Automatische Trennung von C. elegans Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

Zusammenfassung

Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die wormsorter ist ein Instrument analog zu einem FACS-Maschine, die in den Studien von Caenorhabditis elegans verwendet wird, in der Regel, um Würmer, basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporter sortieren. Hier stellen wir eine alternative Nutzung dieses Instruments für die Sortierung Würmer nach dem Grad der Kolonisierung durch einen GFP-exprimierenden Erregers. Diese neue Nutzung gestattet uns die Beziehung zwischen Kolonisierung des Darms Schnecke und Induktion von Immunreaktionen zu adressieren. Während C. elegans Immunreaktionen auf verschiedene Erreger dokumentiert worden ist, ist es noch nicht bekannt, was sie veranlasst. Die beiden wichtigsten Möglichkeiten (die nicht gegenseitig ausschließen) sind Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns, und den Nachweis von Schäden, die durch eine Infektion verursacht. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, muss die Exposition gegenüber dem Erreger aus der von ihm verursachten Schäden getrennt werden. Die wormsorter aktiviert Trennung von Würmern, die durch Gram-n extensiv besiedelt wurdenegative Erreger Pseudomonas aeruginosa, mit dem Schaden wahrscheinlich durch Erreger Last verursacht, von Würmern, die in ähnlicher Weise exponiert waren, aber nicht, oder geringfügig besiedelt. Diese unterschiedliche Populationen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen Keimmenge und der Induktion von Immunantworten Transkriptions beurteilen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die beiden dissoziiert, unterstützt die Möglichkeit der Krankheitserreger Erkennung.

Einleitung

Automatische Sortierschnecke ist ähnlich wie FACS, Betriebs durch Messen eines Fluoreszenzsignals in einer Schnecke (typischerweise durch transgene Expression von Reporterproteinen zur Verfügung gestellt), wie es geht in ein Rohr gerichtet, so dass die Umleitung entweder zu einem Sammelrohr / Vertiefung oder zu einem Abfallbehälter nach um Gating Parameter durch den Forscher ¹ gesetzt. Die wormsorter kann die Forschung in vielerlei Hinsicht zu erleichtern, ein Beispiel der Verwendung es als analytisches Werkzeug ist eine Studie, die räumlich-zeitliche Muster der Promotoraktivität für fast 1.000 Gene ² gefolgt.
Jedoch ist die Hauptanwendung des wormsorter in genetischen Screens, folgende Zielgenexpressionsniveaus oder Lokalisation des fluoreszierenden Proteins entlang der Achse der Schnecke ^3-5.

Hier beschreiben wir eine neue Anwendung für die wormsorter, in folgenden Kolonisierung der Wurm von einem fluoreszenzmarkierten Erregers. Mit diesem als ein Werkzeug, das wir auf die Beziehung zwischen pathog fokussierten Kolonisation / Last und der Immunantwort, um neue Einblicke in die Mechanismen für die Initiierung von Immunreaktionen in der Wurm verantwortlich zu gewinnen.

In praktisch allen bisher untersuchten Organismen, Initiierung der angeborenen Immunantwort gegen mikrobielle Krankheitserreger, hängt von der Anerkennung pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und / oder Gefahr / Schaden-associated molecular patterns (gedämpft) ^6,7. Die ersten konserviert sind mikrobielle Strukturen, Komponenten der mikrobiellen Zellwand, seine Flagellum oder dessen Lipid-Doppelschicht ⁶ umfassen, der zweite umfassen sowohl freigesetzten Moleküle (z. B. ATP ^8), veränderte Proteine ​​oder andere Marker von veränderten zellulären Prozessen ^9,10. Beide Arten von Signalen sind als Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), die auf spezifische Bindung eines Moleküls aktivieren Muster eine Kette von Ereignissen, die eine schützende Antwort bezeichneten Proteinen erkannt. C elegans ist extrem nützlich als tracta gewesenble Modell, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu sezieren, aber eine Sache, die nicht gut verstanden wird, ist, wie Immunantworten werden in der Wurm gestartet. Keiner der vermeintlichen Rezeptoren, die orthologen zu pattern recognition receptors (PRR) in anderen Organismen haben gezeigt, dass PAMPs zu binden, und viele der Orthologen von PRRS, die entscheidend für Immunreaktionen in andere Organismen sind eine überraschend begrenzten Beitrag zur Schnecken Erreger Antworten und Widerstand. Zum Beispiel wird das Drosophila Toll-Rezeptor, die für Gram-positive Pathogene Widerstand ist, in C dargestellt elegans durch eine einzige Homolog, tol-1, die Schutz gegen gramnegative Erreger Salmonella Typhimurium ¹¹ trägt, nicht aber von anderen getesteten Gram-negative oder-positive Erreger ^11,12. Diese Beobachtungen, zusammen mit Daten, die anzeigen, dass Immunantworten konnte durch Unterbrechung zellulären Proteintranslation h induziert werdenso führte einige darauf hin, dass C. elegans erkennt vor allem dämpft ^9,13,14. Dennoch deuten Berichte beschreiben Fähigkeit von toten Krankheitserreger, Immunantworten zu induzieren, dass PAMP Bindung kann eine wichtige Rolle in Krankheitserreger Anerkennung in C haben werden elegans ^15,16. Frühere Arbeiten mit Schwerpunkt auf Immunantworten in alters synchronisiert genetisch identisch C. elegans Populationen zeigten große individuelle Unterschiede in der Darmbesiedlung durch die bakterielle Gram-negative Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa.

Allerdings Transkriptionsprofilierung Studien behandelt diese variabel kolonisierten Bevölkerung als eine Einheit ^17,18. Unter Ausnutzung dieser Variabilität, wir ein Protokoll Fokussieren eines automatisierten wormsorter differentiell kolonisiert Populationen von Caenorhabditis elegans an GFP-exprimierenden S. ausgesetzt trennen entwickelten aeruginosa. Untersuchung der Genexpression in unterschiedlich kolonisierten Bevölkerung Facilitated Beurteilung der Beziehung zwischen Keimmenge (und der damit verbundenen Schädigung) und Immunreaktionen und lieferte neue Erkenntnisse über Pathogen Erkennung in C. elegans ^19. Nachfolgend beschreiben wir das Protokoll, die angewendet könnten, um Würmer mit einem Fluoreszenz-markierten Erreger infiziert zu sortieren.

Potenziellen Anwendern ist anzumerken, dass die Anzahl der Würmer erforderlich aussortiert werden müssen, hängt von der Art der nachfolgenden Analysen und Protokolle benutzt werden. Zum Beispiel im Fall von Microarray-Genexpressionsanalyse,> 1.000 Würmer werden benötigt, um genügend RNA zu erhalten, wenn Standard-Protokolle verwendet werden, aber ~ 100 Würmer würde genügen, wenn Verstärkung eingesetzt wird, die eine schnelle Sammlung von Material und damit Minimierung von Stress zu die Würmer.

Protokoll

1. Die Erteilung einer Synchronized Kultur Junger Erwachsener Tiere

1. Würmer wachsen auf mehreren NGM-Platten mit OP50-1 E. ausgesät coli-Bakterien (aus einer gesättigten Kultur 10x konzentriert), bis viele Würmer haben die schwangeren Stadium erreicht.
2. Gönnen trächtige Tiere mit Ei-Prep-Lösung, um eine synchronisierte Kultur (Eier) zu erhalten.
3. Platte Eier auf mehrere 60-mm NGM-Platten ausgesät mit 10x konzentrierter OP50-1 mit einer Dichte von etwa 150-200 Eier / Platte.
4. Platten bei 25 ° C für 2 Tage (bis Würmer haben die L4 erreicht - Young Adult Stufe).

2. Vorbereiten Pseudomonas aeruginosa infiziert Platten und Worms

1. Am Tag des Ei-Prep (Schritt 1.1) beimpfen eine PA14 :: GFP Kultur in 2 ml King-B-Medium, das Rifampicin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C unter Rühren O / N.
2. Platte der PA14 :: GFP Kulturtur auf so viele Slow-Killing-Platten (SKP), die für den Test benötigt. Auf jeder SKP 150 mm Petrischale Pipette 75-100 ul gesättigten Kultur und mit einem sterilen Glasverteiler gleichmäßig verteilt. Die Inkubation bei 37 ° C für 20-24 Stunden.
3. Platten entfernen Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf RT (~ 20 min) zu kühlen. Mit M9 Puffer, Wasch Würmer aus Schritt 1.4 auf PA14 :: GFP-Platten in einem minimalen Volumen der Flüssigkeit. Bei Verwendung von 150-mm-Platten, kann mehrere hundert Würmer auf einer einzigen Platte angeordnet sein.
4. Platten bei 25 ° C für 18-21 Stunden. Für P. aeruginosa-exponierten jungen erwachsenen Würmer, ist dies die Zeit Fenster, die optimale Verteilung der kolonisierten vs noncolonized Tiere.

3. Einrichten des Wormsorter

Vor der Durchführung der Proben Art, sicherzustellen, dass die Maschine richtig funktioniert. Details finden Sie in http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43 erhalten werden kann, und the wesentlichen Schritte sind unten aufgeführt.

1. Stellen Sie den Mantel Ventildruck auf ca. 5 psi (4,5-5,5 Bereich).
2. Um zu überprüfen, dass Mantel Fluiddurchsatz geeignet ist, legen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen unter dem Spender, schalten Sie den Mantel-Ventil, und schalten Sie den Sorter-Ventil. Halten Sie das Röhrchen unter dem Spender für 60 Sekunden. Das Volumen in dem Rohr sollte 9-10 ml betragen. Wenn es außerhalb dieses Bereichs ist, passen Sie die Hülle Ventildruck.
3. Um sicherzustellen, dass Mantel Fluiddurchsatz (wie in Schritt 3.2 festgelegt) werden genaue Sortierung zu ermöglichen, testen Sie die Sortierrate mit 40 um Steuer Partikel:
4. Schalten Sie den Mantel Ventil. In etwa 25 ml der Kontrolle Partikellösung zum Stausee.
5. Schalten Sie den Ventilmantel und dem Probenventil.
6. Auf der Computer-Software, gehen Sie zum "Steuerpartikel Modus" und klicken Sie erwerben.
7. Stellen Sie sicher, dass der Partikeldurchflussrate ~ 5-8 Teilchen / sec, mit einem TOF (Time Of Flight) in etwa der Breitedes Teilchens, 40 um. Solch ein TOF bedeutet, dass nur ein einziges Objekt 40 um durchläuft in einer Zeit. Wenn die Werte außerhalb dieses Bereiches, passen Sie die Einstellungen (nach der Beschreibung oben) entsprechend.

4. Die Sortierung kolonisiert vs Noncolonized Worms

1. Mit M9, waschen Würmer in 15 ml konischen Röhrchen. Lassen erwachsenen Würmer auf den Boden der Röhre durch die Schwerkraft sinken, und entfernen Sie den Überstand. Das Rohr wird mit frischem M9. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4x. Dies entfernt einen großen Anteil der Larven sowie überschüssige Bakterien und dauert etwa 10 min.
2. In Würmer an die wormsorter Behälter mit einem sanft-Mischen kleiner Rührstab.
3. Stellen anfänglichen Signalverstärkung durch Einstellen der Grün PMT auf 600 und die rote und gelbe PMT 200.
4. Start der Datenerfassung, um die Einstellungen anzupassen.
5. Ziel für eine Art Rate von 25 bis 30 Veranstaltungen (Würmer) pro Sekunde. Wenn die Anzahl Rate zu hoch ist, verdünnte die Würmer in dem Reservoir mit M9 entsprechend. Wenn die Rate ano niedrig ist, mehr Würmer in einem kleinen Volumen M9.
6. Wenn das Experiment erfordert eine sehr strenge Trennung der kolonisierten vs noncolonized Würmer, stellen Sie die "Koinzidenzprüfung" auf "reine". Dies gewährleistet, dass im Falle zweier Objekte zu nahe aneinander auftreten oder in der gleichen Tropfen, die Maschine weist die Tropfen nicht gesammelt wird.
7. Um die Bevölkerung von Interesse zu sortieren, ziehen Toren um die Achsen der Größe anzeigt (zu erwachsenen Würmern zu erhalten) und Fluoreszenz-Intensität (dh hoch für kolonisiert, niedrig für noncolonized). Die Werte für die Fluoreszenz Gating muss empirisch ermittelt werden.
8. Legen Sie ein Multi-Well-Platte oder eine Petrischale unter dem Spender, um Würmer zu sammeln öffnen Sie dann die Art Ventil Sortier Würmer zu beginnen.
9. Sammeln Sie eine kleine Population von Tieren, die unter dem Mikroskop, dass die Bevölkerung sortiert ist die Bevölkerung von Interesse zu überprüfen. Wenn nicht, passen Sie die Gating-Parameter und weiterhin mit Probenentnahme.

Ergebnisse

Wenn bei gleichaltrigen, genetisch identisch C. elegans sind P. ausgesetzt aeruginosa, wird eine breite Verteilung in Stufen der Kolonisation (Fig. 1A) beobachtet. Mit Hilfe des hier beschriebenen effiziente Trennung von noncolonized kolonisiert Würmer erreicht werden (Abbildung 1B) Protokoll. Im Gegensatz zu noncolonized Würmer, Würmer kolonisiert zeigen Anzeichen von Schäden, wie Trägheit und reduziert Stuhlgang ^19. Letzteres kann ein Grund, warum...

Diskussion

Die Methode, die wir beschreiben, nutzt Fluoreszenzmarkierung von Einrichtungen außerhalb der Schnecke, um Wechselwirkungen zwischen der Schnecke und ihrer Umgebung zu folgen. In dem Fall, wir präsentieren, wurde die Trennung über die Kennzeichnung von einem Krankheitserreger und wurde zu trennen Würmer mit schweren Krankheitserreger Last von diejenigen, die keine (oder Licht) Last eingesetzt. Nachfolgende Genexpressionsanalyse fanden keinen Unterschied in der Immunantworten zwischen den beiden Gruppen nahe legt, dass s...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
M9 Puffer	Haus		Rezept bei wormbook.org
Rifampicin	Sigma R3501
Eizubereitungslösung	Haus		hergestellt 50 ml Wasser; 40 ml Bleichmittel; 10 ml 10 N Natriumhydroxid
NGM-Platten	im Haus		Rezept bei wormbook.org
SKP-Platten	Haus hergestellt		Rezeptur wie NGM, nur 0,35 % Pepton statt 0,25 %
Kontrolltestpartikel	Union Biometrica	310-5071-001