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Methodenartikel

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

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DOI:

10.3791/51064

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24. Januar 2014

 ,  ,  , 
1Magdi Yacoub Institute, Imperial College London, 2National Heart and Lung Institute, Imperial College London, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Zusammenfassung

Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellabgabe fördert Verbesserung der Herzfunktion durch Freisetzung von Zytokinen und Faktoren, die Herzgewebe Revaskularisation und das Überleben der Zelle zu erhöhen. Darüber hinaus sind weitere Beobachtungen zeigten, dass bestimmte Stammzellen, wie Herzstammzellen, mesenchymale Stammzellen und cardiospheres haben die Fähigkeit, innerhalb der umgebenden Myokard durch Differenzierung in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu integrieren.

Hier präsentieren wir die Materialien und Methoden, um zuverlässig zu liefern noncontractile Zellen in der linken Herzkammerwand der immunodepleted Mäusen. Die wesentlichen Schritte dieser mikrochirurgischen Verfahren beinhalten Anästhesie und Analgesie Injektion, intratracheale Intubation, Schnitt, um die Truhe zu öffnen und setzen das Herz und die Lieferung von Zellen durch eine sterile 30-Gauge-Nadel und einer Präzisionsmikroliter-Spritze.

Gewebeverarbeitung, bestehend aus Herz Ernte, embedding, Schneiden und histologische Färbung zeigte, dass intramyokardialer Zellinjektion erzeugt eine kleine Beschädigung in der epikardialen Fläche, als auch in der Herzkammerwand. Noncontractile Zellen in die Wand des Myokards immunsupprimierten Mäusen erhalten und wurden durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, wahrscheinlich von Herz Druck und mechanischer Belastung zu schützen, umgeben ist.

Einleitung

Verschiedene Zellabgabe-Protokolle in murinen und Rattenmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen, die mit dem Ziel der Umsetzung der Effizienz, Wirksamkeit und Sicherheit dieser experimentellen Verfahren in menschlichen Patienten getestet. In kleinen Nager Herzen, ist intramyokardialen Zellabgabe die praktikabelste Methode der Zellabgabe 1,2, während in der Rattenherzantegrade und retrograde 3 4 intrakoronare Infusion Zelle kann ebenfalls verwendet werden. Beide Methoden haben Grenzen und Vorteile. Zell Lieferung über die intrakoronare Route hat theoretischen Vorteile gegenüber der direkten intramuskuläre Injektion in die Förderung der weltweiten Verbreitung Zelle 3, aber es hat auch die Gefahr, dass Herzkranzembolie 3,5. Einschränkungen bei der Lieferung intramyokardialen sind mit mechanischen Verletzungen, akute Entzündungen und Herzmuskelschäden 6,7 verbunden. Beim Menschen werden die Zellen für die Reparatur von Herz intramyokardiale Injektion durch eine endokardiale oder epikardiale chirurgischen zugenähern oder durch intrakoronare arteriellen Linie 8. Injection von transvaskuläre Routen ist bei Patienten mit akutem Infarkt und Herzmuskel reperfundierten geeignet, kann aber nicht möglich sein, im Falle von Totalverschlüssen oder schlechte Fluss innerhalb der Gefäße des Gebietes erfolgen 9. Direkte Injektion in die Herzkammerwand durch transendokardialen oder transepikardialen Injektion technisch möglich je nach Patient Gesundheitszustand. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass diese Technik sicher 10,11, obwohl für transepikardialen Injektion eine offene Brustchirurgie notwendig ist und für ein elektro transendokardialen nähert Zuordnung für jeden Patienten erforderlich ist, um lebensfähige Stellen von ischämischen oder vernarbten Herzmuskel 9 unterscheiden.

Wichtig ist, dass in der Zelltherapie-Studien die Auswahl der besten Zelle zu trans wird noch untersucht. Kurzzeitanalysen (4 Wochen) zeigten, dass die Injektion von Herzstammzellen definiert als cardiospheres 12 oder Side Population Zellen aus Knochenmark 13 induziert Herz funktionelle Erholung in Maus und Ratte 14 15 Modelle von Myokardinfarkt durch eine Verringerung der Narbengröße und Zelltod. Die allogene Transplantation von cardiospheres in einem Rattenmodell Myokardinfarkt ohne Immunsuppression wurde festgestellt, um sicher zu sein, förderte Herzregeneration und verbessert die Herzfunktion durch Stimulation der körpereigenen Reparaturmechanismen 15. Lin-/c-kit + adulte Progenitorzellen im Herzen wurde gezeigt, dass selbst erneuernde, klonogenen und multi in vitro und in vivo, und wenn in einem ischämischen Rattenherzen injiziert rekonstituiert große Teile des verletzten Myokard-Wand 16 und hatte die Fähigkeit, leitende und mittelgroße Koronararterien 17 zu bilden. Diese viel versprechenden Daten angeheizt Phase I und II der klinischen Studien am Menschen: Injektion von autologen und allogenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) 18, 19 cardiospheresOder c-Kit positive Herzstammzellen (CSC) 20 in ischämischen Herzen der Menschen zeigten jeweils positiven Auswirkungen auf die Herzfunktion in Langzeitstudien. Dennoch umfangreiche Langzeit-Follow-up-und retrospektive Meta-Analyse zeigte, dass die Stammzelltherapie einen wesentlichen Nutzen für einige Patienten, in anderen aber nicht mit einer Reichweite von 21 unvorhersehbare Ergebnisse. Es ist möglich, dass diese Einschränkungen wird das Design von spezifischen Protokollen der Zellabgabe für jeden einzelnen und jede Erkrankung erfordern.

In Maus-und Rattenmodellen zeigten Langzeitstudien, dass Zellinjektion nicht weiter Herzfunktion (12 Monate) zu verbessern. Tatsächlich Transplantate von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hES-CM) wurden weitgehend von der Host-Myokard durch eine Schicht von fibrotischen Gewebes 22,23 isoliert. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Transplantation von intramyokardialen Skelettmyoblasten in das Herz des infarzierten Mäusen 24 beobachtet. Furthermore, die langfristige Möglichkeit der allogenen MSCs Funktion in der Infarkt Herzen bewahren durch Übergang von einer immun eine immunogene Zustand nach Differenzierung 25 begrenzt.

Unter Berücksichtigung der Herausforderungen und Perspektiven oben dargelegt, zeigen wir hier, wie man Zellen durch intramyokardialen Injektion in Mäusen zu liefern. Wir beobachten, dass Zellen ohne Herzmuskelkontraktionseigenschaften nicht mit dem Host-Myokard verbunden und bilden eine zusammenhängende Masse mit einer dünnen fibrotischen Barriere. Obwohl in einigen Fällen dieses Ergebnis kann vorteilhaft sein, kann die folgende Analyse nützlich sein, um zu verstehen, wie Zelltransplantations kann moduliert werden, um funktionsfähig verbunden myokardialen Strukturen sowie zu erzeugen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments) und nationale (UK Home Office, Act 1986) Bestimmungen durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren sind Teil unseres Arbeitsplan nach britischem Lizenz Behörden und wurden nicht zum Zwecke der Aufnahme durchgeführt.

1. Herstellung von Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer bestimmten Zelllinie (Human Embryonic Kidney, HEK293-Zellen) zu Demonstrationszwecken. Zell-spezifische Protokolle müssen für wachsende und schließlich differen pluripotente oder adulte Stammzellen in spezifische Zelllinien verwendet werden.

  1. Wachsen Zellen in DMEM-Medium (hohe Glucose, 4,500 mg / l) mit 1% Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 1% Antibiotikum Pen / Strep und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Ein 10-cm-Platte sollte in der Regel 01.03 aufgeteilt und Medien ergänzt Frisch alle zwei Tage.
  2. Gönnen Zellen leicht mit trypsin 1x und resuspendieren in DMEM-Medium, wie in einem 1:1 beschrieben.
  3. Zählen von Zellen in einem Hämozytometer-Kammer und sammeln 3 x 10 6 Zellen in ein separates Röhrchen.
  4. Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 100 g für 5 min.
  5. Überstand verwerfen und waschen das Zellpellet mit sterilem Phosphatpuffer 2x.
  6. Resuspendieren in PBS 1x in einer Konzentration von 10 6/50 &mgr; l zur Injektion in den linken Ventrikel des immunodepleted Mäusen.

2. Prächirurgische AGB

  1. Aufrechterhaltung immunodepleted Mäusen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) mit sterilem Futterpellets und Wasser in einem temperaturgeregelten Isolator (22 ° C; Tabelle 1) vor jeder Operation.
  2. Führen Chirurgie immunodepleted Mäuse unter einer Steril. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und Autoklavieren chirurgische Werkzeuge (Zange und Schere).
  3. Schalten Sie Heizkissen für die Chirurgie und für die Wiederherstellung. Heizkissen sind wichtigum die Abnahme der Körpertemperatur auftreten, während und nach der Operation zu blockieren.
  4. Einen sauberen und autoklaviertem Käfig auf die Rückgewinnung-Heizkissen.
  5. Transportieren Sie die Mäuse in ihrem ursprünglichen Käfige aus dem Isolator zu dem Operationssaal in einen sterilen Beutel autoklaviert.
  6. Wiegen Sie die Maus und nach dem Körpergewicht inject subkutan (sc) eine Lösung, Medetomidin und Ketamin-Hydrochlorid in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um die Maus zu betäuben enthält, sowie auf die Muskeln entspannen (Medetomidin 1 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid 75 mg / kg).
  7. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig, wenn sie vollständig betäubt (innerhalb von 1-2 min, keine Zehen Prise Reflex nach Stimulation)
  8. Bewerben Enthaarungscreme auf der linken Seite der Brust und den Hals-Bereich. Nach einer angemessenen Zeit (ca. 2-5 min), wischt die losen Haare mit einem mit Wasser nass Gewebe.
  9. Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Panel in Rückenlage. AusSicht des Chirurgen eine vertikale Position erreicht, Schwanz-Kopf nach unten.
  10. Spritzen Sie Analgetikum Lösung bei 0,1-0,2 g / g in steriler Kochsalzlösung (Buprenorphin) verdünnt in die hinteren Gliedmaßen subkutan und decken den rasierten Bereich mit der aseptischen Lösung Povidoniod mit einem Wattestäbchen.
  11. Fokus des Mikroskops (2,5 fach Objektiv) auf den Hals-Bereich.

3. Chirurgische AGB

  1. Mit stumpfen Schere einen ventralen Mittellinie Hautschnitt von etwa 0,5 bis 1 cm Länge, die etwas unterhalb des Ringknorpels. Trennen Sie die Haut von Bindegewebe um die Speicheldrüsen zu visualisieren.
  2. Teilen Sie die Speicheldrüsen auf ihren natürlichen Mittellinie Division durch gleichzeitiges Ziehen jedes Teil seitlich mit Pinzette und Magnet Brust Retraktor und setzen die Luftröhre.
  3. Ziehen Sie die Zunge sanft zur Seite, um den Kehlkopf aus. Schieben Sie die Intubationstubus vorsichtig in die Luftröhre. Die Rohrspitze ist durch die angezeigte l sichtbararynx und Luftröhre. Wichtiger ist, wenn das Rohr in, aber nicht deutlich sichtbar ist, ist es in der Speiseröhre. Entfernen Sie es und ändern Sie die Position der Rohrspitze.
  4. Schließen Sie den Schlauch an den Lüftungs Maschine. Stellen Sie das Schlagvolumen bei 200 ul und 150 Hub / min. Befestigen Sie die Lüftungsschlauch auf dem OP-Panel mit einer Band.
  5. Mit stumpfen Schere und Pinzette, machen Sie eine vertikale Schwanz zum Kopf 1 - bis 1,5 cm langen Hautschnitt über der linken Thoraxbereich.
  6. Lösen Sie die Haut vor den Bindegewebs-/ Muskelschichten und die großen und kleinen Brustmuskeln ohne Einschnitte.
  7. Führen Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippen sich wie folgt:
    1. Perforieren die Zwischenrippenmuskelschicht durch Kneifen und Kratzen mit kleinen, abgerundeten Pinzette.
    2. Sobald die Zwischenrippenmuskelschicht ist perforiert, legen Sie die Brust Retraktor bis maximal öffnen Sie die Brusthöhle. Die oberen und mittleren Teile des linken Ventrikels (LV) mit darüberliegenden Vorhof (Atrium) sindjetzt sichtbar.
  8. Bereiten Sie eine Präzisionsspritze mit Zellen. Die Spritze ist in der Lage, eine Menge an Volumen von 10 ul für jede Injektion zu liefern. Werfen Sie einen 30 G Nadel an der Spitze der Spritze.
  9. Fix mit Band eine kleine Kunststoffkanüle (von einem Introcan-W 20 G) an der Nadel, so dass nur 1 mm ausgesetzt, einschließlich der offenen Spitze der Nadel. Dadurch wird die Nadel aus Perforieren des gesamten linken ventrikulären Wand und die Injektion der Zellen in die linke Herzkammer Hohlraum zu verhindern.
  10. Mit Hilfe eines 5X Ziel, visualisieren bei dieser Vergrößerung der linken Herzkammer und injizieren die Zellen in der linken Herzkammerwand in 5 verschiedenen Standorten (jeweils 10 ul Injektion wird für insgesamt 106 Zellen injiziert liefern). Wenn die Einspritz erfolgreich ist, wird eine weiße Fläche und die Abwesenheit von großen Rückspülung der Zellen sichtbar ist (wenn die Einspritz nicht erfolgreich war, würde das Tier von der funktionalen Analyse ausgeschlossen werden.)
  11. Entfernen Sie den Aufroller. Schließen Sie die Brustwand by umschließt die beiden getrennten Rippen mit zwei Maschen von 6-0 Seidenfaden.
  12. Befeuchten Sie die Brustmuskeln und die Haut mit einem Wattestäbchen in PBS 1x durchnässt und legte sanft die Muskeln wieder in die Ausgangsposition mit der Zange.
  13. Schließen Sie die Haut mit 3-4 Stichen von 6-0 Seidenfaden. Naht der Kehle Schnitt mit 2-3 Stichen, um die Haut zu schließen.
  14. Inject Atipamezol (1 mg / kg Endkonzentration), um die betäubende Wirkung zurück.
  15. Sobald die Maus selbstständig zu atmen beginnt, nehmen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und setzen Sie die Maus auf die rechte Seite. Die Maus wird erwartet, dass innerhalb von Minuten wiederherstellen.
  16. Wenn die Maus beginnt sich zu drehen und zu Fuß, legen Sie sie in der warmen Erholungskäfig (kleine IVC-Käfig mit geschlossenen gefilterte oben) für eine Stunde.
  17. Lassen Sie die Tiere über Nacht in einem geregelten beheizten Feld (37 ° C).
  18. Füllen Sie eine Schüssel mit Wasser und Pellet Essen zur Erholung während der ersten 2 Tage nach der Operation zu unterstützen.

4. Post-Chirurgie Analysen

Zehn Herzen mit Zellen und 10 Kontroll nicht gespritzt Herzen injiziert werden histologisch wie folgt analysiert:

  1. Führen Analyse der transplantierten Zellen von 1 Woche nach Injektion (Fig. 1 und 3).
    1. Nach Euthanasie durch Überdosierung von Isofluran, durchströmen die Herzen mit 20 ml 4% Paraformaldehyd (PFA), um das Gewebe zu beheben. Entwässern der festen Gewebe in steigenden Prozentsätzen von Ethanol (70-100%) und in Paraffinblöcke einbinden.
    2. § die Herzen in Paraffin mit einem Mikrotom in 5 um und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin für die morphologische Analyse.
    3. Visualisieren Bindegewebe durch die Verwendung Masson Trichrome Fleck.
    4. Analysieren Sie die Bilder unter einem Dia-Scanner-Mikroskop (1A, 2A, 3A, 3B und 3C) und zu visualisieren, das gesamte Herz in kurzen Achse mit einem digitalen Mikroskop-Dia-Scanner (Figures 1B und 1C).
  2. Nachdem die obigen Analysen entparaffinieren Herzgewebe in Xylol rehydrieren Proben durch Eintauchen in abnehmProzente Ethanol (100% Wasser) und Verfahren für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wie folgt:
    1. Inkubieren entparaffinierten Blöcke mit 1% Gerbsäure in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde.
    2. Entwässern Proben bei der Erhöhung der Prozentsätze Ethanol (25-100%).
    3. Trockenproben mit HMDS (Hexamethyldisilazan).
    4. Montieren Sie die Proben auf Stubbs mit Acheson Silber Dag und überziehen sie mit Gold-Palladium.
    5. Anwendungsbeispiel in einem analytischen Rasterelektronenmikroskops (Fig. 2B).

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Ergebnisse

Wir injizierten HEK293-Zellen, die unterscheidbar von der Herzzellen durch ihre unterschiedliche Morphologie (Fig. 1) sind, mit einer Kopfsteinform im Vergleich zu den länglichen Kardiomyozyten (Fig. 1A). HEK293-Zellen waren zu Hämatoxylin Farbstoff (blaue Farbe) reaktiven Vergleich zu Kardiomyozyten (rosa Farbe), wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Kerngehalt (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterscheidung der injizierten Zellen aus dem Wirtsgewebe wurden HEK293-Zellen mit...

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Diskussion

In diesem Manuskript haben wir gezeigt, wie man intramyokardialen Injektion von Zellen in murinen Herzen durchzuführen. Als Beweis dieser Methodik haben wir HEK293-Zellen verwendet. Es ist wichtig zu betonen, dass HEK293-Zellen sind nicht in einer Zelltherapie Studie verwendet und damit die Ergebnisse des Manuskripts für die direkte Übersetzung zu einem therapeutischen Ansatz nicht geeignet sind. Die Tatsache, dass HEK293-Zellen nicht kontraktilen Zellen und nicht in anderen Zelltypen zu trans Aufmerksamkeit konzentrier...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken der Magdi Yacoub Institute (MYI) zum Tragen mikroskopische Analyse und die Projekte mit Herz Reparatur, die Techniker und die Manager der unsere Tieranlage. Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (BHF), Projekt PG/10/019 Zuschuss unterstützt. MPS wird von der BHF MYI und unterstützt. TP ist ein BHF-Research Excellence Fellow. NR eine NH & MRC Australien Fellow.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IsolatorPfi-SystemeAngebot erforderlich
HeizkissenVet Tech SolutionsHE006Für Kleintiere
MedetomidinNationaler VeterinärdienstTierärztliche Verschreibung ist erforderlich
KetaminhydrochloridNationaler VeterinärdienstTierärztliche Verschreibung ist erforderlich
AtipamezolNationaler VeterinärdienstTierärztliche Verschreibung ist erforderlich
Haarentfernungscremekommerzielle Geschäfte
BuprenorphinNVS TierärztlicheVerschreibung ist erforderlich
Leica MZFLIII MikroskopLeicaModell S6EMit Schwenkarmstativ TS0
Hamamatsu Nanozoomer digitaler DiascannerHamamatsuRS series
RasterelektronenmikroskopJeol JSM-6610
Stumpfe SchereFST14084-09
MiniventHarvard Gerät73-0043Inklusive kleinem Y-Adapter (73-0027) und Intubationskanüle (73-2844)
PinzetteFST11052-10
RetraktionssystemFST18200-20Kit für Tiere bis 200 g
30 G 12 mm; ½ ZollBBraunA210Feingelbe
MikroliterspritzeESSLAB81201Enthält auch einen Hamilton Repetierspender PB 600-1 Katalognummer 83700
6-0 SeidennahtEthiconW1614T

Referenzen

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