Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Temperaturpräferenz von Drosophila zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zuerst die Fliegen und die Apparatur vorbereitet werden, die um eine temperaturkontrollierte Aluminiumbasis herum montiert ist. Sobald die Temperaturen im Gerät eingestellt sind, wird eine Kohorte von Fliegen geladen und nach einer halben Stunde wird ihre Temperaturpräferenz bewertet.

Letztendlich kann der Assay unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen eingesetzt werden. Zum Beispiel zirkadiane Rhythmen der Temperaturpräferenz. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Zielrhythmen zu beantworten.

Da dieser Zielrhythmus der Temperaturpräferenz durch andere Mechanismen gesteuert wird als der der Lokomotivaktivität, wird dieser Verhaltensassay zur Identifizierung neuer molekularer und zellulärer Mechanismen führen, die bisher mit Lokomotivaktivitätsansätzen nicht identifiziert wurden. Diese Methode kann auch dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der sensorischen Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. Temperatur und Schmerzempfinden. Da dieser Temperaturverhaltensassay sehr robust ist, wird er es uns ermöglichen, den neuronalen Schaltkreis von der Temperaturerfassung bis zur Verarbeitung abzubilden, was uns einen besseren Einblick in die sensorische Integration ermöglicht.

Ziehen Sie die Fliegen in befeuchteten Brutschränken mit einem 1212 Hell-Dunkel-Zyklus auf. Dieses Protokoll erfordert zwei solcher Inkubatoren, die auf entgegengesetzte Zeitpläne eingestellt sind. Der Nachtbrutkasten sollte während der normalen Arbeitszeit dunkel sein.

Wenn Sie während des Nachtzyklus auf einen Inkubator zugreifen, verwenden Sie rotes Licht, um den Inkubator zu beleuchten. Sammeln Sie Kohorten von 20 bis 30 frisch geschlüpften Fliegen beiderlei Geschlechts und halten Sie sie in einem beliebigen Verhältnis zwei bis drei Tage lang in ihrem Inkubator, bevor Sie sie in den Assay laufen lassen. Für jede getestete Erkrankung sind mindestens fünf Kohorten erforderlich.

Um eine Prüfkammer für die Temperaturpräferenz zu bauen, muss eine Plexiglasabdeckung so konstruiert werden, dass sie auf eine Aluminiumplatte unter der Platte passt. Platzieren Sie vier Peltier-Geräte. Jedes der Peltier-Geräte sollte an die Temperaturregler angeschlossen werden, die kalte oder heiße Temperaturen erzeugen können, um eine Überhitzung der Pelter zu verhindern.

Ein Computerkühlsystem ist mit Wasserschläuchen, Luftkühlern und Netzteilen verbunden, um die Temperaturen auf der Aluminiumplatte zu überwachen. Temperaturfühler sind in den Rand der Aluminiumplatte eingelassen und werden mit Temperaturreglern verbunden. Stellen Sie die kalte und die heiße Seite der Platte in der Abdeckung auf 12 bzw. 36 Grad Celsius ein.

Bringen Sie sechs Temperaturfühler an verschiedenen Positionen innerhalb einer der Bahnen an. Stellen Sie das Gerät in einem klimatisierten Raum bei 25 Grad Celsius und einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 65 und 75 % auf. Achten Sie darauf, diese Bedingungen zu überwachen.

Der Raum muss über eine Lichtsteuerung und eine gute Luftzirkulation verfügen, um zu verhindern, dass zirkulierende Luft die Temperatur destabilisiert. Gradientenschutz des Prüfbereichs mit einem Duschvorhang. Auf dem Gerät muss gleichmäßiges Licht verwendet werden, da die Leuchtkraft die Temperaturpräferenz beeinflussen kann.

Schalten Sie das Gerät mindestens 30 Minuten lang ein. Um einen stabilen Temperaturgradienten auf der Oberfläche der Platte zu etablieren. Beschichten Sie die Abdeckung des Verhaltensgeräts mit einem wasserabweisenden Mittel, um zu verhindern, dass die Fliegen die Wände oder die Decke der Abdeckung erklimmen.

Wischen Sie das überschüssige wasserabweisende Mittel ab und lassen Sie die Abdeckung bei Bedarf 25 bis 30 Minuten fahren, eine halbe Stunde später kann Doppelklebeband verwendet werden. Wischen Sie jegliches Kondenswasser von der Aluminiumplatte ab. Setze dann die Plexiglasabdeckung auf die Aluminiumplatte und befestige sie mit sechs C-Klemmen.

Es ist sehr wichtig, dass die Abdeckung versiegelt ist. Überwachen Sie die Lufttemperatur zwischen der Platte und der Abdeckung gut. Stellen Sie sicher, dass die Sonden weder die Aluminiumplatte noch die Plexiglasabdeckung berühren.

Lassen Sie den Deckel mindestens 15 Minuten lang auf dem Teller ausbalancieren. Schließlich wird der Lufttemperaturgradient zwischen der Aluminiumplatte und dem Deckel zwischen 18 und 32 Grad Celsius liegen. Im Falle eines Tagesverhaltensexperiments nehmen Sie die Fliegenfläschchen aus dem Tagesinkubator und testen Sie den Verhaltenstest im Licht unmittelbar vor einem Nachtverhaltensexperiment. Nehmen Sie die Fliegenfläschchen aus dem Nachtbrutschrank.

Wickeln Sie sie in Folie ein und legen Sie sie in eine Schachtel in der Dunkelkammer unter eine rote Lampe. Bei Experimenten während der Dunkelheit muss das Raumlicht immer ausgeschaltet bleiben, bis die Verhaltensexperimente abgeschlossen sind. Für die Beleuchtung mittels Aspiration können jedoch rote Lampen verwendet werden.

Laden Sie 20 bis 25 Fliegen in den Raum zwischen der Aluminiumplatte. Decken Sie dann die Löcher mit Deckgläsern ab, um ein Entweichen der Fliegen zu verhindern. Lassen Sie die Fliegen 30 Minuten lang umherwandern.

Wenn das Experiment abgeschlossen ist, machen Sie mindestens zwei Fotos für die Lichtexperimente. Für die Dunkelexperimente muss ein Blitz verwendet werden. Überprüfen Sie die Temperatur des Geräts.

Achten Sie auf die Raumtemperatur sowie die Luftfeuchtigkeit, um die Fliegen zu entfernen. Verbundenes Kohlendioxidrohr in der Nähe des Lochs oben auf dem Gerät, um die Fliegen zu betäuben, entsorgen Sie die Fliegen. Sie sollten nicht erneut getestet werden. Wischen Sie anschließend Kondenswasser oder Feuchtigkeit von der Platte.

Setzen Sie die Abdeckung wieder auf die Platte und ziehen Sie sie zur Vorbereitung mit den Klemmen fest. Berechnen Sie für das nächste Experiment den Temperaturgradienten wie folgt. Bestimmen Sie zunächst mit einem Lineal anhand der Sondenpositionen und der aufgezeichneten Temperaturen, wo die Temperaturfühler platziert sind. Zeichnen Sie gerade Linien, die jedes Grad Temperatur an der entsprechenden Position auf dem Foto der Endposition der Fliege darstellen.

Zählen Sie als Nächstes die Anzahl der Fliegen zwischen jedem Intervall von einem Grad Celsius. Schließen Sie Fliegen an den Wänden oder an der Decke der Abdeckung aus. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der Fliegen in jedem Temperaturbereich jeder Bahn und dann die mittlere bevorzugte Temperatur für jede Bedingung.

Sammeln Sie Daten aus mindestens fünf Studien. Verwenden Sie dann die Mittelwerte jedes Versuchs, um die durchschnittliche Vorzugstemperatur mit Fehlern zu bestimmen. Normale Fliegen, die bei 25 Grad Celsius aufgezogen werden, bevorzugen eine niedrigere Temperatur am Morgen als am Abend.

Tagsüber wurde ein Anstieg der Temperaturpräferenz um ein bis 1,5 Grad Celsius und ein Anstieg um 1,5 bis zwei Grad Celsius gemessen. Eine Abnahme war beim Übergang vom Tag zur Nacht zu beobachten. Der Assay kann auch zum Testen von mutierten Fliegen verwendet werden.

So wurde beispielsweise festgestellt, dass die Temperaturpräferenz von Fliegen, die eine defekte Mutation in der Reise, einem Ein-Ionen-Kanal, aufweisen, höher ist als die von Kontrollen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Assay für das Temperaturpräferenzverhalten durchführen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen und Neuroschaltkreise, von Ofa und Uhren und wie das Gehirn die verschiedenen Umweltreize und die biologischen Uhren integriert.