Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.

Zusammenfassung

Pflanzen passen sich rasch an wechselnde Umgebungen aufgrund von Wahrnehmung und Signalanlagen zu erarbeiten. Während Erreger angreifen, schnell Pflanzen, um eine Infektion über die Rekrutierung und Aktivierung von Immunkomplexen zu reagieren. Aktivierung von Immunkomplexen wird mit post-translationalen Modifikationen (PTM) von Proteinen, wie Phosphorylierung, Glycosylierung, Ubiquitinierung oder verbunden. Verstehen, wie diese PTMs choreografiert werden zu einem besseren Verständnis, wie Widerstand erreicht führen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Proteinreinigung Nukleotid-bindenden leucine-rich repeat (NB-LRR)-interagierende Proteine ​​und die anschließende Identifizierung der post-translationalen Modifikationen (PTM). Mit kleinen Modifikationen kann das Protokoll für die Reinigung von anderen pflanzlichen Proteinkomplexen eingesetzt werden. Das Verfahren beruht auf der Expression eines Epitop markierte Version des Proteins von Interesse, das anschließend teilweise gereinigt wird b basierendy Immunpräzipitation und Massenspektrometrie zur Identifizierung von interagierenden Proteinen und PTMs unterzogen.

Dieses Protokoll zeigt, dass: i). Dynamische Änderungen in PTMs wie Phosphorylierung kann durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden, ii). Es ist wichtig, ausreichende Mengen des Proteins von Interesse, und dies kann für den Mangel an Reinheit des Immunpräzipitats kompensieren; iii). Um PTMs eines Proteins von Interesse zu erfassen, hat dieses Protein immunpräzipitiert werden, um eine ausreichende Menge an Protein zu erhalten.

Einleitung

Immunwege beruhen auf verschiedenen post-translationalen Modifikationen (PTM) von Proteinen schnell übertragen Signale und aktiviert Immunantworten ^1. PTMs sind schnell, reversibel und sehr spezifische chemische Veränderungen der Proteinstruktur, die Protein-Konformation, Aktivität, Stabilität, Lokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen ^04.02 beeinflussen können. In Pflanzen mehr als 300 Arten von PTM wurden identifiziert, einschließlich Ubiquitinierung sumoylation, Sulfatierung, Glycosylierung, Phosphorylierung und ^2,5. Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstreicht die Bedeutung der PTMs in verschiedene Aspekte der Anlagen Immunität ^1,5,6. Protein-Phosphorylierung, die reversible Befestigung einer Phosphatgruppe an ein Serin, Threonin oder Tyrosin-Rest ein Regulator von vielen Zellfunktionen und nicht überraschend die sehr sucht PTM im Pflanzenabwehrsignalkaskaden ^5-11. Phosphorylierungsabhängige Signalisierung ist ein integraler Bestandteil der Anlage Defensense Aktivierung initiiert nach extrazellulären Wahrnehmung von Mikroben durch Transmembranrezeptoren oder intrazelluläre Erkennung von Multidomänen-Resistenzproteine ^​​5,8.

Nach der Invasion Pflanzen, Mikroben, werden durch Plasmamembran-Rezeptoren genannt pattern recognition receptors (PRR) ¹² erfasst. Bekannt KFVs entweder Rezeptor-ähnliche Proteine ​​(RLP) oder Rezeptor-ähnliche Kinase (RLKs), beide, der eine Liganden-Bindungs ​​Ektodomäne und einem Single-Pass-Transmembrandomäne. Im Gegensatz zu RLPs haben RLKs eine intrazelluläre Kinase-Domäne ^13-15. Die Ektodomäne von PRRS bindet an konservierte Mikrobe Elicitor Moleküle genannt pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) führenden, im Falle RLKs, Autophosphorylierung und Transphosphorylierungs innerhalb der intrazellulären Domäne ^{6, 16.} Stromabwärts der Wahrnehmung-induzierte Phosphorylierung von PRRs anschließende Phosphorylierung von Zytoplasma-Proteinen, einschließlich Kinasen ^{17, 18,} E3-Ligasen ^19, Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) ^{20, 21,} Calcium-abhängigen Proteinkinasen (CDPK) ^{22, 23} und Transkriptionsfaktoren ^{24, 25} zu PAMP-Immunität ausgelöst (PTI).

Zusätzlich zu extrazellulären Wahrnehmung KFVs wird intrazelluläre Erkennung von Pathogenen durch zytoplasmatische Rezeptoren erzielt. Diese Multidomänen Widerstand (R)-Proteine ​​enthalten eine variable N-terminale Domäne, eine zentrale Nukleotid-Bindung (NB)-Motiv, und C-terminalen Leucin-reichen Wiederholungen (LRR) und damit NB-LRR Proteinen ^{26, 27} bezeichnet. R-Proteinen, die direkt oder indirekt erkennen pathogen-abgeleiteten Moleküle genannt Virulenz Effektoren bekannt PRRS und andere Knoten des Immunsystems Ziel. Anerkennung induziert starke Verteidigung, die zu-Effektor-Immunität ausgelöst (ETI) ^28-31. NB-LRR-Proteine ​​haben eine requisite ATP-Bindungsmotiv im NB-Domäne ^{30, 32,} aber es fehlt eine Kinase-Domäne. Die Phosphorylierung von konservierten Domänen von NB-LRR hat in einer groß angelegten Umfrage ^Proteom-33 berichtet worden, aber ihre Bedeutung für die ETI, ist unklar. Ähnlich wie PTI, Aktivierung der NB-LRR-Proteine ​​führt zu Phosphorylierung von Zytoplasma-Proteinen, einschließlich MAPK ^34-37 und ^38-40 CDPKs. Vor allem aber können Effektor Anerkennung Phosphorylierung von akzessorischen Proteinen, die direkt interagieren mit den NB-LRR-Proteine ^​​41 führen. Einige Beispiele sind RIN4 (Arabidopsis thaliana) und Pto (Tomaten, Solanum lycopersicum) Proteine, die mit NB-LRR-Proteine ​​interagieren, RPM1 ^{42, 43} und Prf ^44. Während der Infektion durch Pseudomonas syringae Bakterien, die Effektor-Protein induziert AVRB RIN4 Phosphorylierung, durch den Rezeptor-ähnliche Kinase RIPK ^{45 wahrscheinlich, 46. Auch in der Tomaten P. syringae Effektoren AvrPto und AvrPtoB induzieren die Phosphorylierung von Pto 47. Im Gegensatz zu RIN4, die eine Kinase-Domäne fehlt und muss trans-phosphoryliert werden, ist eine aktive Pto-Kinase in der Lage, Auto-Phosphorylierung 48 und trans-Phosphorylierung der Substrate 49, 50. Während Pto benötigt seine Kinase-Aktivität für die Effektor-abhängigen Initiation der Signalisierung sind Kinase-dead Pto Mutanten noch in der Lage, in einem Effektor-unabhängigen Weg 51 zu signalisieren. Wir haben vor kurzem erklärt, diese Beobachtungen durch den Nachweis, dass die Prf / Pto oligomeren Komplex ist, mit mehreren Prf und Pto Moleküle 52 und Pto Moleküle innerhalb der gleichen Komplex trans-phosphorylieren seitig 47. Wir ein Modell vorgeschlagen, in dem ein Molekül Pto (Sensor) mit dem Effektor-Protein, was eine Konformationsänderung an das NB-LRR-Protein (Prf), das wiederum aktiviert einen zweiten PTO-Molekül (Helfer) witHin die Anlage. Anschließend Molekül trans-phosphoryliert der Helfer den Sensor Pto Pto die volle Aktivierung der Widerstand Komplex 47 führt.}

Diese Beispiele zeigen, dass die Identifizierung der Immunkomplex-Komponenten und deren Potential PTM bei der Effekterkennung kann zu einem besseren Verständnis der Signale von Effektor Wahrnehmung nachgeschalteten Ziele transduzierte führen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Proteinreinigung NB-LRR-Proteine ​​interagieren und der anschließenden Identifizierung ihrer PTMs. Wir verwenden Nicotiana benthamiana und das Tomaten Prf / Pto Komplex als Modell, aber das gleiche Protokoll kann leicht zu RLKs von N. angewendet werden benthamiana und A. thaliana ⁵³ mit kleinen Änderungen, wie wir innerhalb des Protokolls zu beschreiben.

Protokoll

Hinweis: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Herstellung von pflanzlichen Materialien und Puffer

1. Für N. benthamiana
   1. Wachsen die Agrobakterium tumefaciens-Stämme von Interesse für die transiente Expression (in diesem Beispiel Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG und leeren Vektor als Kontrolle) durch Schütteln (200 rpm) in Flüssigkultur (L-Medium mit entsprechenden Antibiotika) bei 28 ° C bis zur stationären Phase.
   2. Sammeln und Pellet Agrobakterien durch Zentrifugation (3000 g für 5 min). Überstand verwerfen und resuspendieren pelletiert Agrobakterien in Infiltration Puffer.
   3. Messung der Menge der Agrobakterien durch Erhalten der optischen Dichte (OD)-Wert bei einer Absorption von 600 nm (Abs 600 nm). Stellen Sie die OD von Bakterien 0,1-0,8.
   4. Infiltrieren 4 Wochen alt N. benthamiana Pflanzen (22 ° C und 16 Stunden Licht) mit Agrobakterien durch hand (mit einer 1-ml-Spritze ohne Nadel) oder von Vakuum (0,02 hinzuzufügen% v / v Tensid).
      Hinweis: Mit der ersten nahezu vollständig ausgebaut Blatt, und die beiden älteren Blätter sofort für die effektivste Protein-Expression. Für den Nachweis von Ubiquitin oder acetylierte Proteine ​​infiltrieren Blätter mit 100 nM MG-132 oder 100 ng / ml Trichostatin A, jeweils bei 1 und 2 Tage nach der Infiltration.
   5. Ernten Sie die Blätter infiltriert 2-5 Tage nach der Infiltration und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Lagern Sie die Proben in einem -80 ° C Gefrierschrank.
      Hinweis: Ermitteln Sie die beste Höhe der Expression des Proteins von Interesse vorher durch die Entnahme von Proben über einen Zeitverlauf von 5 Tagen und Protein-Ebene zu erkennen durch Immunoblotting.
2. Für A. thaliana stabilen transgenen Linien
   1. Wachsen A. thaliana-Samen in 6-Well-Platten mit 5 ml flüssiges MS-Medium (1% w / v Saccharose) pro Vertiefung ergänzt. Legen Sie drei vor fünf Samen (sterilisiert und Schicht) der transgenen Linievon Interesse oder nicht transformierten Steuerleitung pro Vertiefung. Schütteln bei 200 rpm für zwei Tage vor der Übertragung die Platte zu einem Wachstumsraum und lassen für 2 Wochen (22 ° C, 10 h Licht).
   2. Ernte-Proben und in flüssigem Stickstoff einfrieren.
      Hinweis: Sie können als Steuer verwenden eine transgene Linie ein nicht verwandtes Protein exprimieren, mit dem gleichen Tag wie das Protein von Interesse.
3. Puffer
   1. Bereiten Buffer A. De-Gas den Puffer für 1-2 h (für RLKs, andere membrangebundenen Proteinen und Kernproteine, fügen Sie 1% v / v IGEPAL ^CA-630-53).
      Hinweis: Sie können Puffer A bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit zu halten. Sie können 1% v verwenden / v Triton statt IGEPAL CA-360.
   2. Bereiten Sie 80 ml kaltem Puffer B mindestens 1-2 Stunden vor der Extraktion.
      Hinweis: Das ideale Verhältnis von Gewebe gegen Extraktionspuffer 1:4 (w / v).

2. Proteinextraktion

1. Kurz vor der Extraktion vorzubereiten 80 ml kaltem Puffer C
   Hinweis: In 10 uM MG-132 für die Erkennung von Ubiquitin markierten Proteine.
2. Grind 20 g N. benthamiana Gewebe (ca. 15 Blätter) oder A. thaliana Keimlinge (2-4 g pro 6-well-Platte) in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel.
3. In 80 ml kaltem Puffer C auf die 20 g Grundgewebe, gut mischen und auf Eis auftauen.
   Hinweis: Grind alle Proben in der gleichen Zeit (Protein von Interesse und Kontrolle).
4. Homogenisieren mit 3 Ausbrüche von jeweils 10 Sekunden bei voller Geschwindigkeit mit einem Gewebe-Homogenisator (bei 4 ° C vorgekühlt). Filtriert durch ein 22-25 um Gewebe und Zentrifuge bei 30.000 × g für 30 min bei 4 ° C.
   Hinweis: Alternativ zu homogenisieren, mit einem frischen vorgekühlten Mörser und Stößel.
5. Für die Sperr-und Waschschritte der Affinitätsmatrix, werden 20 ml Puffer D
6. Block 100 ml der geeigneten Affinitätsmatrix unter Verwendung von 500 ml kaltem Puffer D, enthaltend 1% BSA für 5 min bei 4 ° C.
   Hinweis: Bevorzugte affinity Matrices umfassen Anti-FLAG-M2-Agarose, Streptavidin Agarose, GFP-Trap_A und Anti-HA-Agarose.
7. 3x Waschen mit 1 ml kaltem Puffer D
8. Entfernen der überstehenden Blattextrakt und filtriert durch ein 0,45 um-Spritzenfilter in ein neues Röhrchen auf Eis.
   Hinweis: Der Extrakt Farbe sollte grün oder gelb sein, wenn die Probe braun geworden, zu verwerfen und von vorn beginnen.
9. Einen aliquoten des Rohextraktes für Immunoblot, fügen 5x SDS-PAGE-Ladepuffer, Vortex und denaturiert durch Kochen Proben für 10 min bei 80-100 ° C in einem Wärmeblock.

3. Protein Immunpräzipitation

1. Teilen die Proteinextrakt in zwei 50 ml-Röhrchen und 50 ul der Affinitätsmatrix in Puffer D zu jedem Röhrchen suspendiert. Inkubieren mit leichter Rotation für 2 Stunden bei 4 ° C.
   Hinweis: Längere Inkubationen nicht gefunden worden, um die Ausbeute zu erhöhen.
2. Bereiten Sie 600 ul (6x Perle Volumen von Affinitätsmatrix) Elutionspuffer durch ZugabePuffer D (Endkonzentrationen): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG-Peptid (anti-FLAG-M2-Agarose) oder 10 mM D-Biotin (für Streptavidin-Agarose).
   Hinweis: Die Elution wird nicht im Falle von GFP-Trap_A und Anti-HA-Matrizen zu empfehlen, so gehen Sie direkt zu Kochen in 1x SDS-PAGE-Ladepuffer, Schritt 3.11.
3. Ausfällung der Affinitätsmatrix durch Zentrifugation bei 4 ° C (5 min bei 1000 × g).
4. Einen aliquoten des ungebundenen Extrakt für Immunoblot, werfen den Rest der Überstand, so dass etwa 500 ul im Boden des Röhrchens.
5. Resuspendieren den Schlamm-Lösung mit einer breiten Spitze-Bohrung.
6. Übertragen Sie die Mischaufschlämmung Lösung aus beiden Röhren auf eine einzige 1,5-ml-Tube.
   Hinweis: Von nun an verwenden 1,5 ml Low-Protein-Bindung Mikrozentrifugenröhrchen.
7. Pulse 3x für 5 Sekunden mit einer Tischzentrifuge, um die Affinität Matrix ausfallen und den Überstand entfernen.
8. Waschen 3-5x mit 1 ml kaltem Puffer D. Zwischen den Wäschen fallen die Affinität Matrix wie zuvor beschrieben, und den Überstand verwerfen. In der letzten Wasch überschüssige Puffer D mit der Nadel einer Spritze.
   Hinweis: Eine letzte Waschung mit Puffer D mit 0,1% IGEPAL kann verwendet werden, um weiter zu reduzieren unspezifische Bindung werden.
9. Eluieren mit 200 ul der geeigneten Elutionspuffer (für Anti-FLAG-M2-Agarose oder Streptavidin siehe Schritt 3.2), 3x, jeweils 5 min unter konstantem Schütteln.
10. Pool die 3 Eluate in einem einzigen Rohr. Konzentrieren sich die Proteine, die durch Verwendung von 30 ul Absorptionsharz. Vortex stehen lassen für 5 min und fällt das Harz (2 min bei 10.000 × g). Überstand verwerfen.
    Hinweis: Für die GFP-Trap_A und Anti-HA Agarose, überspringen Sie die Schritte 3.9 und 3.10.
11. In 50 ul 1x SDS-PAGE-Ladepuffer, um das ausgefallene Affinitätsmatrix oder Absorptionsharz. Vortex und kochen für 10 Minuten bei 80-100 ° C in einem Wärmeblock.
12. Zentrifuge das gekochte Affinitätsmatrix oder Harz für 2 min bei 10.000 x g. Aliquot 5 ul der supernatant für Immunoblot und mit anderen Fraktionen laufen auf eine ~ 10 cm lang SDS-PAGE-Gel (Abb. 2).
13. Für die Trennung und Identifizierung von phosphorylierten Proteinen durch Massenspektrometrie, laden die restlichen 45 ul auf eine ~ 19 cm langen SDS-PAGE-Gel, wenn zusätzliche Trennung erforderlich ist (Abbildung 2).
    Hinweis: Eine leere Gasse zwischen allen Proben aufgenommen werden, um eine Kontamination der Proben zu reduzieren.

4. Protein Verdauung

1. Flecken auf der SDS-PAGE-Gel mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue (CCBB) Fleck.
   Hinweis: Minimieren Handhabung des Gels, um eine Kontamination mit Keratine reduzieren. Stellen Sie sicher, dass keines der Geräte oder Werkzeuge für Immunoblotting oder andere Aktivitäten, die Restproteinkontamination verlassen haben könnte verwendet worden.
2. Entfärben des Gels mit reichlich Waschen in Wasser, vorzugsweise O / N. Schneiden Sie das Band von Interesse aus dem Gel mit einem sauberen Rasierklinge.
   Hinweis: Richten Sie das Gel mit dem Immunoblot wenn necessary, um die richtige finden. Wie kann die Migration Phosphorylierung von Proteinen auf SDS-PAGE verzögern schneiden den Bereich unmittelbar oberhalb und unterhalb der Band von Interesse.
3. Würfeln Gelscheibe in Würfel von 2-4 mm (dies stellt sicher, dass das Gel von Lösungen in der Röhre, ohne zu blockieren Pipettenspitzen abgedeckt werden). In einem Rohr.
4. Schätzen Sie die erforderlich ist, um das Gel auch unter Wasser zu halten Lautstärke. Verwenden Sie diesen Betrag für die Derivatisierung, Inkubation mit Protease-und Peptid-Extraktion, und verwenden Sie dann doppelt auf dreifache Volumen zum Waschen.
   Anmerkung: Bei einer typischen Synthese mit etwa 100 ul der geschnittenen Gelstücke, verwenden 500 &mgr; l Waschlösung, 2 x 180 ul zur Dehydratisierung, 150 &mgr; l für die Reduktion, 120 &mgr; l für die Alkylierung, und 120 &mgr; l für die Verdauung.
5. Durch Zugabe von 50% Acetonitril (in 50 mM Ammoniumbicarbonat, ABC) Waschen der Gelstücke 2 x 20 min (oder bis entfärbt). Pipettieren Sie die Lösung dabei nicht zu Gel-Stücke zu entfernen.
6. Entwässern mit 100% AcetoNitril für 5 min und entfernen freie Flüssigkeit.
   Hinweis: Das Gel sollte geschrumpft und weiß erscheinen. Wenn die blaue Farbe bestehen bleibt, länger inkubieren in Acetonitril / ABC und / oder bei erhöhter Temperatur (45-55 ° C).
7. Reduzieren Protein Disulfidbrücken durch Zugabe von 10 mM DTT in Wasser und Inkubation für 30-45 min bei 56 º C unter Schütteln. Freie Flüssigkeit.
8. Alkylatqualität Cysteinreste durch Zugabe von 55 mM chloracetamid (in 50 mM ABC) für 20-30 min (Raumtemperatur, dunkel). Freie Flüssigkeit.
9. Mit 50% Acetonitril (in 50 mM ABC) waschen Gel-Stück 2 x 10 min. Freie Flüssigkeit.
10. Entwässern Gelstücke mit 100% Acetonitril für 5 Minuten, und entfernen Sie freie Flüssigkeit.
11. Für die Trypsin zu verdauen, dann werden 40 ul Trypsin-Arbeitslösung (100 ng Trypsin in Verdauungspuffer: 50 mM ABC, 5% Acetonitril für einen durchschnittlichen Coomassie-gefärbten Bande). Lassen Gelstücke 10 min deinen Durst. Fügen Sie genug Puffer, um der Verdauung Gelstücke bei Bedarf zu decken. Bei 37 º CO / N.
12. Um die Verdauung zu stoppen und extrahieren Sie die Peptide aus den Gel-Stücke, mit 5% iger Ameisensäure (in 50% Acetonitril) (fügen Sie das gleiche Volumen wie die Verdauung Lautstärke). Beschallen für 5-10 min. Den Überstand in neue Röhre. Die Extraktion 3x.
13. Trocknen der Peptide durch Lyophilisation (bevorzugt) oder ein Vakuum-Konzentrator (wie Speed-Vac oder Savant). Lagerung bei -20 ° C.
14. Reichen Sie Ihre Probe für die Massenspektrometrie.
    Hinweis: Wir haben unsere Probe auf die Massenspektrometrie-Anlage an der Sainsbury Laboratory (Norwich, UK). Protokolle auf Massenspektrometrie Einrichtungen sind sehr unterschiedlich, aber in der Regel Peptide in 0,2% Trifluoressigsäure mit 2% Acetonitril, bevor sie auf einem Flüssigkeits-Chromatographie-System gekoppelt, um Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie aufgelöst werden.

Ergebnisse

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Reinigung der markierten Proteine ​​aus stabilen transgenen A. thaliana-Linien oder nach transienter Expression von Proteinen in N. benthamiana. Wie in Fig. 1 veranschaulicht die Reinigung des Zielproteins mit Massenspektrometrie gekoppelt, um die Identifizierung von interagierenden Proteinen und den PTM des Zielproteins zu ermöglichen. Das Protokoll wurde für die Reinigung von Proteinen in pflanzlichen Immunität und Identifizierung ihrer PTMs beteiligt entwickelt, kann aber auf die Reinigung von jedem markiert Pflanzenprotein aufgetragen werden.

Als Beispiel verwenden wir die Reinigung des Prf / Pto-Komplexes aus N. benthamiana. Die transgenen N. benthamiana Linie 38-12 ^54, zum Ausdruck 35S: Pto wurde vorübergehend mit 35S verwandelt: Prf-FLAG und der Komplex wurde mit Anti-FLAG-M2-Agarose (2A) immunpräzipitiert. Die Immunoblots (IB) in 2Azeigen, dass die meisten Zielprotein (Prf) immunpräzipitiert wurde. Zapfwelle und das wechselwirkende Protein AvrPtoB Effektorzellen wurden mit Prf gemeinsam gereinigten und unter Verwendung von Antikörpern und Massenspektrometrie-Analyse (Fig. 2A und 2B). Wir fanden, dass die Zapfwelle, die mit Prf gemeinsam gereinigten langsamer migriert auf SDS-PAGE-Gel, wenn es mit der Effektor-Konstrukte 35S coexprimierten: AvrPto und 35S: AvrPtoB (Abbildung 2A). Beide Effektor-Proteine ​​induzierte langsamere Migration der Prf-Interaktion Pto (Abbildung 2A). Diese Anerkennung Effektor-abhängigen langsame Wanderung von Puerto wurde zuvor die Phosphorylierung zugeschrieben, wie es konnte durch die Behandlung mit Phosphatase ⁴⁴ entfernt werden. Um die Phosphorylierungsstellen, die zur langsamen Migration von Pto erkennen, unterzogen wir die Prf copurifying Pto Massenspektrometrie-Analyse. Trotz der hohen Expression von Puerto und die einfache Detektion mit Immunoblots konnten wir Peptide c abrufenovering nur 57% der Pto-Sequenz und wir konnten keine Phosphorylierungsstellen (2B) zu identifizieren.

Anschließend wechselten wir Strategien, um das Pto Protein mit anti-FLAG. N. Ziel Prf-3HA und 35S: Pto-FLAG, mit oder ohne 35S: AvrPto und 35S: benthamiana WT Pflanzen wurden vorübergehend mit 35S umgewandelt. AvrPtoB Der Gesamtbetrag der Pto Protein, das sowohl die Prf-komplexierten und die freien Formen, war immunpräzipitiertem mit Anti-FLAG-M2-Agarose-und SDS-PAGE-Fraktionierung, in-Gel-Trypsin-Verdauung und massenspektrometrische Analyse (2C) unterzogen. Mit diesem Ansatz haben wir festgestellt Pto Peptide überspannt etwa 80% seiner Sequenz und eine unbekannte 100 kDa interacting protein. Wir identifizierten eine Reihe von Einzel-und Doppel Phosphorylierungsstellen für Pto Peptide 187-202 und 188-202 (Tabelle 1). Ser-198 und Thr-199 waren die vorherrschenden Phosphorylierungsstellen aber andere phosphorylation Stellen wurden ebenfalls nachgewiesen (Tabelle 1). Am wichtigsten Doppel Phosphorylierung an Ser-198 und Thr-199 wurde nur in Gegenwart von entweder Effektor-Protein (Tabelle 1) identifiziert. Wir haben kürzlich eine ähnliche Reihe von Pto Phosphorylierungsstellen und illustriert die Bedeutung der Doppel Phosphorylierung zur Signalisierung ^47. Nach dem hier beschriebenen Protokoll waren wir in der Lage, um dynamische Änderungen im Phosphorylierungszustand des Zielproteins zu identifizieren.

Fig. 1 ist. Allgemeine Versuchsplanung. Das Zielprotein zur Immunpräzipitation (IP) wird markiert und in der Pflanze exprimiert, transient in Nicotiana benthamiana oder stabil in Arabidopsis thaliana. Nach der ProteinextraktionZielproteins mit einer Affinitätsmatrix immunpräzipitiert. Die Proteine ​​werden auf einem Acrylamid-Gel durch Elektrophorese getrennt. Gel Banden ausgeschnitten. Proteine ​​werden aus dem Gel extrahiert und Bänder Massenspektrometrie unterworfen. Phosphorylierungsstellen und interagierende Proteine ​​identifiziert werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 2. Prf und Pto Immunpräzipitation. A). Die Konstrukt 35S: Prf-FLAG wurde vorübergehend in 38-12 Linie (35S: Pto) ausgedrückt zusammen mit leerem Vektor (EV), 35S: 35S oder AvrPto: AvrPtoB. Drei Tage nach der Infiltration Prf wurde mit anti-FLAG-Affinitätsmatrix immunpräzipitiert. Immunoblots (IB) für Prf, AvrPtoB und Pto wurden durchgeführt. Wie durch die Pfeile am unteren Rand des Pto Immunoblot Tafel hingewiesen, AvrPto und AvrPtoB induzieren eine langsamere Migration von Pto. B). Die Konstrukt 35S: Prf-FLAG wurde vorübergehend in 38-12 Linie (35S: Pto) ausgedrückt zusammen mit leerem Vektor (EV), 35S: 35S oder AvrPto: AvrPtoB. Drei Tage nach der Infiltration Prf wurde mit anti-FLAG-Agarose immungefällt und auf SDS-PAGE getrennt. Das Gel wurde mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue (CCBB) und der sichtbaren Prf gefärbt wurden Pto AvrPtoB und Proteine ​​aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie analysiert. Der Prozentsatz Peptid Abdeckung der Zapfwelle und Prf-Sequenzen durch Massenspektrometrie identifiziert wird angezeigt. C). Die Konstrukte 35S: Prf-3xHA und 35S: Pto-FLAG wurden transient mit 35S ausgedrückt: AvrPtoB, 35S: AvrPto oder Leervektor (EV) in N. benthamiana. Drei Tage nach der Infiltration die GesamtmengePto-FLAG wurde mit Anti-FLAG-Agarose immunpräzipitiert und auf SDS-PAGE aufgelöst. Die sichtbare und Pto Pto-interacting protein Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie analysiert. Zapfwelle und die 100 kDa Pto-interacting protein Band sind deutlich auf dem kolloidalem Coomassie Brilliant Blue (CCBB) gefärbt-Gel sichtbar, während Prf ist etwas weniger sichtbar (wie durch Pfeile angedeutet). IP: Immunpräzipitation; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant-Blau-Färbung; CCBB: kolloidalem Coomassie Brilliant Blue Färbung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

	Prf
	EV	AvrPto	AvrPtoB
Pto Peptid 188-202
GTELDQ [S. 195 T] HLSTVVK	1	1	0
GTELDQTHL [S. S 198] TVVK	10	7	5
GTELDQTHLS [S. 199 T] VVK	8	3	4
G [p T 190] ELDQTHLS [S. 199 T] VVK	0	1	2
GTELDQTHL [S. S 198] [p T 199] VVK	0	8	4
GTELDQTHLSTVVK	46	26	48
Pto Peptid 187-202
KGTELDQ [S. 195 T] HLS TVVK	0	1	0
KGTELDQTHL [S. S 198] TVVK	17	17	12
KGTELDQTHLS [S. 199 T] VVK	4	2	2
KGTELDQ [S. 195 T] HLS [S. 199 T] VVK	0	1	1
KGTELDQTHL [S. S 198] [p T 199] VVK	0	7	5
KGTELDQTHLSTVVK	21	37	18
Peptide 187-202 und 188-202	83	88	50
Prozentualer Anteil der Peptide mit zwei Phosphorylierungsereignisse	0%	26,9%	11,2%
Pto Sequenzabdeckung	78%	79%	82%

Tabelle 1 Doppel Phosphorylierung einer Pto Peptid bei der Aktivierung von Signal 35S:.. Prf-3xHA und 35S: Pto-FLAG wurden transient mit em ausgedrücktPTY Vektor (EV), 35S: 35S oder AvrPto: AvrPtoB in N. benthamiana. Drei Tage nach der Infiltration die Gesamtmenge der Pto-FLAG-Protein wurde unter Verwendung von Anti-FLAG-Affinitätsmatrix immunpräzipitiert und auf SDS-PAGE aufgelöst. Die sichtbaren Banden von Pto auf der kolloidalen Coomassie-Brilliantblau gefärbten Gel ausgeschnitten und mit der Massenspektrometrie analysiert. Die Anzahl der Pto Peptide mit 0 identifiziert, 1 und 2 Phosphorylierungsereignisse angezeigt.

Tabelle der Puffer
L-Medium	Tryptone	10 g / L
	Hefe-Extrakt	5 g / L
	NaCl	5 g / L
	D-Glucose	1 g / L
Agro-Infiltration Puffer	MgCl 2	10 mM
	MES	10 mM
	Auf pH 5,5
	Acetosyringon (optional)	150 uM
Puffer A	Tris-HCl pH 7,5	150 mM
	NaCl	150 mM
	EDTA	5 mM
	EGTA	2 mM
	Glycerol	5% (v / v)
Puffer B	Puffer A
	PVPP	2% (w / v)
Puffer C	Puffer B
	Dithiothreitol (DTT)	10 mM
	Pflanzen Protease Inhibitor Cocktail	1% (v / v)
	Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	0,5 mM
	Calyculin A	50 nM
	Natriumfluorid (NaF)	50 mM
	Natriummolybdat (Na 2 MoO 4)	10 mM
	Natriumorthovanadat	1 mM
	Okadainsäure	100 nM
Puffer D	Puffer C ohne PVPP
5x SDS-PAGE-Ladepuffer	Tris-HCl pH 6,8	60 mM
	SDS	2%
	Glycerol	0,15%
	Bromphenolblau	0,10%
	DTT (fügen Sie einfach vor Gebrauch)	50 mM

Tabelle 2. Puffer und Medien-Rezepte.

Diskussion

Die Aufklärung des Mechanismus der Rezeptoraktivierung durch PAMPs und Effektoren können wesentlich zum Verständnis von Pflanzen Immunität beitragen. In den letzten 20 Jahren haben genetische und Hefe-Zwei-Hybrid-Screens war maßgeblich für die Entdeckung des KFV und NB-LRR-Proteine. Kürzlich wurden Massenspektrometrie-basierte Protokolle für die Identifizierung von Proteinen in Immun differentiell Signalisierungs ^55-58, deren PTMs ^11,33,59,60 geregelt etabliert, die Zusammensetzung der Immunkomplexe ⁶¹ und ⁶² richtet Effektor. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Identifizierung von PTMs Regulierung der Aktivierung von Immunkomplexen.

Im Vergleich mit den zuvor beschriebenen Protokolle ermöglicht dieses Protokoll die detaillierte Ermittlung der dynamischen Veränderungen PTMs. Protokolle von Groß Proteomik Ansätze können PTMs der Proteine ​​zu identifizieren, sind aber nicht in der Lage, die Website Plastizität PTMs aufgrund begrenzen zeigened Proteinmengen. Bei der Protein-Phosphorylierung, Groß Proteomik Ansätze in der Regel nur identifizieren die vorherrschende Phosphorylierungsstellen ^11,33,59. Die detaillierte Charakterisierung eines Proteins Phosphorylierungsstatus erfordert eine erhebliche Menge an Protein, die nur durch teilweise Reinigung des Zielproteins ⁴⁷ erhalten werden können. Das hier beschriebene Protokoll Paare eine Proteinreinigung Ansatz, der eine wesentliche Menge des Zielproteins führt, mit der Massenspektrometrie-Analyse des gereinigten Proteins. Nach diesem Protokoll wurde die Einzel Phosphorylierung von Puerto überwiegend an Ser-198 zugeschrieben, wie zuvor beschrieben, aber einige ^{52-Massenspektrometrie} Spektren auch eine einzelne Phosphorylierung an Thr-195 oder Thr-199 unterstützt. Wenn Doppel Phosphorylierungsereignisse von Puerto beobachtet wurden, die vorherrschende Kombination von Aminosäuren phosphoryliert war Ser-198 und Thr-199, obwohl Kombinationen auf anderen Websites wurden ebenfalls beobachtet (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Phosphorylierungsstelle Plastizität von Proteinkinasen und die Fähigkeit des beschriebenen Protokolls, im Detail beschreiben sämtliche möglichen Phosphorylierungsstellen.

Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind: 1) ausreichende Extraktion von Proteinen, 2) Schutz des PTMs, und 3) ausreichende Menge an Zielprotein. Erste, für eine ausreichende Extraktion von Proteinen, ist es wichtig, das Gewebe in flüssigem Stickstoff zermahlen und anschließend in ein Gewebe-Homogenisator verwendet, wie im Protokoll beschrieben. Wenn ein Gewebe-Homogenisator nicht verfügbar ist, kann ein Mörser und Pistill verwendet werden. Es ist auch wichtig, ein Verhältnis von eins zu drei (oder vier) Gramm Gewebe zu Volumen Extraktionspuffer verwenden. Dieses Gewebe-Verhältnis und die hohe Festigkeit Puffer, die wir vorschlagen Puffer stellt sicher, dass der pH-Wert während der Extraktion neutral bleiben. Wir fanden, dass dies ist von besonderer Bedeutung für A. thaliana und Tomate Extractions ^52. Schutz der PTM kann, indem in allen Puffern geeignete Inhibitoren von Enzymen, die PTM zu entfernen, kann erreicht werden. Es ist auch wichtig, um alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen und Puffer und Instrumente Vorkühlung. Höhere Ausbeuten an Zielprotein kann durch die Verwendung von Pflanzen, die das Protein exprimieren, in ausreichenden Mengen und unter Verwendung von hohen Mengen an Gewebe (etwa 20 g) erreicht werden. Der entscheidende Schritt für den Erhalt von ausreichenden Mengen an Zielprotein Konzentration des Zielproteins durch direkte Immunopräzipitation. Die Bedeutung dieses Schrittes durch unser Versagen, PTMs von Pto nach einer Immunpräzipitation Prf aufgrund der begrenzten Menge an co-immunpräzipitiert Pto (2B) identifizieren hervorgehoben. Im Gegensatz direkte Immunopräzipitation von Pto ergab deutlich mehr messbar Peptide (Fig. 2C), die zu etwa 80% Abdeckung der Proteinsequenz und Identifizierung von PTM (Tabelle 1). Wir haben auch strongly empfehlen die Verwendung von Epitop-Tags für Protein Immunpräzipitation. Im Vergleich zu Antikörpern gegen native Proteine ​​Epitop-Tags Affinitätsmatrix angehoben werden können, höhere Mengen an teilweise gereinigten Protein zu erhalten. Durch die Verwendung eines Antikörpers gegen Mutter Pto Protein ⁵¹ (2A) für die Immunpräzipitation erhoben, konnten wir nur einzelne Phosphorylierung der beiden vorherrschenden Phosphorylierungsstellen von Puerto identifizieren.

Dieses Protokoll wurde in erster Linie für die partielle Reinigung von N. entwickelt benthamiana Zytoplasma-Proteinen und anschließende Identifizierung der Phosphorylierungsstellen. jedoch unter Verwendung der hier beschriebenen Änderungen, dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, für A. thaliana Proteine ​​und membrangebundenen Proteinen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen des Zielproteins für die Identifizierung von PTMs Ausbeute und die höchste Reinheit des Komplexes nicht zu erreichen. Wenn höhere Reinheitdes Komplexes benötigt einen zweiten Schritt der Reinigung kann dieses Protokoll ⁵² hinzugefügt werden. In diesem Fall wird der erste Schritt ermöglicht die Elution des Zielproteins von der Affinitätsmatrix ohne die Verwendung von hohen Salzen oder Säure und dem nachfolgenden Schritt kann eine Matrix beinhalten, welche harte Elutionsbedingungen erfordert. Es ist wichtig zu betonen, dass wir nur dieses Protokoll getestet, für die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen und dass wir testen derzeit ihre Fähigkeit zur detaillierten Ermittlung der zusätzlichen PTMs.

Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen deutlich die Phosphorylierungsstelle Plastizität von Proteinkinasen und die Fähigkeit des beschriebenen Protokolls zu Phosphorylierungsstellen charakterisieren. Am wichtigsten ist, markieren Sie sie, dass die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen die sich in geringen Menge von Proteinen durch Massenspektrometrie und durch einzelne Punktmutationen von Auto-Phosphorylierungsstellen kann verwirrend Ergebnisse. Wir zeigen hier und zuvor ⁴⁷ Doppel, dass die Phosphorylierung von Pto auf Ser-198 und Thr-199 ist mit der Aktivierung des Prf / Pto Komplex assoziiert. Dagegen bisher veröffentlichten Ergebnisse zeigen, dass ^47,63 Einzelpunktmutationen von Ser-198 und Thr-199 zu Alanin, die Phosphorylierung an diesen Stellen eine Voraussetzung für komplexe Aktivierung zu verhindern, sind in der Lage von Signalisierungs darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung dieser Seiten ist nicht . Diese Ergebnisse können nun durch Phosphorylierung des sekundären Standorts Thr-195 erläutert. Ähnliche Einblick in die Phosphorylierungsstelle Plastizität von anderen Proteinkinase kann nach diesem Protokoll erhalten werden. Ferner ist ein kombinierter Ansatz aus Phosphorylierungsstellen Punktmutationen, Proteine, die spezifische Kinasen (Effektoren), die mit Protein-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie-Analyse zu hemmen, kann zu einem besseren Verständnis der Bedeutung der Evolutions Phosphorylierungsstelle Plastizität von Protein-Kinasen führen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MgCl2	Sigma	M8266
MES	Sigma	M8250
Acetosyringon	Sigma	D134406	toxisch - 1 M Vorrat an DMSO
Spritze 1 ml sterile	Terumo
Spritzennadel	Terumo	NN-2525R
Silwet L-77 (Tensid)	Lehle Seeds	VIS-01
toxisch MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)	Sigma	C2211	1 M Lagerbestand in DMSO, lagern bei -80 ° C
MS Salze	Sigma	M5524	oxidierende, giftige
Saccharose	Sigma	16104
Trizma base	Sigma	T1503	pH mit 1 N HCl auf 1 M einstellen Tris-HCl Puffer
NaCl	Sigma	S3014	5 M Lager
EDTA	Sigma	E6758	giftig - 0,5 M Lager
EGTA	Sigma	E4378
Glycerol	National Diagnostics	EC-606
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896	ätzend
PVPP (Polyvinylpolypyrrolidon)	Sigma	P5288	nicht verwechseln mit PVP
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma	43815	giftig - 1 M Lagerbestand, lagern bei -20 ° C
Pflanzenproteasehemmer Cocktail	Sigma	P9599	friert/taut nicht zu oft auf
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)	Sigma	P7626	ätzend, giftig
Calykulin A	Cell Signaling Technology	9902
Natriumfluorid (NaF)	Sigma	S7920	giftig - 1 M Lager
Natriummolybdat (Na2MoO4)	Sigma	S6646	0,5 M Lager
Natriumorthovanadat (Na3VO4)	Sigma	450243	toxisch - Bereiten Sie eine 200 mM Lösung von Natriumorthovanadat vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 10,0 ein, indem Sie entweder 1 N NaOH oder 1 N HCl verwenden. Der Ausgangs-pH-Wert der Natriumorthovanadat-Lösung kann je nach Menge der Chemikalie variieren. Bei einem pH-Wert von 10,0 färbt sich die Lösung. Kochen Sie die Lösung, bis sie farblos wird (ca. 10 Minuten). Auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Stellen Sie den pH-Wert wieder auf 10,0 ein und wiederholen Sie die Schritte 3 und 4, bis die Lösung farblos bleibt und sich der pH-Wert bei 10,0 stabilisiert
Okadainsäure	Santa Cruz Biotechnologie	sc-3513
Kinematica Polytron Gewebehomogenisator	Fisher Scientific	08-451-320
Miracloth	Merck Millipore	475855-1R
anti-FLAG M2 Agarose	Sigma	A2220	diese Matrix wird empfohlen
Streptavidin-Agarose	Thermo-Scientific	20347	diese Matrix wird empfohlen
GFP-Trap_A	Chromotek	gta-20	diese Matrix wird empfohlen
Anti-HA-Agarose	Sigma	A2095	diese Matrix wird
empfohlen 0,45 μ m Filter	VWR	513-1902
BSA	Sigma	A7906
FLAG Peptid	Sigma	F3290
D-Biotin	Sigma	47868
StrataClean	Harz Agilent	400714	dieses Absorptionsharz wird für die Proteinfällung empfohlen
Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad
PROTEAN II XL Cell	Biorad
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	dieser Farbstoff wird empfohlen
Protein niedrig bindende Röhrchen (LoBind)	Eppendorf	0030 108.116	diese Röhrchen werden empfohlen
Ammoniumbicarbonat (ABC)	Sigma	9830	giftig
Acetonitril	VWR	83639	giftig, brennbar
2-Chloracetamid	Sigma	22790	giftig
Trypsin	Promega	V5280	reizend, sensibilisierend
Ameisensäure	Sigma	14265	giftig, ätzend
Wasserbad-Ultraschallgerät	Ultravawe	Ultra BT Ultraschallbad
LTQ-Orbitrap XL	Thermo-Scientific
Trichostatin A	Sigma	T8552	giftig