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1. Imaging Cell Membrane Repair Mit Schütt (Glasperlenspiel) Verwundung
Dieses Protokoll erlaubt separat Kennzeichnung der verletzten Zellen und solche, die nicht heilen. Die Quantifizierung dieser Populationen von Zellen erfordert die Verwendung von drei Bedingungen: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca 2 +, 2 zu reparieren. Kontrolle 1 (keine Schädigung C2) - Die Zellen werden in Gegenwart von Ca 2 + 3 inkubiert, aber nicht verletzt, und. Control 2 (keine Reparatur C3) - Zellen werden in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren.
- Zellen wachsen auf> 50% Konfluenz auf drei sterile Deckgläser und waschen C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und Transferdeck auf Silikon-O-Ringe.
- 100 l vorgewärmten FITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf.
- Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3 von sanften 40 mg Glasperlen über das Deckglas bei Raumtemperatur durch manuelles Kippen zurück und Deckgläser6-8 mal her in einem Winkel von 30 °.
Hinweis: Für leichte Verletzungen, sicherzustellen, dass die Glasperlen sind gleichmäßig verteilt, so wiederholen Verletzungen zu minimieren. Um die Reproduzierbarkeit der Verletzung zwischen den Proben zu verbessern, gleichzeitig nehmen die Glasperlen Verletzungen der verschiedenen Proben verglichen werden. - Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO 2 und damit die Reparatur für 5 min gehen.
- Ohne dass die Kugeln rollen, entfernen Sie die Glasperlen und FITC-Dextran durch Waschen mit CIM (C1 und C2) oder PBS (C3) bei 37 ° C
- Platz Deckgläser wieder auf den O-Ring und 100 l vorgewärmten Lysin fixierbar TRITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf.
- Inkubieren bei 37 ° C für 5 min bei Umgebungs CO 2.
- Zweimal waschen Deckgläser mit vorgewärmten CIM setzen und mit 4% PFA für 10 min bei RT.
- Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst-Farbstoff.
- Wash samples zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien-und Bildzellen mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop.
- Verwenden C2-Zellen aus, um den Hintergrund rote und grüne Farbintensität bestimmen und diesen Wert auf Schwellen die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3).
- Ergebnis Gesamtzahl der Zellen, die sind a) Grün (verletzt und repariert) und b) rot oder beide rot und grün (verletzt, aber nicht zu reparieren) in C1 und C3 Proben.
- Zahl> 100 Greens Zellen für jede Bedingung und drücken die Fraktion von Zellen, die als Prozent der Zellen verletzt (grün und rot) zu reparieren fehlgeschlagen.
2. Live-Imaging der Kinetik der Zellmembran Reparatur Nach Laser-Verletzung
- Waschen der Zellen mit vorgewärmtem CIM und dann das Deckglas in CIM mit FM-Farbstoff.
- Legen Sie das Deckglas in einer Halterung in der Phase Top Inkubator bei 37 ° C gehalten
- Wähle einen 1-2 mm 2 Bereich der Zellmembran, und bestrahlen <, 10 ms mit dem gepulsten Laser. Dämpfen die Laserleistung durch die Software, um 40-50% der Spitzenleistung. Optimale Leistung ermöglicht die konsistente, aber nicht tödliche Verletzungen und dies muss durch Versuch und Irrtum für jedes einzelne Instrument und Zelllinie verwendet bestimmt werden.
- Um Reparatur-, Bild-in Epi-Fluoreszenz-und Hell überwachen alle 10 sec, beginnend vor Verletzungen und weiterhin für 3-5 min nach der Verletzung.
Hinweis: Für keine Reparatursteuer, wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4 mit die Zellen verletzt in PBS mit FM-Farbstoff. - Um die Kinetik der Reparatur zu quantifizieren, messen zellulären Fluoreszenz-Farbstoff FM und zeichnen Sie die Änderung in der Intensität (ΔF/F0) im Verlauf der Bildgebung. Diese Daten sollten über 10 Zellen in jeder Bedingung gemittelt und aufgetragen als gemittelte Wert oder einzelne Zelle, wie gebraucht.
3. Bulk-Imaging (Glasperlenspiel) Verletzung Induced Lysosomal Exocytosis
Die Proben sind folgende Zellen> 50% gewachsenZusammenfluss: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca 2 +, 2 zu reparieren. Control 1 (C2; Keine Verletzung) - Cells weder verletzt noch mit primärem Antikörper inkubiert und drei. Control 2 (C3; keine Reparatur) - Cells erlaubt, in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren.
- Waschdeckgläser C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und übertragen sie auf Silikon-O-Ringe.
- 100 ul vorgewärmtes Lysin fixierbar TRITC-Dextran in CIM auf C1 und C2 und C3 in PBS auf.
- Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3, wie in Schritt 1.3.
- Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO 2 und damit die Reparatur für 5 min gehen.
- Entfernen Sie die Glasperlen und TRITC-Dextran durch Waschen der Deckgläser in kaltem Wachstumsmedium, wodurch ebenfalls keine Rollen der Glasperlen auf den Zellen.
- Zweimal mit kaltem Wachstumsmedium Spülen Sie die Deckgläser und Transfer zu den O-Ringen.
- C1 und C3, 100 l Ratte anti-Maus-Antikörper, der in kalten LAMP1 komplette Wachstumsmedien und die kalte, komplett Wachstumsmedien bis C2.
- Antikörperbindung zu ermöglichen, Inkubieren Deckgläser für 30 min bei 4 ° C.
- Dreimal Waschen Sie die Deckgläser mit kaltem CIM und reparieren alle Deckgläser mit 4% PFA für 10 min bei RT und dann spülen 3x mit CIM.
- Alle Deck inkubieren in 100 ul Blockierungslösung für 15 min bei RT
- Alle Deck inkubieren in 100 &mgr; l Alexa Fluor 488 anti-Ratten-Antikörper für 15 min bei 4 ° C.
- Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien und Bild mit Epifluoreszenzmikroskop.
- Mit Bildern von C2-Zellen, bestimmen die unspezifische Hintergrundfärbung in rot (TRITC-Dextran) und Grün (Alexa Fluor 488-Antikörper)-Kanäle und nutzen diese Hintergrundfärbung Werte Schwelle die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3).
- Verwenden Sie die> 100 rot markierten Zellen von C1 und C3, die Intensität der Färbung LAMP1 (grün) in verletzten Zellen zu messen. Für eine erfolgreiche Experiment der LAMP1 Färbung in Zellen von C3 deutlich niedriger als in den Zellen von C1 sein.
4. Live-Imaging von Cell Membrane Verletzung ausgelöst Subcellular Handel
- Fluoreszenz beschriften die Raum von Interesse durch Transfektion geeigneter Reporter (zB CD63-GFP für Lysosomen 8) oder mit Fluoreszenzfarbstoffen 9.
- Für die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff Lysosomen, Inkubation Zellen zu 50% Konfluenz in Wachstumsmedium, das FITC-Dextran gewachsen
- Ermöglichen Dextran für 2 Stunden endocytosiert im CO 2-Inkubator (oder mehr als ausreichend endosomalen Markierung mit Dextran von der Zellinie von Interesse erforderlich) werden.
- Waschen der Zellen mit vorgewärmtem Wachstumsmedium und Inkubieren darin für 2 Stunden in einem CO 2-Inkubator, damit alleendozytosiert Dextran in den Lysosomen ansammeln.
- Vor Bildgebung, spülen Sie die Deckglas in vorgewärmten CIM und montieren in einem Deckglas Halter auf der Bühne oben Brutschrank bei 37 ° C
- Führen Sie Weitfeld (für die Bewegung in der gesamten Zelle) oder TIRF (Bewegung an der Zelloberfläche und Exozytose) Bildgebung - Zellen, die FITC-Dextran nicht überfüllt sind markiert Lysosomen sind ideal für die Abbildung der Bewegung und Exozytose einzelner Lysosomen.
- Ausrichten der TIRF Laser für die Bild Mikroskop: Verwenden 60X oder 100X-Objektiv mit> 1,45 NA. Stellen Sie den Winkel für die einfallenden Laserstrahl mit TIRF des Herstellers Ansatz.
- Verletzen die Zellmembran durch Bestrahlen einer kleinen (1-2 mm 2) Region <100 ms, mit dem gepulsten Laser bei 40-50% Dämpfung.
- Um die Reaktion zu überwachen, um Verletzungen Lysosom, Bildzellen für mindestens 2 min lang bei 4-6 Zell Bilder / sec abhängig von der Dynamik der Exozytose in den Zellen von Interesse.