Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen

Zusammenfassung

Intravitalmikroskopie kann bei Tieren verwendet werden, um retinale Gefäßdurchmesser, Blutbahngeschwindigkeiten und den gesamten retinalen Blutfluss sichtbar zu machen und zu messen.

Zusammenfassung

Veränderungen des Blutflusses der Netzhaut können zu Augenerkrankungen und Sehstörungen beitragen oder eine Folge davon sein. Daher kann die Quantifizierung der veränderten Perfusion die Erforschung der Mechanismen von Netzhauterkrankungen unterstützen. Die Intravital-Videomikroskopie von fluoreszierenden Tracern kann zur Messung von Gefäßdurchmessern und Blutstromgeschwindigkeiten des retinalen Gefäßsystems verwendet werden, insbesondere der Arteriolen, die von der zentralen Netzhautarterie abzweigen, und der Venolen, die in die zentrale Netzhautvene führen. Die Blutflussraten können aus den Durchmessern und Geschwindigkeiten berechnet werden, wobei die Summe des arteriolären Flusses und des separat venulären Flusses berechnet wird, wodurch Werte für den gesamten retinalen Blutfluss geliefert werden. Dieser Artikel und das zugehörige Video beschreiben die Methoden zur Anwendung dieser Technik an Mäusen, die 1) die Vorbereitung des Auges für die intravitale Mikroskopie des anästhesierten Tieres, 2) die intravenöse Infusion von fluoreszierenden Mikrosphären zur Messung der Blutbahngeschwindigkeit, 3) die intravenöse Infusion eines fluoreszierenden Dextrans mit hohem Molekulargewicht zur Unterstützung der mikroskopischen Visualisierung des retinalen Mikrogefäßsystems, 4) die Verwendung einer digitalen Mikroskopkamera, um Videos der perfundierten Netzhaut zu erhalten, und 5) die Verwendung von Bildverarbeitungssoftware zur Analyse des Videos. Die gleichen Techniken können zur Messung der retinalen Blutflussraten bei Ratten verwendet werden.

Einleitung

Die Netzhaut ist eines der stoffwechselaktivsten Gewebe im Körper und benötigt daher eine großzügige Blutversorgung. Zwei getrennte Zirkulationen erfüllen diesen Anspruch: die Aderhautzirkulation für den äußeren Teil der Netzhaut und die Netzhautzirkulation für den inneren Teil der Netzhaut. Untersuchungen der retinalen Perfusion sind unerlässlich, um die pathologischen Mechanismen und Folgen der diabetischen Retinopathie, der sauerstoffinduzierten Retinopathie, des retinalen Arterien- oder Venenverschlusses und des Schlaganfalls zu verstehen. Zur Quantifizierung des retinalen Blutflusses wurden mehrere Methoden eingesetzt, wobei jede Technik ihre Vor- und Nachteile, Einschränkungen und Annahmen hat. Zu diesen Techniken gehören die Infusion von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 7-8 μm, die sich in präkapillären Arteriolen einnisten^1,2, die quantitative Autoradiographie^3,4, die optische Mikroangiopathie-optische Kohärenztomographie^5,6, die Magnetresonanztomographie^7,8 und die intravitale Videomikroskopie^9-16. Zu den Vorteilen des letzteren gehören die direkte Live-Visualisierung von Netzhautgefäßen und -strömungen, die Abhängigkeit von nur wenigen geringfügigen Annahmen und die Erschwinglichkeit für Labore, die über ein Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Videokamera verfügen. In früheren Studien der Intravital-Videomikroskopie^9-16 wurde fluoreszierendes Dextran als Plasmamarker verwendet, und fluoreszenzmarkierte rote Blutkörperchen (von einem Spendertier) wurden als Geschwindigkeitsmarker verwendet. Im aktuellen Protokoll werden fluoreszenzmarkierte Mikrosphären mit einem Durchmesser von 1,9 μm anstelle von roten Blutkörperchen zur Messung der Geschwindigkeit verwendet, wobei diese Änderung die Notwendigkeit eines Blutzellspenders zunichte macht.

Protokoll

Die Verfahren, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der LSUHSC-S überprüft und genehmigt und gemäß den von den National Institutes of Health festgelegten Kriterien durchgeführt.

1. Herstellung von Perfusionslösungen

1. Beschallung einer 1 %igen Stammlösung von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 1,9 μm.
2. Entnehmen Sie ~25-30 x 10⁶ grün fluoreszierende Mikrokügelchen (d. h. ~10 μl der Stammlösung) in eine 300 μl Spritze. Verdünnen Sie die Mikrosphären, indem Sie weitere 240 μl Kochsalzlösung in die Spritze aufziehen.
3. Bereiten Sie eine 50-μl-Lösung von 2 x 10 6 Molekulargewicht fluoreszierendem Dextran vor, das in steriler Kochsalzlösung gelöst ist, mit einer injizierten Dosis im Bereich von 3-10 mg/kg. Bewahren Sie das Dextran bis zur Infusion in Alufolie bedeckt auf.

2. Tieranästhesie und Gefäßkanülierung

1. Betäuben Sie das Tier für das chirurgische Einführen von Gefäßkanülen und für die stationäre Positionierung unter einem Mikroskopobjektiv. Es gibt eine große Auswahl an Anästhesieprotokollen mit verschiedenen Vor- und Nachteilen und potenziellen Auswirkungen auf systemische Parameter. Zu den vielen verschiedenen Optionen gehören eine Kombination aus Ketamin (100-150 mg/kg), Xylazin (10 mg/kg) und Acepromazin (2 mg/kg) oder eine Kombination aus Ketamin (50 mg/kg) und Pentobarbital (50 mg/kg). Die beschriebenen Verfahren sind akut und enden mit einer Euthanasie, die durch eine Überdosierung von Pentobarbital (150 mg/kg) induziert wird, gefolgt von einer Thorakotomie; Die Aufnahme eines Analgetikums ist für den terminalen Eingriff nicht erforderlich.
2. Halten Sie für den Rest des Versuchs ein Heizkissen unter dem Tier.
3. Halten Sie die Augen während des anschließenden chirurgischen Einsetzens von Gefäßkanülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung feucht.
4. Bereiten Sie eine Gefäßkanüle für nachfolgende Infusionen von fluoreszierenden Tracern vor. Auf die Spitze einer Spritzennadel wird ein 20 cm langer Polyethylenschlauch (z.B. 0,28 mm Innendurchmesser; 0,61 mm Außendurchmesser) gelegt, wobei das scharfe Ende der Nadel zuvor durch Hin- und Herbiegen mit einem Hämostaten abgebrochen wird.
5. Füllen Sie eine Spritze und einen Schlauch mit heparinisierter (25 U/ml) Kochsalzlösung.
6. Rasieren Sie eine Seite des Unterbauchs und machen Sie einen Schnitt, um die Oberschenkelvene freizulegen.
7. Um die Vena femoralis zu kanülieren, binden Sie das Gefäß mit einer 5.0-Naht ab, machen Sie einen teilweisen Schnitt in das Gefäß (etwa die Hälfte des Gefäßdurchmessers) und führen Sie den Schlauch in das Gefäß ein, wobei Sie den Schlauch mit der Naht um den kanülierten Abschnitt befestigen.

3. Vorbereitung für die Intravitalmikroskopie

1. Erweitern Sie die Pupille des Auges mit einem Tropfen 1% Tropicamid-Ophthalmologie, gefolgt von einem Tropfen 2,5% Hypromellose-Ophthalmologie.
2. Decken Sie das Auge mit einem 5 mm Glasdeckglas ab.
3. Legen Sie das Tier auf eine Plexiglasplatte, die unter dem Mikroskopobjektiv eines aufrechten Mikroskops positioniert wird. Platzieren Sie die chirurgische Gaze strategisch unter dem Kopf, um eine direkte Achse durch das Objektiv zur zentralen Netzhaut und Papille zu ermöglichen.
4. Fokussieren Sie durch das Mikroskop auf die Sehscheibe, finden Sie die Scheibe mit einem 4X-Objektiv mit geringer Leistung und verwenden Sie einen Fluoreszeinfilter.

4. Infusion von fluoreszierenden Mikrosphären zur Messung von Geschwindigkeiten

1. Fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv auf die Netzhaut mit der Sehscheibe in der Mitte des Sichtfelds.
2. Die fluoreszierende Mikrosphärenlösung wird mit einer Geschwindigkeit von 250 μl/min/kg infundiert.
3. Nehmen Sie die sichtbare Netzhaut um die Sehplatte herum mit einer Kamerabelichtungszeit von ~8 ms auf Video auf.
4. Beenden Sie die Mikrosphären-Infusion, wenn eine ausreichende Dauer des Videos aufgezeichnet wurde (1-2 Minuten); etwas Mikrosphärenlösung wird wahrscheinlich nicht verwendet.

5. Infusion eines fluoreszierenden Plasmamarkers zur Messung von Durchmessern

1. Fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv auf die Netzhaut mit der Sehscheibe in der Mitte des Sichtfelds.
2. Die vorbereitete Lösung von fluoreszierendem Dextran wird während der Videoaufzeichnung als Bolus über ~5 Sekunden in die Oberschenkelvene infundiert. Dieses Video hilft dabei, die Identität der Arteriolen im Vergleich zu den Venolen zu bestimmen, wobei die Arteriolen zuerst perfundiert werden. Führen Sie diesen Schritt mit einer Belichtungszeit der Kamera von ~8 ms aus, obwohl die genaue Belichtungszeit nicht entscheidend ist.
3. Wechseln Sie zu einem 10-fachen Objektiv und einer Belichtungszeit von 20-40 ms, um eine verbesserte Auflösung für das Video jeder der 4-7 Arteriolen und 4-7 Venolen in der oberflächlichen Netzhaut zu erzielen. Fokussieren Sie jeweils auf etwa einen Quadranten der sichtbaren Netzhaut (und nehmen Sie sie auf Video auf), wobei sich die Mitte der Sehscheibe in einer Ecke des Sichtfelds befindet. Es sollte versucht werden, die Zeit, in der das Mikroskoplicht das Gewebe beleuchtet, zu minimieren, um die Möglichkeit einer licht-/farbstoffinduzierten Phototoxizität zu verringern¹⁷.

6. Videoanalyse

1. Kalibrieren Sie das Videosystem mit Hilfe einer Mikrometerskala für eine Umrechnung von μm/Pixel.
2. Mit einer Bildbearbeitungssoftware können Sie das aufgenommene Video wiedergeben.
3. Anhand des Videos der Bolusinfusion von fluoreszierendem Dextran können Sie Arteriolen von Venolen unterscheiden.
4. Messen Sie für jede der 4-7 Arteriolen und 4-7 Venolen, die mit dem 10X-Objektiv aufgezeichnet wurden, die mit fluoreszierendem Dextran gefüllten Durchmesser, wobei Sie durchschnittlich 5 Messungen des Durchmessers pro Gefäß entlang der sichtbaren Länge durchführen.
5. Messen Sie für jede der gleichen Arteriolen und Venolen die Streifenlänge der fluoreszierenden Mikrosphären mit 10 aufeinanderfolgenden Mikrosphärenstreifen in jedem Gefäß, um eine Selektionsverzerrung zu vermeiden. Teilen Sie die Streifenlängen durch die Belichtungszeit, um die Mikrosphärengeschwindigkeit zu berechnen, z. B. 160 μm/8 ms = 20 μm/ms = 2 cm/sec. Durchschnittlich die 10 Geschwindigkeiten pro Schiff.
6. Berechnen Sie den Volumenstrom für jedes Gefäß mit der folgenden Gleichung: Durchfluss = mittlere Geschwindigkeit × π × Durchmesser²/4.
7. Summieren Sie die arteriolären Flussraten und getrennt die venulären Flussraten, um den gesamten retinalen Blutfluss zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt Einzelbilder eines Videos aus einem Experiment, wobei die Panels A–D und F–I Fluoreszenz-Mikrokugel-Streifen darstellen, die mit einem 4X Objektiv und einer Belichtungszeit von 8 ms aufgenommen wurden (sowie einer Binning-Einstellung von 2 × 2 Pixeln zur Verringerung der Videodateigröße). Abbildung 1E zeigt die Orientierung der Netzhautgefäße in den anderen Panels der Abbildung. Nicht jedes Videobild enthält einen scharf abgebildeten fluoreszierenden Stre...

Diskussion

Diese Technik der intravitalen Videomikroskopie kann nicht nur auf Mäuse, sondern auch auf Ratten angewendet werden. Dieses Protokoll stützt sich nur auf einige Annahmen, ist aber auf die Anwendung unter Narkose und mit Pupillenerweiterung, wie wir sie beschrieben haben, beschränkt. Die anderen Annahmen und Einschränkungen lauten wie folgt:

1. Annahme eines minimalen optischen Vergrößerungsfehlers, der sich aus der Brechungsnatur des Auges ergibt. Wie von anderen^18-20

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fluoreszierende Mikrosphären	Bangs Laboratories	FS04F/10584 (grün)
Fluoreszierende Dextran-Molekularsonden mit hohem Molekulargewicht		D-7137 (grün); D-7139 (rot)
Mikroskopsystem	Nikon	Eclipse E600FN + Aufsätze
4X Objektiv	Nikon	Plan Fluor 4X	numerische Apertur 0,13; Arbeitsabstand 17,2 mm
10X Objektiv	Nikon	Plan 10X	numerische Apertur 0,25; Arbeitsabstand 10,5 mm
Tropicamid ophthalmische Lösung	Bausch Lomb	1% Tropicamid
Hypromellose ophthalmologische Lösung	HUB Pharmaceuticals	2,5 % Goniovisc
Bildverarbeitungssoftware	University of California San Francisco Vale Lab	Micro-Manager
Digitale Videokamera für die Mikroskopie	Photometrie	CoolSnap ES	1392 x 1040 Pixel Auflösung; Pixelgröße 6,45 x 6,45 μ m