Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zusammenfassung

Die zytolytische Aktivität von CD8+ T-Zellen wird selten untersucht. Wir beschreiben hier einen neuen zellbasierten Assay zur Messung der Fähigkeit von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen abzutöten, die mit ihrem verwandten Peptid beladen sind. Die Ziel-CD4+ T-Zellen werden in zwei Populationen unterteilt, die mit zwei unterschiedlichen CFSE-Konzentrationen markiert sind. Eine Population wird mit dem interessierenden Peptid gepulst (CFSE-niedrig), während die andere nicht gepulst wird (CFSE-hoch). Gepulste und ungepulste CD4+ T-Zellen werden im gleichen Verhältnis gemischt und mit einer zunehmenden Anzahl von gereinigten CD8+ T-Zellen inkubiert. Die spezifische Abtötung von autologen CD4+ T-Zellen wird mittels Durchflusszytometrie nach Kokultur mit CD8+ T-Zellen analysiert, die den antigenspezifischen Effektor CD8+ T-Zellen enthalten, der durch Peptid/MHCI-Tetramer-Färbung nachgewiesen wurde. Die spezifische Lyse von CD4+ T-Zielzellen, gemessen bei unterschiedlichen Effektor- und Zielverhältnissen, ermöglicht die Berechnung von lytischen Einheiten, LU₃₀/10⁶ Zellen. Dieser einfache und unkomplizierte Assay ermöglicht die genaue Messung der intrinsischen Kapazität von CD8+ T-Zellen zur Abtötung von CD4+ T-Zielzellen.

Einleitung

Die zytolytische Aktivität ist die Hauptfunktion von CD8+ T-Zellen, wird aber immer noch selten gemessen, da die zu diesem Zweck verwendeten Assays umständlich sind und schwer zu standardisieren sind. Die genaue Messung dieser Funktion ist bei der Charakterisierung der Effektorfunktionen von CD8+ T-Zellen von größter Bedeutung, da bisher keine zuverlässigen Prädiktoren für eine wirksame zellvermittelte Zytotoxizität beschrieben wurden^1,2. In dieser Arbeit schlagen wir einen neuen funktionellen Assay vor, um die zytotoxische Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen auf CD4+ T-Zielzellen zu messen. Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um Alternativen zum Goldstandard, dem Chrom-Release-Assay, anzubieten. Wir stellen hier einen zellbasierten Assay vor, der den gesamten Prozess der Tötung aufzeigt, während er den Tod lebender Zielzellen misst. Diese Methode wurde aus Protokollen von durchflusszytometrischen zytotoxischen Assays in vivo bei Mäusen^4,5 und in vitro beim Menschen^{abgeleitet 6}. In diesem Protokoll werden die antigenspezifischen CD8+ T-Zellen, die in der gesamten CD8+ T-Zellpopulation enthalten sind, als Effektorzellen und autologe CD4+ T-Zellen als Zielzellen verwendet. Die interessierenden Effektor-CD8+-T-Zellen werden unter Verwendung von MHCI/Peptid-Tetrameren⁷ gezählt. Der Tod der Zielzellen wird durch das Verhältnis zwischen peptidbeladenen und ungeladenen CD4+ T-Zellen berechnet. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Methode reproduzierbar, sensitiv und spezifisch ist und nicht von der Anzahl der Effektorzellen innerhalb der gesamten CD8+ T-Zellpopulation abhängt⁸. Durch Aufzählung sowohl der Anzahl der Effektor- als auch der Zielzellen im Kokultur-Assay kann die intrinsische Kapazität von CD8+ T-Zellen zur Abtötung von Zielzellen berechnet und in lytischen Einheiten^{ausgedrückt werden 9}.

Protokoll

1. Präparation von Effektor-CD8+ T-Zellen

1. Tauen Sie autologe kryokonservierte PBMC (2-3 Fläschchen à 50 x 10⁶ Zellen) auf, indem Sie das Kryofläschchen von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C warmes Wasserbad überführen.
2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen auf 50 ml mit vollständigem RPMI füllen (4 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 10% FBS). Zählen Sie PBMCs und resuspendieren Sie Zellen in einer Konzentration von 5 x 10⁶/ml in vollständigem RPMI.
3. Geben Sie spezifisches Peptid (5 μg/ml) und IL-2 (10 ng/ml) zu PBMCs.
4. Aufbau der Kultur in einer 96-Deep-Well-Platte; 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung aussäen.
5. Ersetzen Sie nach 3 Tagen Kultur die Hälfte des Zellkulturmediums durch frisches, vollständiges RPMI.
6. Nach 6-tägiger Kultivierung werden alle PBMCs mit einer Mehrkanalpipette gesammelt und die Zellen in ein steriles Reservoir übertragen.
7. Zählung, Waschen und Resuspendieren von PBMCs mit 5 x 10⁷/ml im empfohlenen Trennpuffer in 14 ml Röhrchen mit rundem Boden. Geben Sie einen humanen CD8+ T-Zell-Anreicherungscocktail mit 50 μl/ml Zellen hinzu. Mischen und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren. Magnetische Partikel mit 150 μl/ml zugeben und 5 min inkubieren.
8. Bringen Sie die Zellsuspension auf bis zu 7 ml, indem Sie den Trennpuffer hinzufügen. Fahren Sie mit der immunomagnetischen Isolierung der unberührten CD8+ T-Zelle fort, indem Sie das Röhrchen in den Magneten einsetzen. Gießen Sie nach 5 Minuten, während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, die gewünschten Zellen in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Nehmen Sie ein kleines Aliquot und färben Sie die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD8 in 1X PBS-2% FBS für 30 min bei 4 °C. Die Reinheit der CD8+ T-Zellen kann dann mittels Durchflusszytometrie mit einer erwarteten Reinheit von 95% oder höher gemessen werden.
9. Resuspendieren Sie CD8+ T-Zellen in 450 μl mit vollständigem RPMI.
10. Geben Sie 225 μl des kompletten RPMI in 5 Schraubverschlussröhrchen.
11. Bereiten Sie serielle Verdünnungen (von 1:2 bis 1:32) vor, indem Sie 225 μl CD8+ in das nächste Röhrchen überführen (siehe Abbildung 1 oben).

2. Präparation von CD4+ T-Zielzellen

1. Tauen Sie autologe kryokonservierte PBMC (1 Fläschchen mit 50 x 10⁶ Zellen) auf, indem Sie das Kryofläschchen von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C heißes Wasserbad überführen.
2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 10 ml RPMI.
3. Waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie PBMCs bei 5 x 10⁷/ml mit Trennpuffer in 14 ml Rundbodenröhrchen. Geben Sie einen humanen CD4+ T-Zell-Anreicherungscocktail mit 50 μl/ml Zellen hinzu. Mischen und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren. Magnetische Partikel mit 100 μl/ml zugeben und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Bringen Sie die Zellsuspension auf bis zu 7 ml, indem Sie Trennpuffer hinzufügen. Fahren Sie mit der Isolierung von CD4+ T-Zellen fort, indem Sie das Röhrchen in den Magneten einsetzen. Gießen Sie nach 5 Minuten, während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, die gewünschten Zellen in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Nehmen Sie ein kleines Aliquot und färben Sie die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD4 in 1x PBS-2% FBS für 30 min bei 4 °C. Die Reinheit der CD4+ T-Zellen kann dann mittels Durchflusszytometrie mit einer erwarteten Reinheit von 95% oder höher gemessen werden.
5. CD4+ T-Zellen zählen, in zwei konische 15-ml-Röhrchen aufteilen und in warmem 1x PBS waschen.
6. Bereiten Sie eine 0,4 μM CFSE-hohe Arbeitslösung in warmem PBS vor.
7. Bereiten Sie eine 0,04 μM CFSE-Arbeitslösung mit niedriger Arbeitsleistung vor, indem Sie einen Teil der 10-fachen CFSE-Arbeitslösung in warmem PBS verdünnen.
8. Resuspendieren Sie Zellen bei 20 x 10⁶/ml PBS (wenn die Anzahl der CD4+ T-Zellen weniger als 10 x 10⁶/ml beträgt, resuspendieren Sie Zellen in 0,5 ml PBS) und färben Sie die Hälfte der CD4+ T-Zellen durch Zugabe eines gleichen Volumens 0,4 μM CFSE-Arbeitslösung (Endkonzentration 0,2 μM). Fügen Sie beispielsweise für 1 ml Zellen 1 ml der CFSE-Arbeitslösung hinzu. Die verbleibende Hälfte des CD4+ wird durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0,04 μM CFSE-Arbeitslösung (Endkonzentration 0,02 μM) gebeizt. Zellen 15 min bei 37 °C in 5 % CO₂ -Atmosphäre färben.
9. Nach der Inkubation werden die Pelletzellen 5 Minuten lang bei 1.500 U/min gedreht und in 1 ml warmem vollständigem RPMI resuspendiert, um die Markierungsreaktion zu löschen.
10. Pulsieren Sie CFSE-niedrige CD4+ T-Zellen durch Zugabe des interessierenden Peptids in einer Endkonzentration von 5 μg/ml im vollständigen RPMI und inkubieren Sie 45 Minuten lang in 5% CO₂ -Atmosphäre bei 37 °C.
11. Waschen Sie CFSE-hohe und CFSE-niedrige CD4+ T-Zellen in vollem RPMI. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendieren Sie in einer Konzentration von je 2 x 10⁵ Zellen/ml in vollständiger RPMI.
12. Mischen Sie die beiden Zielpopulationen im Verhältnis 1:1 (CFSE-Hoch:CFSE-Niedrig) (siehe Abbildung 1 unteres Bild).

3. Kokultur

1. Aus jeder Verdünnung von CD8+ T-Zellen werden 100 μl in doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden ausgedünnt.
2. Fügen Sie die gemischten CD4+ T-Zielzellen (100 μl) zu jeder Verdünnung der Effektorzellen hinzu, um ein Endvolumen von 200 μl zu erhalten.
3. Um die basale Apoptose zu messen, säen Sie 3 Vertiefungen nur mit Zielzellen.
4. Inkubieren Sie die Kokultur für 6 Stunden in 5 % CO₂ -Atmosphäre bei 37 °C.

4. Färbung und Erfassung in der Durchflusszytometrie

1. Die Zellen werden auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden umgefüllt und 15 Minuten lang in 5 % CO₂ -Atmosphäre bei 37 °C mit PE-konjugierten pMHC-Tetrameren gefärbt
.
2. 1x PBS-2% FBS einwaschen und die Zellen mit Far Red LIVE/DEAD fixierbaren toten Zellen, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 für 30 min bei 4 °C einfärben, lichtgeschützt.
3. Zellen einmal mit 1x PBS-2% FBS waschen und in 100 μl mit 2% Formaldehyd in 1x PBS resuspendieren.
4. Erfassen Sie Zellen mit einem Durchflusszytometer.

Ergebnisse

Das Schema in Abbildung 1 fasst den Assay zusammen. Reine CD8+ T-Zellen (Effektorzellen) wurden in 450 µl vollständigem RPMI resuspendiert, und serielle Verdünnungen wurden durchgeführt, indem 225 µl der CD8+ T-Zellen in das nächste Reagenzglas gegeben wurden, das 225 µl Medium enthielt (oberes Panel). Reine CD4+ T-Zellen (Zielzellen) wurden gezählt, in zwei Röhrchen aufgeteilt und mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen von CFSE (hoch und niedrig) gemäß der Anleitung gefärbt. CFSE-niedrige CD4+ T-Zel...

Diskussion

Der hier beschriebene Assay ermöglicht die Quantifizierung der Hauptfunktion von CD8+ T-Zellen: der zytolytischen Aktivität. Die genaue Messung dieser Funktion ist bei der Charakterisierung der Effektorfunktionen von CD8+ T-Zellen von größter Bedeutung, da frühere Studien über eine Diskordanz zwischen dieser Funktion und der Zytokinsekretion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen berichteten^10,11. Aufgrund der kurzen Inkubationszeit in der Kokultur (6 Stunden) und der Verwendung autologer Zielzellen ist die Rat...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
EasySep Humanes CD4+ T-Zell-Anreicherungskit	Stammzelle	19052
EasySep Humanes CD8+ T-Zell-Anreicherungskit	Stammzelle	19053
CellTrace CFSE Zellproliferationskit - Für Durchflusszytometrie	Invitrogen	C34554
Far Red LIVE/DEAD fixierbare tote Zellen	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Maus Anti-Human CD3	BD
Brilliant Violet 650 Anti-Human-CD4-Antikörper	Biolegend	317435
PerCP Anti-Human-CD8-Antikörper	Biolegend 344707
RPMI 1640 Medium 1x	VWR	10-040-CV
Penicillin-Streptomycin 100x Lösung	Invitrogen	15070063
Fötales Rinderserum - Gold, hitzeinaktiviertes	PAA	A15-252
96-Well-Platten; Behandelt; U-Boden; mit	Deckel BD Falcon	353077
25 ml steriles Polystyrol, einzeln verpackte Reservoire	USA Scientific	2321-2230
96-Well-U-Boden, sterile 2 ml Deep-Well-Platten	Thermo Scientific	275743
Human IL-2 (v126), Forschungsqualität	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Puffer, Trennpuffer	Stammzelle	20104
15 ml konisches Polypropylen-Röhrchen	BD Falcon	352097
14 ml Rundbodenröhrchen, Polypropylen	BD Falcon	352059
The Big Easy EasySep Magnet	Stammzelle	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96-Well; V-Bodenplatte mit Deckel	Fisher	12-565-481
Formaldehydlösung, ACS-Reagenz, 37 Gew.-% in H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1,5 ml Mikroröhrchen mit Schraubverschluss, konisch	Sarstedt	72.692.005