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Methodenartikel

Der Rat von Helsinki Mikroseitenwand Aneurysma Modell

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DOI:

10.3791/51071

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12. Oktober 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neurosurgery Research Group, University of Helsinki, Helsinki, Finland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mikrochirurgische Seitenwandaneurysmen bei Ratten entstehen durch End-to-Side-Anastomose eines Aortentransplantats an der abdominalen Aorta. Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitungen und besprechen anatomische und chirurgische Details für eine erfolgreiche experimentelle Anlage eines sackförmigen Aneurysmas.

Zusammenfassung

Experimentelle sackförmigen Aneurysmas Modelle sind für die Prüfung neuartige chirurgische und endovaskuläre Behandlungsmöglichkeiten und Geräte, bevor sie in die klinische Praxis eingeführt werden, erforderlich. Darüber hinaus werden experimentelle Modelle benötigt, um die komplexe Biologie Aneurysma, die zu der sackförmigen Aneurysmen reißen aufzuklären.

Mehrere verschiedene Arten von experimentellen Modellen für sackförmige Aneurysmen in verschiedenen Spezies nachgewiesen. Viele von ihnen erfordern jedoch besondere Fähigkeiten, teure Ausrüstung oder spezielle Umgebungen, was ihre weitverbreitete Verwendung einschränkt. Eine einfache, robuste und kostengünstige Versuchsmodell wird als standardisiertes Werkzeug, das in standardisierter Weise in verschiedenen Einrichtungen verwendet werden können, erforderlich.

Die mikrochirurgische Ratte Bauch-Aorten-Aneurysma Seitenwand Modell kombiniert die Möglichkeit, sowohl neue endovaskuläre Behandlungsstrategien und die molekularen Grundlagen der Biologie Aneurysma in einem standardisierten und preiswert studierenWeise. Standardisierten Transplantate durch Form, Größe und Geometrie von Aorta descendens einer Spenderratte geerntet und dann mit einem syngenen Ratten-Empfänger transplantiert. Aneurysmen sind mit durchgehenden Naht Ende-zu-Seite oder unterbrochen 9-0 Nylonnaht an der infrarenalen Bauchaorta.

Wir präsentieren die Schritt-für-Schritt-Handlungsanweisungen, Informationen über notwendige Ausrüstung und diskutieren wichtige anatomische und chirurgische Details für eine erfolgreiche mikro Schaffung eines Bauch-Aorten-Aneurysma Seitenwand in der Ratte.

Einleitung

Bruch einer sackförmigen Hirnarterie Aneurysma verursacht lebensbedrohliche Blutung, die zu Schlaganfall, bleibende neurologische Schäden oder Tod. Bruch kann entweder durch mikrochirurgische Clipping oder endovaskuläre Aneurysma Okklusion verhindert werden. Eine medizinische Behandlung, um Aneurysma Wachstum und Bruch zu verhindern, ist noch nicht erwiesen.

Versuchsmodellen für sackförmige Aneurysmen sind erforderlich, um die Biologie von Aneurysmen und zum Testen neuer therapeutischer Vorrichtungen und Strategien zu studieren. Für diese Zwecke sind mehrere verschiedene Modelle in unterschiedlichen Spezies entwickelt und veröffentlicht 1. Vorzugsweise größer Aneurysma Modelle in Schweinen, Hunden und Kaninchen zur endovaskulären Aneurysma Innovationen in komplexen Architektur 1,2 testen. Murine Aneurysma Modelle, auf der anderen Seite, lassen die Prüfung Forschungsfragen in gentechnisch veränderten Arten 3,4 und erleichtern Klärung Aneurysma Biologie auf zellulärer und molekularerNiveau weit besser als größere Arten 1. Obwohl endovaskulären trans carotis und trans-iliaca-Einsetzungs an Ratten größer begrenzt (> 400-500 g) und Stents kleiner als 2,0 mm und 1,5 mm im Durchmesser 5,6 Stents kann auch durch direkte Einführung in die Aorta abdominalis platziert werden Segment beherbergen die experimentellen Aneurysmen. Frühere Arbeiten mit der Ratte mikro Bauch-Aorten-Aneurysma Seitenwand Modell demonstriert die Machbarkeit in der Prüfung Roman embolischen Geräte und ihre Verwendung bei der Untersuchung der molekularen Grundlagen der Biologie Aneurysma 3,7.

Viele der aktuell veröffentlichten experimentellen sackförmigen Aneurysmas Modelle erfordern teure Ausrüstung, spezielle Umgebungen (zB sterile OP-Sälen mit Durchleuchtung Fähigkeiten), der interventionellen Radiologie Kompetenz, oder die Verwendung von teuren Arten. Diese Anforderungen schränken die weit verbreitete Verwendung dieser Modelle, und führen zu der Verwendung von verschiedenen Modellen in verschiedenen Laboratorien, worin MFlocken Datenvergleich und Meta-Analyse schwierig, wenn nicht unmöglich. Eine einfache, robuste und kostengünstige Versuchsmodell wird als standardisiertes Tool, das in einer standardisierten Art und Weise in verschiedenen Labors, um vergleichbare Ergebnisse von verschiedenen Institutionen erhalten verwendet werden können, benötigt. Zu diesem Zweck haben wir die Rattenaorta Seitenwand sackförmiges Aneurysma arteriellen Modell erstellt.

Das Ziel dieses Berichts ist es, Schritt-für-Schritt-Handlungsanweisungen, Informationen über notwendige Ausrüstung zu präsentieren und wichtige anatomische und chirurgische Eigenschaften für die erfolgreiche Schaffung von mikro Bauch-Aorten-Aneurysmen Seitenwand in der Ratte zu diskutieren.

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Protokoll

HINWEIS: Männliche Wistar-Ratten (mittleres Körpergewicht: 356 ± 44 g, 10-14 Wochen alt) wurden in der Tierraum bei 22-24 ° C und 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Pellet-Ernährung, regelmäßige Leitungswasser untergebracht und auch humane Pflege im Einklang mit den Richtlinien des Instituts erhalten. Die Experimente wurden überprüft und vom Ausschuss für Tierschutz an der Universität Helsinki, Finnland zugelassen.

HINWEIS: In der folgenden Demonstration unserer chirurgischen Verfahren ist wie folgt: die Ratten Anesthetize Gewichtsangepassten subkutane Injektion von Medetomidin-Hydrochlorid (0,5 mg / kg) und die intraperitoneale Injektion von Ketamin-Hydrochlorid (50 mg / kg). Test für den Mangel an einer Zehenreflex Klemm zu bestätigen, dass die Ratten vollständig betäubt wird. Augensalbe anwenden, Clip die Operationsstelle, und reinigen Sie die Haut mit einem geeigneten Desinfektionsmittel, zum Beispiel Chlorhexidin, entweder in Alkohol oder Wasser. Hände waschen, auf Schutzkleidung, eine Kopfhaube und Gesicht zaubernMaske und sterile Handschuhe. Haben einen chirurgischen Assistenten helfen bei der aseptischen Operationsbedingungen und die chirurgische Eigenschaften zu dokumentieren (wie in Tabelle 1 aufgeführt). Überwachen Sie die Tiefe der Narkose alle 15 min während der Operation durch folgende Atemfrequenz, Herzfrequenz, und der Reaktion auf Schmerzreiz (toe Prise Test). Die subkutane Injektion von Buprenorphin (0,03 mg / kg) wurde für postoperative Analgesie gegeben und gegebenenfalls wiederholt alle 12 Stunden.

1. Hardware, Verbrauchsmaterialien und Positionierung

  1. Halten Sie die Kleintierchirurgie Zimmer ruhig, aseptisch, und die Raumtemperatur auf 23 ° C +/- 3 zu halten. Um die experimentellen Aneurysmachirurgie der folgende minimale Ausrüstung notwendig ist, durchführen:
    1. Verwenden Sie eine Tischplatte Operationsmikroskop idealerweise mit einem Assistenten Umfang und Digital-Mikroskop-Kamera ausgestattet. Verwenden Sie nicht porös wiederverwendbar Betriebsfläche und zu reinigen Instrument Oberfläche, um die Labortisch zu schützen.
    2. Bereiten Verbrauchsmaterialien wie Hautdesinfektionsmittel, physiologische Kochsalzlösung, kleinere und größere Tupfer und Nahtmaterial einschließlich 9-0 Mikronahtmaterial, einem nicht resorbierbaren 5-0, 3-0 und resorbierbares Nahtmaterial.
    3. Verwenden Sie die folgenden Standard-OP-Instrumente: Chirurgische Scheren, Pinzetten, Weichteilspreizer oder Wundspreizer, und zwei Mosquito chirurgische Klammern.
    4. Verwenden Sie ein mikrochirurgisches Instrument Grundsatz, der folgendes beinhaltet: Gebogene Mikronadelhalter, eine gekrümmte und zwei geraden Mikropinzetten, und einen geraden oder gebogenen microscissor.
    5. Halten Sie die mikrochirurgischen Instrumente in einer Nierenschale mit steriler Kochsalzlösung gefüllt, um das Instrument nicht klebrig und sauber während der Operation zu halten. Die Nierenschale mit Gummimatte oder ein OP-Handschuh, um Schäden an den Spitzen der Mikroinstrumenten verhindern gepolstert. Stellen Sie sicher, dass alle Lieferungen sind steril und das Verfahren wird mit aseptischer Technik nach den aktuellen Empfehlungen für das Überleben der Operation an Labortieren durchgeführt 8-10.
    6. Darüber hinaus verwenden Sie einen Gefäß Clipapplikator und drei temporäre atraumatische Gefäßklemmen. Es ist wichtig, daß die verwendeten Klemmen weisen eine geringe Schließkraft, um eine Verletzung der sehr dünnen Wand der Aorta von Ratten zu verhindern. Bereiten auch ein Lineal mit Halbmillimeterskala Bars, einem kleinen farbigen Gummi-Pad, und eine kurze stumpfe Nadel.
    7. Legen Sie die Ratten in Rückenlage, zu immobilisieren vorne und Hinterpfoten mit chirurgischen Band ohne Anwendung Dehnung oder Kompression auf die Haut und beugen den Rücken mit einem dicken Marker oder Stift Kauter, indem er unter der Holz Bereich des Rückens. Es ist wichtig, so viel wie Lordose der Lendenwirbelsäule möglich ist, um Belichtung und retroperitonealen Zugang zu der infrarenalen Aorta, die mikro Anastomose erleichtert Verbesserung erhalten. Diese Positionierung wird für die Bauch-Aorta Aneurysma Schaffung empfohlen, ist aber für die Thoraxspanentnahme nicht notwendig.

2. Graft Ernte

  1. Under Vollnarkose, öffnen Sie die Brusthöhle (Start Transplantat Ischämie-Zeit). Tragen Sie eine schädliche Zehe Prise zu bestätigen, dass die Ratte nicht reagiert, bevor Sie mit den folgenden Schritten fortfahren. Durch die Bauchwand midventral geschnitten, identifizieren die Membran direkt über der Leber, und schneiden das Bindegewebe an der Unterseite der Membran, um Zugang zu den Brustkorb zu ermöglichen. Mit großen Scheren, stumpfen Seite nach unten, durch Rippen schneiden nur einen Zentimeter links und rechts der Mittellinie des Brustkorbs und öffnen Sie die Brusthöhle. Die Lungen werden an der rechten Seite des Herzens mobilisiert. Opfern die Ratten durch eine Überdosierung mit intra Injektion von Ketamin hydrochloride.Pulmonary Kofferraum, links subclavia, links Schädel Hohlvene und die azygous Vene mit der Ernte der proximalen Aorta stören.
  2. Caudal zu den prominenten Venen gibt es eine gute Einstiegspunkt, um die Dissektion der Aorta descendens mit Mikro-Schere und microforceps starten.
  3. Verfolgen Sie die thorakalen Aorta back von der dorsalen Thoraxwand nach oben, um den Aortenbogen durch sanftes Zurückziehen und stumpfe Dissektion mit dem Mosquito chirurgische Klemme.
  4. Klemme und dann schneiden Sie die Adern mit einer Schere. Pflegen Sie die Klammern auf die Venen und die Verwendung als Aufroller, um die zugrunde liegenden Aortenbogen aussetzen.
  5. Legen Sie eine nicht-resorbierbaren 6-0 Seidenligatur knapp über dem ersten Zwischenrippenarterie Verlassen der Aorta.
  6. Schneiden Sie die absteigende Aorta knapp unterhalb des linken Schlüsselbeinarterie und dann unterhalb der Ligatur. Trimmen kann, um eine senkrecht standardisierten Aneurysma Geometrie erhalten erfolgen oder, wenn nötig, um einen bestimmten Winkel zwischen der Achse und dem Aneurysma der Aorta zu erhalten. Messung des Transplantats in der Breite und Länge.
    HINWEIS: Geerntet Transplantate können entweder sofort in Empfänger Ratten transplantiert werden oder weiterverarbeitet werden, um Dezellularisierung des Transplantats Wand zu erreichen. Dezellularisiertes Transplantate bei -4 Grad Celsius bis zur Wieder Implantation zu einem späteren Zeitpunkt (Abbildung 1) gespeichert werden. The Dezellularisierung der Aneurysmawand ist gezeigt worden, um das Aneurysma zu vergrößern 11 prädisponieren.

3. Graft Dezellularisierung

  1. Gefriertspendertransplantaten in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 4 ° C ist.
  2. Am nächsten Tag auftauen Transplantate gründlich mit gereinigtem und deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur und Inkubation für 10 h bei 37 ° C in 0,1% Natriumdodecylsulfat.
  3. Schließlich, waschen Sie die Natriumdodecylsulfat-behandelten Transplantate drei Mal mit sanfter Bewegung, wieder einfrieren in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, und halten Sie bei -4 ° C bis zur Verwendung.

4. Aneurysma Creation

  1. Dissektion der Bauchaorta
    1. Nachdem das Tier wurde betäubt, Clip das Fell von der Operationsstelle und reinigen Sie die Haut mit einem geeigneten Desinfektionsmittel. Test für den Mangel an einer Zehenklemm Reaktion vor Hautinzision. Starten Sie den Schnitt 1cm proximal zu den Genitalien in midventral Position (Startbetriebszeit). Vorsichtig die Haut von den darunter liegenden Muskeln. Ende Präparation 1-2 cm unter dem Brustbein.
    2. Vorsichtig, aber fest ziehen Sie die zugrunde liegenden Bauchmuskeln, um Schäden an den darunter liegenden Organe zu vermeiden. Verlängern Sie die Längsschnitt entlang der Linea alba nach oben, um den Schwertfortsatz und am Ende in Richtung Schwanz auf der Ebene der Blase.
    3. Druck auf die Blase sanft an, um es um den Zugang zu dem Retroperitonealraum erleichtern entleeren.
    4. Bewegen Sie den Dünndarm und den prominenten Blinddarm nach rechts oder links. Identifizieren Sie die Dickdarm nämlich die absteigend Doppelpunkt links unten auf der Bauchhöhle.
    5. Schneiden Sie das Band zwischen dem Dünndarm und dem absteigenden Dickdarm in Richtung Schädel breitere Exposition der dorsalen Körperwand zu ermöglichen. Legen Sie eine Wundspreizer, den Darm auseinander zu halten.
    6. Die ideale Lage des Ende-zu-Seite-Anastomose Aneurysma is auf der Ebene zwischen der Nieren-und iliolumbalen Venen gefunden. Die Bauchaorta liegt retroperitoneal im Fettgewebe eingebettet. Bei der Präparation ein besonderes Augenmerk auf die gepaarten fast transparent Harnleiter und Hodengefäße.
    7. Wenn weitere Zurückziehen der Darm braucht, soll größer Gaze-Swaps. Die Lendenwirbelsäule Lordose während der Positionierung, indem Sie einen Stift oder Kauter ein ähnliches Objekt unter den unteren Rücken der Ratte induziert, reduziert deutlich die Notwendigkeit der Darm Rückzug.
    8. Die Bauchseite der dorsalen Körperwand ist mit einer dünnen Bauchfell bedeckt. Sobald diese geöffnet wird, visualisieren die Aorta knapp unterhalb. Bei der sorgfältigen scharfe und stumpfe Dissektion der Bauchaorta von benachbarten großen Venen erfassen nur die Adventitia, um Schäden an der Gefäßwand zu vermeiden.
    9. Selten entstehen kleine Lendenarterien als segmentale Gefäß von der dorsalen Oberfläche der Bauchaorta und stören Vorbereitung. Ligation und Schneiden des Behälters geb.ded retrograden Nässen während Aneurysma Naht zu vermeiden. Verwendung von gekrümmten Mikro-Pinzette können Ligatur Platzierung in der Tiefe zu erleichtern.
  2. End-zu-Seit-Anastomose
    1. Setzen Sie einen farbigen Gummipolster unter der Bauchaorta und polstern sie mit einem kleinen Gaze Tupfer. Entfernen Sie lose Bindegewebe und Adventitia auf der Ebene der geplanten Anastomose.
    2. Spannen Sie den Bauch-Aorta distal der Anastomose, dann proximalen (Start Aorten-Spannzeit). Dies gewährleistet eine feste Füllung des Behälters und erleichtert die anschließende Arteriotomie.
    3. Führen Sie die Arteriotomie entweder gerade oder gebogen Mikro-Schere. Ein Mikro-Pinzette hält ein sehr kleines Stück der Gefäßwand zu schneiden eine elliptische Form.
    4. Spülen Sie die Arterie gründlich mit Kochsalzlösung in beide Richtungen mit einem stumpfen Spitze Nadel.
    5. Platzieren der ersten beiden Nähte des End-zu-Seit-Anastomose an dem proximalen und distalen Ende der Arteriotomie (Startzeit Anastomose). Vermeiden Greifen der Gefäßwand mit den Mikropinzette, wann immer möglich. Stellen Sie sicher, dass jede Naht wird durch alle Schichten der Gefäßwand platziert.
    6. Führen Naht entweder als durchgehenden oder unterbrochenen Nähten. Wenn unterbrochen Naht gewählt legen Sie dann zuerst die Rückseite neun Uhr Naht. Anschließende Naht auseinander beginnend benachbart der ersten Naht beabstandet ist. Fassen Sie die Adventitia sorgfältig. Vermeiden Sie jede Quetschung / Greifen der Intima.
    7. Wenn die Rückwand fertig ist, überprüfen Sie die endoluminale Teil der Anastomose nach verlegten Nähten. Führen die gleichen Verfahren in der gleichen Reihenfolge auf der Vorderseite. Stellen Sie sicher, dass der erste von insgesamt drei Knoten pro Naht ist fest, aber nicht zu eng.
  3. Blutstillung und Verschluss
    1. Nachdem das Ende Anastomose abgeschlossen ist (End-Anastomose Zeit), spülen Sie die Website mit Kochsalzlösung und entfernen Sie die distale Klemme erste für Rückstau ermöglichen (Aorten-Klemmende und Endzeit Transplantat Ischämie timich).
    2. Wenn offensichtlich Blutungen aus Rückfluss eine zusätzliche Stich können erforderlich sein, tritt (Startzeit der Hämostase). Bei kleineren Nässen, Blutstillung zu erreichen mit sanftem Druck über die blutende Stelle mit einem kleinen Stück von einem Gaze-Tupfer.
    3. Entfernen Sie den proximalen Gefäßklemme, spülen Sie die Anastomose noch einmal, und schneiden Sie die verbleibenden Enden der Ligatur am Aneurysma Kuppel.
    4. Durchgängigkeit des Aneurysmas durch Beobachtung der Volumenzunahme des Aneurysmas während der Spitzen bestätigen arteriellen Pulswelle. Beurteilen distalen Bauchschlagader Durchgängigkeit durch die direkte "Melken Test".
    5. Entfernen Sie die Plastikfolie und die kleine Mulltupfer darunter. Der pulsierende Blut Wirbel innerhalb des Aneurysmas erstellt ist deutlich sichtbar.
    6. Decken Nahtlinien rund um die Anastomose mit kleinen Stücken von Fettgewebe oder Spongostan für zusätzliche Blutstillung, wenn kleine Nässen noch vorhanden ist (Endzeit der Blutstillung).
    7. Entfernen Sie die Weichteilspreizer und Tupfer.Legen Sie den Dünndarm, Blinddarm, und der Fettmasse zurück in ihre richtige Position.
    8. Schließen Sie die Mittellinie Bauchmuskeln mit 5-0, 4-0, 3-0 oder resorbierbaren oder nicht resorbierbaren Nahtmaterial, gefolgt von Hautwundverschluss mit fortlaufenden Naht-Technik mit 3-0 resorbierbaren Naht polyfilen (Ende Betriebszeit). Hinweis: Nach unserer Erfahrung Ratten toleriert resorbierbaren Hautnähte besser als nicht-resorbierbares Nahtmaterial Monofilament.

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Ergebnisse

Ein Pilot-Serie umfasst 14 Ratten. Anschließend wurden insgesamt 84 Tiere wurden nach dem vorgelegten Protokoll für mehrere Forschungsprojekte zwischen März und September 2012 weitere 29 Tiere dienten als Spender für die arterielle sackförmigen Transplantate betrieben. Die übrigen Versuche wurden unter Verwendung vorbehandelt Transplantate geerntet und aus früheren Experimenten mit Ratten des gleichen Geschlechtes, Stammes, Gewicht, Alter und gespeichert.

Körpergewicht, Gesamtbetriebszeit, A...

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Diskussion

Fortschritte in unserem Verständnis der komplexen Biologie der sackförmige Hirnarterie Aneurysma hängt Analyse von epidemiologischen und klinischen Daten, ergänzt durch Laborstudien an Patientenproben und experimentelle Arbeiten in Tiermodellen 3,12,13.

Kleintiere wie Ratten inhärent mit niedrigeren Kosten von Versuchen und dem Gehäuse verbunden ist, und verringerten Bedarf an Spezialgeräten. Eine durchschnittliche Betriebszeit von weniger als 60 Minuten für mikro Schaffung einer ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen oder wirtschaftlichen Interesse in einem der Medikamente, Materialien oder Geräte verwendet.

Danksagungen

Die Autoren sind allein verantwortlich für das Design und die Durchführung der vorgestellten Studie. Dr. Marbacher wurde durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (PBSKP3-123454) unterstützt. Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Die Beiträge der Autoren zur Studie und zur Vorbereitung des Manuskripts umfassen die folgenden. Konzeption und Design: SM, JM, JF. Erfassung von Daten: SM, EA, JF. Analyse und Interpretation der Daten: SM, JF, JM. Erstellung des Artikels: SM, JF, JM. Kritische Überarbeitung des Artikels: JH, MN. Statistische Analyse: SM, JF. Studienbetreuung: JF, JH, MN.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MedetomidinJedes Genericon
KetaminJedes Genericon
BuprenorphinJedes Genericon
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
Natriumdodecylsulfat (0,1%)
3-0 resorbierbares NahtmaterialEthicon Inc., USAa name="BEREICH! C7">VCP824G
5-0 nicht resorbierbares NahtmaterialEthicon Inc., USA8618G
6-0 nicht resorbierbares SeidennahtB. Braun, DeutschlandC0761060
9-0 Nylon-MikronahtB. Braun, DeutschlandG1118471
SpongostanEthicon Inc., USAMS0002
OperationsmikroskopLeica, DeutschlandM651
Digitale MikroskopkameraSony, JapanSSC-DC58AP
Chirurgische StandardinstrumenteB. Braun, DeutschlandMehrfachSiehe Protokoll 1.4
Mikrochirurgische InstrumenteB. Braun, DeutschlandMehrfachSiehe Protokoll 1.5
Gefäßclip-ApplikatorB. Braun, DeutschlandFT495T
Temporäre GefäßklemmenB. Braun, DeutschlandFT250T
Graph Pad Prism Statistiksoftware GraphPad Software, San Diego, California, USAV 6.02 für Windows
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Referenzen

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