Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

Temperatur ist ein allgegenwärtiger Umwelthinweis. Tiere zeigen eine Vielzahl von Verhaltensweisen, um schädliche Temperaturen zu vermeiden und bequeme zu suchen. Drosophila weisen ein robustes Temperaturpräferenzverhalten^{auf 6,7}. Wenn Fliegen in einen Temperaturgradienten von 18-32 °C freigesetzt werden, vermeiden die Fliegen sowohl warme als auch kalte Temperaturen und wählen schließlich eine bevorzugte Temperatur von 25 °C am Morgen³. Die Warmtemperatursensoren sind eine Reihe von thermosensorischen Neuronen, AC-Neuronen, die Drosophila transienten Rezeptor-Potential (TPR) Kanal, TRPA1^6,9express. Die Kalttemperatursensoren befinden sich in den 3. Antennensegmenten, da das Abtragen der 3. Antennensegmente das Fehlen von Kalttemperaturvermeidung⁶verursacht. Kürzlich wurde das TRPP-Protein Brivido (Brv) identifiziert¹⁰. Da Brv in den 3. Antennensegmenten exprimiert wird und die Kalterkennung vermittelt, ist Brv ein mögliches Kaltsensormolekül, das für das Temperaturpräferenzverhalten entscheidend ist. Insgesamt verwenden die Fliegen diese beiden Temperatursensoren, um die warmen und kalten Temperaturen zu vermeiden und eine bevorzugte Temperatur zu finden.

Während Säugetiere Wärme erzeugen, um ihre Körpertemperatur zu regulieren, passen Ektoremen ihre Körpertemperaturen in der Regel an die Umgebungstemperatur¹¹an. Einige Ektothermen sind dafür bekannt, ein tägliches TPR-Verhalten zu zeigen, von dem angenommen wird, dass es eine Strategie für die Ektothermen ist, ihre BTR¹²zu regulieren. Um festzustellen, ob die Fliegen TPR aufwiesen, wiederholten wir die Temperaturpräferenz-Verhaltensanalyse an verschiedenen Punkten während einer Spanne von 24 Stunden. Wir fanden heraus, dass Drosophila eine tägliche TPR aufweisen, die morgens niedrig und abends hoch ist und einem ähnlichen Muster wie BTR beim Menschen folgt¹³.

In Drosophilagibt es 150-Uhr-Neuronen im Gehirn. Die Uhrenneuronen, die die motorische Aktivität regulieren, werden M- und E-Oszillatoren genannt. Interessanterweise regulieren M- und E-Oszillatoren jedoch tPR nicht, stattdessen zeigten wir, dass DN2-Uhrenneuronen im Gehirn TPR regulieren, aber nicht die motorische Aktivität. Diese Daten deuten darauf hin, dass TPR unabhängig von der Motoraktivität reguliert wird. Insbesondere ist die BTR von Säugetieren auch unabhängig von der motorischen Aktivität reguliert. Ablationsstudien an Ratten zeigen, dass BTR durch spezifische SCN-Neuronen gesteuert wird, die auf eine andere Teilmenge subparaventrikulärer Zonenneuronen abzielen als solche, die die motorische Aktivität steuern¹⁴. Daher sehen unsere Daten die Möglichkeit in Betracht, dass die Säugetier-BTR und die Fliege TPR evolutionär konserviert sind³, da sowohl Fliegen-TPR als auch Säugetier-BTR zirkadiane uhrabhängige Temperaturrhythmen aufweisen, die unabhängig von der motorischen Aktivität reguliert werden.

Hier beschreiben wir die Details, wie man den TPR-Verhaltenstest in Drosophilaanalysiert. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nicht nur des molekularen Mechanismus und der neuronalen Schaltkreise von TPR, sondern auch, wie das Gehirn verschiedene Umwelthinweise und innere biologische Uhren integriert.

1. Vorbereitung von Fliegen

1. Light Dark (LD) Experimente
   1. Heben Sie Fliegen in Inkubatoren (25 °C/40-60%relative Luftfeuchtigkeit (RH)) unter lichten 12 Std/dunkel 12 Std.(LD) Zyklen. Die Lichtintensität der Inkubatoren beträgt 500-1.000 Lux.
   2. Zwei Inkubatoren sind notwendig, um die Verhaltenstests über einen Zeitraum von 24 Stunden abzuschließen. Beide Inkubatoren sollten ein programmierbares Licht mit ON OFF-Funktionen haben. Sie sollten auch feste Türen haben, die nicht lichtdurchlässig sind(d.h. kein Glas oder Plexiglas).
      Hinweis: Ein Inkubator sollte als "Tag"-Inkubator bezeichnet und auf einen LD-Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit eingestellt werden. Der zweite Inkubator sollte als "Nacht"-Inkubator bezeichnet und auf die Umkehrung des ersten mit 12 Stunden Dunkelheit, gefolgt von 12 Stunden Licht gesetzt werden. Der Nachtbrutkasten muss in dem Raum platziert werden, der im Dunkeln zugänglich ist, so dass Fliegen, die Nachtbedingungen erleben, für die Experimente leicht zugänglich sind.
   3. Platzieren Sie die Fliegenfläschchen entweder in Tages- oder Nachtbrutstätten. Sammeln Sie frisch geschlüpfte Fliegen in einer frischen Durchstechflasche, 20-30 pro Test und halten Sie im gleichen Inkubator für 2-3 Tage.
   4. Nach 2-3 Tagen, verwenden Sie Fliegen für die Temperatur Präferenz Verhaltenstest.
      1. Für Tag (Zeitgeber Zeit (ZT) 0-12) Experimente, sammeln Fliegen aus dem Tag Inkubator.
      2. Unmittelbar vor den Verhaltensexperimenten nehmen Sie die gesammelten Fliegenfläschchen aus dem Tagesbrutkasten.
      3. Für nächtliche (ZT 13-24) Experimente, sammeln Fliegen aus dem Nachtbrutzentrum.
      4. Unmittelbar vor den Verhaltensexperimenten die gesammelten Fliegenfläschchen aus dem Nachtbruthaus nehmen, mit Aluminiumfolie umwickeln und in eine Box im dunklen Raum unter einer roten Lampe legen.
         Anmerkung: Da der Temperaturpräferenz-Verhaltenstest bei Dunkelheit für die Nachtexperimente durchgeführt wird, muss die Lichtexposition gegenüber den Fliegen bis zum Ende der Verhaltensexperimente verhindert werden.
         Hinweis: Die Fliegen sollten am Tag der Experimente nicht Kohlendioxid ausgesetzt werden.
2. Experimenten der konstanten Dunkelheit (DD)
   1. DD-Tag
      1. Für DD-Tagesexperimente, die wir als "Übergangs-Inkubator" für den Rest des Manuskripts bezeichnen, ist ein zusätzlicher Inkubator notwendig. Der Übergangsinkubator muss in dem raumgreifenden Raum platziert werden, der im Dunkeln zugänglich ist, so dass Fliegen, die DD-Bedingungen erleben, für die Experimente leicht zugänglich sind. Ein Beispiel lichte Zeitplan für einen Übergangs-Inkubator hätte das Licht einein von 13-19 Uhr und das Licht OFF von 19.00-13.00 Uhr(Abbildung 1).
      2. Sammeln Sie die Fliegen, die im Gründerzentrum des Tages aufgezogen wurden. Legen Sie die Fliegenfläschchen zwischen 13 und 19 Uhr in den Übergangsinkubator, wenn das Licht eingeschaltet ist. Auf diese Weise werden die Fliegen bis 19 Uhr richtig dem Licht ausgesetzt, dann schaltet sich das Licht aus.
      3. Am nächsten Tag, vor 13 Uhr, unter dunklen Bedingungen, nehmen Sie die Fliegenfläschchen aus dem Übergangsbrutkasten, wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie und legen Sie sie in eine Schachtel. Bewahren Sie die Box noch einen Tag in jedem Inkubator auf.
   2. DD Nacht
      1. Sammeln Sie die Fliegen, die im Nachtbruthaus im Dunkeln unter einer roten Lampe angehoben wurden. Oder sammeln Sie zusätzlich die Fliegen, wenn das Nacht-Inkubator-Licht eingeschaltet ist.
      2. Wrap gesammeltFläschchen mit Aluminiumfolie in der Dunkelheit jedes Mal, wenn die Lichter aus sind und legen Sie die Fläschchen in einer Box. Bewahren Sie die Box für zwei weitere Tage in einem Inkubator auf (Abbildung 1B).
         Anmerkung: Da der Temperaturpräferenz-Verhaltenstest bei Dunkelheit für die Nachtexperimente durchgeführt wird, muss die Lichtexposition gegenüber den Fliegen bis zum Ende der Verhaltensexperimente verhindert werden.
3. Experimente mit konstantem Licht (LL)
   1. LL Day
      1. Für LL-Tagesexperimente ist ein zusätzlicher Inkubator erforderlich. Dieser Inkubator behält den LL-Zustand (25 °C, 800 Lux) bei, wobei das Licht kontinuierlich eingeschaltet ist.
      2. Sammeln Sie Fliegen, die im Gründerzentrum des Tages aufgezogen wurden. Legen Sie die Fliegenfläschchen jederzeit während ihres "Tages" in den LL-Inkubator.
   2. LL Night
      1. Sammeln Sie Fliegen, die im Nachtbruthaus angehoben wurden. Übertragen Sie die Fliegenfläschchen vom Nachtbrutschrank zum LL-Inkubator während der Zeit, in der das Licht im Nachtbrutschrank eingeschaltet ist.
         Hinweis: Zum Beispiel schaltet sich das Licht um 7 Uhr im Nacht-Inkubator aus. Übertragen Sie die Fliegenfläschchen vom Nachtbrutschrank vor 7 Uhr morgens in den LL-Inkubator und bewahren Sie die Fläschchen noch 4 Tage im LL-Inkubator auf.
         Anmerkung: An Tag 4 unter LL-Bedingungen wird die Schwingung der Bewegungsaktivität^15,16abgeschafft, während die TPR noch ³aufrechterhalten wird.

2. Das Gerät für den Temperaturpräferenz-Verhaltenstest

1. Legen Sie eine Plexiglasabdeckung (29 cm x 19,2 cm) (Abbildung 4) auf eine Aluminiumplatte.
2. Überwachen Sie die Lufttemperatur zwischen der Platte und der Abdeckung. Sechs Temperatursonden werden an verschiedenen Stellen an der Innenseite der Abdeckung innerhalb einer der Fahrspuren angebracht (Abbildung 2).
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Sonden weder die Aluminiumplatte noch die Plexiglasabdeckung berühren. Die Lufttemperatur sollte auf einen Gradienten von 18-32 °C eingestellt werden.
3. Stellen Sie das Gerät in einen Umgebungsraum, der bei 25 °C/65-75% RH gehalten wird. Dieses Zimmer muss von jeder Außenleuchte abgeriegelt werden. Ein Umgebungsraum ist normalerweise mit Ventilatoren ausgestattet, um eine bestimmte Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu halten.
   Hinweis: Die Luft des Lüfters stört wahrscheinlich einen stabilen Temperaturgradienten am Gerät. Um dies zu verhindern, verwenden wir ein transparentes Blatt, das den Bereich um das Gerät abdeckt.
4. Bereiten Sie ein Thermometer und Hygrometer vor, um die Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Umgebungsraum zu überprüfen.
   Hinweis: Licht beeinflusst die Temperaturpräferenz von Drosophila³. Die gleiche Lichtintensität sollte gleichmäßig auf das Gerät geliefert werden. Die Intensität unserer Umgebungsraumleuchten beträgt 800 Lux.
   Hinweis: Wenn die Verhaltensexperimente durchgeführt werden, legen Sie ein Rohr aus dem_CO2-Tank verbunden oder liefern Sie in der Nähe des Lochs der Oberseite des Geräts, um zu beästhesieren und die Fliegen loszuwerden.

3. Vorbereitung von Geräten für den Einsatz

1. Schalten Sie das Gerät mindestens 30 min ein, um den Temperaturgradienten auf der Plattenoberfläche richtig zu bestimmen (Abbildung 3).
2. Beschichten Sie die Abdeckung des Verhaltensgeräts mit wasserabweisend, um zu verhindern, dass Fliegen auf die Wände oder die Decke der Abdeckung klettern. Wischen Sie das überschüssige Wasser abweisend ab und lassen Sie die Abdeckung für 25-30 min trocknen.
3. Entfernen Sie jegliche Kondensation auf der Aluminiumplatte. Legen Sie die Plexiglasabdeckung auf die Aluminiumplatte und sichern Sie sie mit sechs C-Klemmen (Abbildung 2).
   Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass die Abdeckung gut versiegelt ist, falls erforderlich, Doppelklebeband verwendet werden kann.
4. Lassen Sie die Abdeckung für mindestens 15 min. Der Temperaturgradient zwischen der Aluminiumplatte und der Abdeckung wird von 18-32 °C erzeugt.

4. Temperaturpräferenz Verhalten Assay

1. Laden Sie die Fliegen in den Raum zwischen der Aluminiumplatte und der Plexiglasabdeckung des Geräts durch kleine Löcher in der Mitte jeder Spur der Abdeckung (Abbildungen 2 und 4). Bedecken Sie die Löcher mit Abdeckungsschlüpfern, um zu verhindern, dass die Fliegen entkommen.
2. Für die dunklen Bedingungen, schalten Sie alle Lichter im Umweltraum aus. Eine rote Lampe kann verwendet werden, wenn die Fliegen in das Gerät gelegt werden. Stellen Sie sicher, dass die Fliegen bis zur Verhaltensexperimente keinem Licht außer einer roten Lampe ausgesetzt sind.
3. Verwenden Sie für jede Studie 20-25 erwachsene Fliegen, die in nachfolgenden Versuchen nicht wiederverwendet werden sollen. Der Verhaltenstest wird 30 min lang durchgeführt. Nehmen Sie ein paar Bilder mit oder ohne Blitz. Achten Sie darauf, während der Experimente nicht viel Lärm oder plötzliche Bewegungen zu machen.
4. Zeichnen Sie die Temperatur aller sechs Sonden auf dem Gerät auf. Beachten Sie die Raumtemperatur sowie die Luftfeuchtigkeit.
5. Anästhetisieren Sie die Fliegen im Gerät mit Kohlendioxidgas, lösen Sie die Klammern, entfernen Sie die Plexiglasabdeckung und entfernen Sie die Fliegen von der Platte. Nach jedem Experiment werden die Fliegen verworfen. Wischen Sie jegliche Kondensation oder Feuchtigkeit von der Platte ab. Ersetzen Sie die Abdeckung auf der Platte und ziehen Sie sie mit den Klemmen in Vorbereitung auf das nächste Experiment fest.
6. Um eine Darstellung der Temperaturpräferenz über den ganzen Tag zu haben, wird der 24-Stunden-Zeitraum in acht Zeitzonen aufgeteilt, vier tagsüber und vier in der Nacht. Zum Beispiel verwenden wir diese ZT oder CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 und 22-24.
   Anmerkung: Da Phänotypschwankungen, die durch Maskierungseffekte verursacht werden, unmittelbar nach dem Einschalten des Lichts (ZT0) oder OFF (ZT12) zu erwarten sind, untersuchen wir nicht das Temperaturpräferenzverhalten in diesen Zeiten (ZT oder CT 0-1, 11.5-13 und 23.5-24). In jeder Zeitzone müssen mindestens fünf Versuche durchgeführt werden, damit die Ergebnisse statistisch einwandfrei sind.

5. Datenanalyse

1. Berechnen Sie den Temperaturgradienten wie folgt: Bestimmen Sie, wo die Temperaturfühler platziert werden, basierend auf den beiden Linealen, die auf der oberen und unteren Seite der Plexiglasabdeckung entlang der Kanten platziert werden (Abbildung 2A).
2. Der Temperaturgradient zwischen den Temperatursonden wird als linear geschätzt. Basierend auf den Positionen der Temperaturfühler sowie den entsprechenden aufgezeichneten Temperaturen zeichnen Sie Linien, die jeden Temperaturgrad in der entsprechenden Position auf den Bildern darstellen. Zählen Sie die Anzahl der Fliegen in jedem Gradintervall. Schließen Sie alle Fliegen an den Wänden oder der Decke der Abdeckung aus.
3. Berechnen Sie den Prozentsatz der Fliegen in jedem Temperaturbereich jeder Spur. Eine mittlere bevorzugte Temperatur wird berechnet, indem die Produkte des prozentualen Anteils der Fliegen und der Temperatur jedes Intervalls summiert werden, wie unten gezeigt:
   % der Fliegen x 18,5 °C + % der Fliegen x 19,5 °C + % der Fliegen x 20,5 °C ....+ % der Fliegen x 31,5 °C + % der Fliegen x 32,5 °C.
4. Berechnen Sie die durchschnittliche bevorzugte Temperatur in jeder Zeitzone: Das Temperaturpräferenzverhalten wird >5 Mal während jeder Zeitzone durchgeführt (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 und 22-24). Um die durchschnittliche bevorzugte Temperatur in jeder Zeitzone zu berechnen, wird die mittlere bevorzugte Temperatur jeder Versuchszeit zusammen gemittelt. Die s.e.m.-Fehlerleisten sind gleich dem Fehler zwischen den Versuchen.

Ein Beispiel für den Temperaturpräferenzrhythmus ist in Abbildung 5dargestellt. Wenn das Verhaltensverfahren erfolgreich durchgeführt wird, sollten die Fliegen eine TPR aufweisen, in der sie eine niedrige Temperatur am Morgen und höhere Temperatur am Abend bevorzugen. Der Anstieg der Temperaturpräferenz von 1-1,5 °C während des Tages sollte im Laufe des Tages beobachtet werden, unabhängig vom genetischen Hintergrund, da wir gezeigt haben, dass w1118, yw und Canton S Fliegen eine ähnliche Temperaturpräferenz während des Tages3aufweisen.

Abbildung 1. Ein Schaltplan der Fliegenvorbereitung am DD-Tag. (A) Ein Beispiel für ein DD-Tagesexperiment. Das Licht ist von 13 bis 19 Uhr eingeschaltet und das Licht ist von 19 bis 13 Uhr im Übergangs-Inkubator ausgeschaltet. Sammeln Sie die Fliegen, die im Gründerzentrum des Tages aufgezogen wurden. Legen Sie die Fliegenfläschchen irgendwann zwischen 13 und 19 Uhr in den Übergangsinkubator. Am nächsten Tag vor 13 Uhr die Fliegenfläschchen im Dunkeln aus dem Übergangsbrutkasten nehmen, mit Alufolie einwickeln und in eine Schachtel legen. (B) Ein Beispiel für ein DD-Nachtexperiment. Sammeln Sie die Fliegen, die im Nachtbruthaus aufgezogen wurden, entweder in der Dunkelheit von 7 bis 19 Uhr oder im Licht von 19 bis 7 Uhr. Nehmen Sie die Fliegenfläschchen aus dem Nacht-Inkubator in der Dunkelheit zwischen 7 und 19 Uhr, und wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie und legen Sie sie in eine Box

Abbildung 2. Temperaturpräferenz Verhaltensapparat. (A) Obere Ansicht. Die Plexiglasabdeckung wird mit sechs C-Klemmen auf die Aluminiumplatte gelegt. Sechs Temperatursonden werden an verschiedenen Stellen an der Innenseite der Abdeckung innerhalb einer der Fahrspuren angebracht. Zwei Lineale werden auf der Ober- und Unterseite der Plexiglasabdeckung entlang der Kanten platziert, um den Temperaturgradienten zu bestimmen. (B) Seitenansicht. Vier Peltier-Geräte befinden sich unter einer Aluminiumplatte (44 cm x 22 cm). Jedes Peltier-Gerät ist an die Temperaturregler angeschlossen, die kalte oder heiße Temperaturen erzeugen. Um eine Überhitzung der Peltiers zu verhindern, wird das Computerkühlsystem an Wasserrohre, Luftkühlventilatoren und Netzteile angeschlossen. Temperaturfühler sind in den Rand der Aluminiumplatte eingebettet und mit den Temperaturreglern verbunden, um die Temperaturen auf der Aluminiumplatte direkt zu steuern. Für unser Stromgerät sind die Kalt- und Heißseiten auf 12 °C bzw. 36 °C eingestellt.

Abbildung 3. Ein Diagramm des Geräts. Die Temperaturfühler werden als Rückkopplungssteuerung eingesetzt, um die Temperatur auf der Aluminiumplatte zu lesen. Die Peltier-Geräte sind an die Temperaturregler angeschlossen. Um eine Überhitzung der Peltiers zu verhindern, werden die Flüssigkeitskühler direkt unter den Peltiers platziert. Die vier Flüssigkeitskühler sind durch Wasserrohre verbunden, die mit der Pumpe und dem Heizkörper verbunden sind. Der Heizkörper hat zwei Ventilatoren, die die Temperatur des Wassers abkühlen. Pumpe und Heizkörper sind an das Netzteil angeschlossen.

Abbildung 4. Der Plan der Plexiglasabdeckung. Dies ist der Plan für die Abdeckung, die aus Plexiglas besteht. Die Abdeckung hat vier Bahnen geteilt durch drei 0,2 cm dicke Trennwände, und ein Loch von 0,7 cm Durchmesser befindet sich in der Mitte der oberen Platte auf jeder Spur (Abbildung 2A).

Abbildung 5. Ein Beispiel für die TPR-Verhaltensdaten. TPR von w1118 fliegt über 24 Std. Bevorzugte Temperaturen wurden anhand der Fliegenverteilung in den Temperaturpräferenzverhaltensexperimenten berechnet. Die Daten werden als mittlere bevorzugte Temperatur in jeder Zeitzone angezeigt. Zahlen stellen die Anzahl der Assays dar. ANOVA, P < 0,0001. Tukey-Kramer-Test im Vergleich zu ZT1-3, ***P < 0,001, **P < 0,01 oder *P < 0,05. Diese Figur des TPR-Phänotyps ist von Kaneko et al. 3 mit Genehmigung.

Es gibt nichts zu verraten.