 150 um ² aus dem Drüsen so dass Projektionen deutlich ohne Behinderung angesehen werden.
5. Entfernen Formaldehyd fix aus den Vertiefungen und ersetzen mit 1x PBT (1x PBS, 0,1% Protease-freien Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100)-Pufferlösung. Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Zeigen Gewebeproben auf einem mechanischen Dreh dabei Wäschen.
6. Inkubieren bei 4 ° C für 1 h in 10 ^-6 M 5-HT an Serotonin-Signalisierung erweitern. Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Konzentration von exogenen 5-HT nicht in immunhistochemischen Analysen beeinflussen neuronale Architektur oder Krampfadern Dichte und einfach verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis ^15-16.
7. Inkubation bei 4 &# 176; C über Nacht in anti-Serotonin primären Antikörper (monoklonale in Maus-oder polyklonalen in Kaninchen auferweckt hat). Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Zeigen Gewebeproben auf einem mechanischen Dreh dabei Wäschen.
8. Inkubieren bei 4 ° C für 90 min in sekundären Antikörper (Alexa Fluor 568 Ziege-Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-IgG, 1:400 Verdünnung). Gründlich waschen Mut 6x für 10 min in 1x PBT. Zeigen Gewebeproben auf einem mechanischen Dreh dabei Wäschen.
9. Inkubieren bei 4 mM Natriumcarbonat für 10 min auf einer mechanischen Drehvorrichtung, montieren, in 4% n-Propyl gallate/20 mM Natriumcarbonat und Ansicht unter Fluoreszenz. Natriumcarbonat wird verwendet, um die Probe in den Puffer und pH-Wert im mountant Medien zu konvertieren.
10. Machen Sie Bilder von immungefärbten Gewebeproben bei 400-facher Vergrößerung für die Analyse.

5. Analysis of Neural Circuitry

1. Neuriten-Fasern wurden quantifiziert (Anzahl und Größe der Krampfadernund Verzweigungsgrad) mit Neuroleucida und Neuroexplorer. Dies kann jedoch auch manuell durchgeführt werden oder über das Simple Neuriten Tracer (eine kostenlose Anwendung, die online heruntergeladen werden kann).
2. Verfolgen Sie die einzelnen Faser Projektionen aus dem Gehirn zu den Drüsen und zu quantifizieren, Krampfadern Nummer, Niederlassungen und die Zahl der großen Krampfadern pro Längeneinheit. Die axonalen Fasern aus dem Gehirn vorstehen, sind in den recurrens Nerven gebündelt und sind nicht für die Analyse zugänglich, bis sie die Drüsen wo sie trennen und fasciculate erreichen.

Ergebnisse

Die serotonergen Speiseschaltung in der Drosophila-Larve kann als äußerst effektives Modell, um den Einfluss der einzelnen Faktoren auf die Entwicklung des Nervensystems beobachten, zu dienen. Durch Quantifizieren Zufuhrrate, ist es möglich, die Axon-Architektur der Speiseschaltung mit funktionellen Ausgang (Fig. 1) zu verbinden. Die Bewegungs Assay als physiologische Steuerung für die Einziehungen der Mundhaken verwendet, da ihre Larven verwenden Mundhaken, um sich über die Oberfläche des Agar...

Diskussion

Eine anomale Entwicklung des serotonergen stomatogastrischen Schaltung, die während der späten Embryogenese auftritt, wird seine reife Funktion beeinflussen. Änderungen in der Neuritenwachstum-Architektur innervieren der Darm mit dem Ausgang der Funktionsschaltung, die Fütterung wird Rate (durch den Mund Haken Kontraktionen in einem Hefe-Lösung) (Fig. 1) korreliert werden. Die Verwendung des Gal4-UAS bipartite System in Drosophila macht es möglich, gezielt nach oben oder nach unten reguliert di...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Eclipse E-800 Mikroskop	Nikon Instruments
Neuroleucida	MBF Biosciences	NL-15	Wird zur Analyse der Darmfaserarchitektur verwendet, erfordert keine
Northern Eclipse	Empix Inc		Imaging Software
G-2E/C TRITC EX 528-553	Nikon Instruments	96312	Filter für spezifische Sekundärantikörper
N.A. 0,75; W.D. 0,72 mm; DIC-Prisma: 40xI, 40x I-C; Federbelastetes	Nikon Instruments	MRH00400	Objektiv für die Aufnahme
von Simple Neurite Tracer	NIH Image J		http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer