Sammlung und Analyse von Arabidopsis Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

Zusammenfassung

Die Kenntnis der Zusammensetzung des Phloemsaft sowie der Mechanismus ihrer Be-und Fernverkehr ist für das Verständnis der Langstrecken-Signalisierung in der Entwicklung von Pflanzen und Stress / Pathogen Reaktion und assimilieren Transport unerlässlich. Dieses Manuskript beschreibt die Sammlung von Phloemexsudaten mit der EDTA-Methode erleichtert.

Zusammenfassung

Die Pflanze Phloem ist wesentlich für die Langstrecken-Transport von (Foto-) assimiliert sowie von Signalen, die biotischen oder abiotischen Stress. Es enthält Zucker, Aminosäuren, Proteine, RNA, Lipide und andere Metaboliten. Zwar gibt es ein großes Interesse in das Verständnis der Zusammensetzung und Funktion des Phloem, die Rolle der viele dieser Moleküle und damit ihre Bedeutung in der Entwicklung von Pflanzen und Stressreaktion muss noch bestimmt werden. Ein Hindernis für die Phloem Analyse liegt in der Tatsache, dass die Dichtungen selbst Phloem nach Verwundung. Als ein Ergebnis ist die Anzahl der Pflanzen, von denen Phloemsaft erhalten werden können, beschränkt. Eine Methode, die Sammlung von Phloemexsudaten ermöglicht aus mehreren Pflanzenarten ohne zusätzliche Ausrüstung ist die EDTA-erleichterten Phloem Exsudat Sammlung hier beschrieben. Zwar ist es leicht zu bedienen ist, führt es auf die Verwundung von Zellen und darauf zu achten, um den Inhalt der beschädigten Zellen zu entfernen. Darüber hinaus, um mehrere Kontrollen nicht Reinheit des Exsudatserforderlich. Weil es ein Ausschwitzen statt einer direkten Sammlung des Phloemsaft (nicht möglich bei vielen Arten) nur relative Quantifizierung der Inhalte auftreten können. Der Vorteil dieser Methode gegenüber anderen ist, dass es in vielen krautigen oder Gehölzarten (Perilla, Arabidopsis, Pappel, etc.) verwendet werden und erfordert nur minimale Ausrüstung und Ausbildung. Es führt zu einer relativ großen Mengen an Ausscheidungen, die für die anschließende Analyse von Proteinen, Zuckern, Lipiden, RNA, Viren und Metaboliten verwendet werden können. Es ist einfach genug, dass es sowohl in einer Forschung als auch in einem Labor Lehre verwendet werden kann.

Einleitung

Pflanzen können sich nicht bewegen, um widrigen Bedingungen zu entkommen. Folglich mussten sie Mechanismen auf Belastungen der Umwelt erkennen zu entwickeln, zu entlocken und senden ein Signal verwandten in der gesamten Anlage, und stellen Sie die Entwicklung entsprechend. Zwei Transportsysteme gibt es für die Verteilung von Wasser, Nährstoffe und andere (Signalisierung)-Verbindungen. Das erste ist das Xylem, die in der Regel transportiert Wasser und Mineralien von den Wurzeln in der gesamten Anlage gemacht. Das zweite ist das Phloem. Der Blick auf das Phloem hat sich von einem einfachen assimilieren Transportsystem mit einer Leitung für RNA verändert, Eiweiß, Viren, Lipide und andere kleine Moleküle. Es spielt eine wichtige Rolle in assimilieren und Stofftransport, als Reaktion auf biotische und abiotische Stress sowie in Pflanzenwachstum und-entwicklung. Es heißt jetzt "Datenautobahn" der Anlage ^18.

Phloemparenchymzellen, sowie spezialisierte Begleiter ce: Das Phloem besteht aus mehreren Zelltypen bestehenlls und Siebelementen. Das Sieb Element ist die Website von Fern-Bewegung. Um freie Längs fließen zu lassen, werden Siebelementen fehlen die meisten Organellen sowie Kerne und sind gedacht, um im besten Fall eine begrenzte Translationsmaschinerie ^{21, 33} enthalten. Es wird angenommen, dass Begleitzellen Proteine ​​und andere Verbindungen, die im Phloem reisen strömen zu synthetisieren. Diese Verbindungen werden dann in das Siebelement über plasmodesmata transportiert und kann als lange Strecke Signale ^4,16 funktionieren.

Mehrere Gruppen von Verbindungen können in Phloemexsudaten gefunden werden:

• Zucker sind oft die Produkte der Photosynthese und werden als "energietragende" Moleküle in andere Teile der Anlage zur Lagerung oder als Bausteine ​​transportiert. Sie können aber auch als Frostschutzmittel oder als Signalstoffe funktionieren.
• Proteine ​​können auch in Phloemexsudaten gefunden werden. Dazu gehören aber auch metabolische Enzyme haben Meldefunktion. Eine Blutzuckerwerle eines Proteins, das als Entwicklungs-Signal dient, ist die Blüte locus T-Protein, das die Induktion der Blüte sowie saisonale Blattabwurfs in Anlagen signalisiert. ⁶
• Nukleinsäuren sind in Phloemexsudaten in Form von mRNA, Klein-und Kleinstunternehmen RNAs und viralen RNAs. Sie scheinen weitgehend in Signalisierung ^{27, 28, 39} einbezogen werden. Zur gleichen Zeit, haben rRNA und tRNAs für fast alle Aminosäuren in der Phloemsaft der Kürbisgewächse ⁴² beobachtet worden. Sie erscheinen, um selektiv in das Sieb Rohr übertragen werden. Die tRNAs zeigen notwendigen Änderungen für die Fähigkeit, Aminosäuren zur Translationsgerät übertragen. Doch nicht teilnehmenden Übersetzung, scheinen sie diesen Prozess hemmen. Alternativ kann sie als eine Quelle von Cytokinin dienen oder signalisieren die metabolischen Zustand der Anlage ^42.
• Fettsäuren, Oxylipine und andere Lipide auch in Phloemexsudaten ^{3, 13, 14, 23} gefunden. Jasmonic Säure, ein Oxylipin bewegt sich durch das Phloem als Teil der Reaktion auf Pathogeninfektion ^{22, 29, 31, 32.} Während die Rolle der meisten Phloem Lipide, ist noch unklar, einige von ihnen haben wahrscheinlich Meldefunktion ^4.

Die Herausforderung in der Arbeit mit Pflanzen Phloem liegt in seiner Fähigkeit, sich auf Verwundung versiegeln. Es gibt vier große Methoden zur Phloemexsudaten sammeln, aber sie funktionieren nur in ausgewählten Arten:

1) In Kürbisgewächse ist es möglich, in angemessener Höhe zur Phloem Exsudat durch Kürzungen der Blattstiel zu erhalten. Sobald der erste Tropfen mit Kontamination von verletzten Zellen entfernt wird, ist es möglich, relativ große Mengen an reinen Phloemsaft ^{1, 15} zu erhalten. Doch mit zunehmender Sammlung Zeit, diese Exsudat verdickt, so dass es zunehmend ungeeignet für die Flüssigkeitschromatographie Ansätze (unveröffentlicht). Neuere Publikationen deuten, dass je nach Art, diese Phloemsaft von eithe abgeleitetr die faszikuläre (FP) oder die extrafaszikuläres Phloem (EP) und das, während sie enthalten "mobile" Phloemsaft aus den Siebelementen (FP) tut, ist es auch anfällig für Verunreinigungen durch andere Zelltypen, einschließlich der Xylem ^{40, 41} .

2) Ein zweiter Ansatz ist Phloemsaft durch flache Schnitte oder Einstiche in Stamm-oder Blattstiel zu erhalten. Diese Methode wurde erfolgreich in Lupine ^{17, 25, 36} Kürbisgewächse und Brassica napus ¹² verwendet. Hier ist die Kontamination von verletzten Zellen ist minimal und die Ausscheidungen sehr rein. Allerdings müssen Pflanzen gesund zu sein und gut bewässert, da es sehr schwierig ist, selektiv nur die Punktion Siebelementen. Wenn Xylemgefäße geklaut werden, wird alle Exsudat in das Xylem Strom gezogen. Dies macht das Verfahren nicht geeignet für Anlagen mit sehr zerbrechlich oder stark verholzten Stielen oder Stielen.

3) Blattlaus stylectomy ermöglicht Blattläuse ihre Stilett in die Siebelementen legen Sie dien Entfernen der Blattlaus mit einem Laser. Phloemsaft ist durch den verbleibenden Mandrin ^{2, 9, 10, 35, 38} ausgeschieden. In der Theorie kann jeder Pflanze, die von Blattläusen befallen werden können für diesen Ansatz verwendet werden. Allerdings werden die meisten Gewächshaus oder Klimakammer Manager unterstützt die Verwendung eines Erregers. Darüber hinaus vorstellen Blattläuse mehrere Proteine ​​in das Phloem mit ihrem Speichel ^{19, 33.} Dies führt zu einer beschränkten Transkriptions Umprogrammierung ³⁰ und hat das Potential, das Phloem Zusammensetzung ²⁶ zu ändern.

4) Die hier beschriebene Methode ist die EDTA-erleichtert Ausschwitzen Phloemsaft. Dieses Verfahren verwendet EDTA Abdichtung des Phloem ²⁰ zu verhindern. EDTA Chelate Ca ^{2 +-Ionen,} die sonst in Prozesse, die Abdichtung des Phloem teilnehmen würden. Während EDTA zu Zellschädigungen ³⁰ führen kann, haben einige Gruppen diese Methode verwendet und beobachtet keine nachteilige Wirkung von EDTA-Konzentrationen von 10 bis 20 mm auf der Ultrastruktur der Zelle oder auf phloem Verladung und Transport ^{5, 24.} Um keine schädliche Wirkung sowie durch Störungen von EDTA mit Chromatographie und Gel-Elektrophorese zu reduzieren, werden die Pflanzen in Wasser nach 1 h bewegt und nur die späteren Teil des Exsudat ¹⁴ verwendet. So, anstatt Exsudation in EDTA wird Phloem in Wasser (EDTA-erleichtert Ausschwitzen) exudated. Es ist eine geradlinige, niedrige Kosten, und Low-Tech-Verfahren für die Sammlung von Phloemexsudaten. Phloemsaft erhalten auf diese Weise verwendet werden, um Proteine, kleine Moleküle, Lipide und RNAs zu analysieren und wurde erfolgreich in vielen Pflanzen verwendet. Während eine begrenzte Anzahl von Versuchen in Monokotyledonen ¹¹ durchgeführt wurde, wird das Verfahren besser geeignet für Dikotyledonen (Perilla ^{17, 20,} Arabidopsis ^{8, 13, 14,} Pappel ^7). Sammlung von Exsudaten muss in einer feuchten Umgebung, um den Verlust von Ausscheidungen durch Transpiration zu vermeiden auftreten. Je nach Anlage ist Inkubation in EDTA für ein bis zwei Stundenausreicht, um die Abdichtung der Phloem / Siebelementen verhindern. Die Sammlung kann dann in Wasser auftreten. Dies hat den Vorteil, damit negative Auswirkungen EDTA weist an Zellstruktur und Stabilität. Es entfällt auch die Interferenz von EDTA mit Methoden wie HPLC oder SDS-PAGE. Es wird gezeigt, wie es um Arabidopsis gilt. Bei größeren Anlagen, hat Inkubation in EDTA und Exsudat Sammlungen bis skaliert werden und wird in Bechern anstatt in 1,7 ml Reaktionsgefäße durchgeführt.

Protokoll

1. Herstellung von Pflanzen

1. Arabidopsis Samen können direkt auf dem Boden oder auf MS Platten gekeimt werden. Wachsen die Pflanzen für vier bis sechs Wochen in Klimakammern mit einer 12-Stunden-Photoperiode (22 ° C Tag, 15 ° C Nacht ^14). Wasserpflanzen ein-bis zweimal in der Woche. Verwenden Bodenwanne für die Bewässerung; nicht Wasserpflanzen von oben; ermöglichen die Tabletts, bevor erneut Wasser trocknen. Achten Sie darauf, Pflanzen sind gut hydriert zum Zeitpunkt der Ernte.

2. Herstellung von Lösungen und Geschirr

1. K _{2-EDTA-Lösung:} Machen Sie eine 100 mM K _2-EDTA Lösung stock Lösung, die im Kühlschrank aufbewahrt werden. Am Tag der Sammlung, verdünnte die Lösung 1-5 (ein Teil EDTA-Lösung, vier Teile Wasser), um eine 20 mM K _{2-EDTA-Lösung} zu erhalten.
2. Füllen Sie ein Glas oder eine Petrischale (Durchmesser 7-15 cm) zur Hälfte mit dem 20 mM K _{2-EDTA-Lösung.} Wenn Sammeln von Proben aus verschiedenen Behandlungen (zBreichlich Steuer-und Salz-gestressten Pflanzen oder verschiedenen Genotypen), bereiten separaten Gerichte für jede Behandlung.
3. Füllen gewünschte Anzahl von 1,7 ml Reaktionsgefäße mit 1,4 ml 20 mM K _{2-EDTA-Lösung.} Füllen einer gleichen Anzahl von Reaktionsrohren mit 1,4 ml autoklaviert deionisiertem oder Millipore-Wasser.
4. Legen Sie Papier Handtücher auf der Bank, um Pflanzen am Set; erhalten eine neue Rasierklinge und setzen auf Handschuhe.

3. Sammlung von Phloemexsudaten (Dargestellt in Flussdiagramm in Abbildung 1)

1. Ernte Rosettenblätter von vier auf sechs Wochen alten Pflanzen, indem sie mit der Rasierklinge an der Basis des Stiels in der Nähe der Mitte der Rosette.
2. Sofort legen Sie die Blätter in den Schalen mit 20 mM K _2-EDTA. Stellen Sie sicher, das abgeschnittene Ende der Blattstiel in die Lösung eingetaucht ist (Abbildung 2).
3. Sobald 15 Blätter wurden gesammelt (ca. drei Minuten vor vier Pflanzen), sanft stapeln Blätter auf der jeweils anderen wie tHut der Schnitt Blattstiele sind zueinander ausgerichtet. Umschnitt der Basis der Blattstiele (ca. 1 mm) und sofort in die Blätter in einem der Reaktionsgefäße mit 20 mM K _{2-EDTA-Lösung.} Die Blätter passen am einfachsten, wenn sie leicht aufgerollt. Vermeiden Sie drückte die Blätter in da dies könnte Verletzungen von Zellen und führt somit zu der Sammlung von Blattzelle Inhalte führen.
4. Wenn mehr Material benötigt wird, sanft decken die Proben mit einem feuchten Papiertuch. Verwenden Sie eine neue Reihe von Gerichten, wenn für die Entnahme von Proben aus verschiedenen Behandlungen oder Genotypen.
5. Nachdem alle Proben in Reaktionsgefäße positioniert, sammeln die Ausscheidungen entweder im Dunkeln oder im Licht.
6. Zum Sammeln in der Dunkelheit, Linie der Boden eines großen flachen Teller mit feuchten Papiertüchern. Setzen Sie den Ständer mit den Blatt-gefüllte Reaktionsgefäße in die Schüssel und entweder mit nassen Papiertüchern oder in eine schwarze Kunststoff-Rückseite mit Schlitzen für die Belüftung. Legen Sie das gesamte Setup in einem Schrank oder in einen dunklen Raum.
7. Zum Sammeln im Licht, Den Boden einer klaren Plexiglas-Behälter mit feuchten Papiertüchern. Setzen Sie den Ständer mit den Blatt-gefüllte Reaktionsgefäße in dem Behälter und schließen Sie es.
8. Nach 1 Stunde, Blätter zu entfernen sanft aus dem Behälter und den Reaktionsrohren und gründlich mit destilliertem, deionisiertem oder Millipore-Wasser, um alle EDTA zu entfernen. Dieser Schritt dient drei Zwecken: (1) es entfernt das EDTA minimiert Schäden an den Zellen, (2) es beseitigt die Störung von EDTA mit SDS-PAGE und Chromatographie, und (3) entfernt alle Verbindungen, die aus geschnittenen angesammelt haben / beschädigt Zellen. Sofort in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit autoklaviertes Wasser übertragen und zu den befeuchteten Sammelbehälter für die Sammlung von Ausscheidungen. An dieser Stelle hinzufügen RNase-Inhibitor, wenn das Exsudat muss zur RNA-Extraktion verwendet werden. Optional: Proteinase-Inhibitor hinzugefügt, wenn Protein Analyse gewünscht wird.
9. Nach der beabsichtigten Abholzeit, herausziehen und discard die Blätter und einfrieren Phloemexsudaten in flüssigem N ₂ für die weitere Verwendung. Wenn längere Lagerung erforderlich ist, lyophilisieren die Proben und bei -80 ° C
10. Im Falle von Arabidopsis durch Metabolite bereits nach dem Sammeln von Exsudaten 1 Stunde nachgewiesen werden. Allerdings ist eine Sammlung für 5-8 Stunden sinnvoll, wenn die Analyse von weniger reichlich Komponenten geplant. Bei größeren Anlagen wie Perilla, längere Abholzeiten (8 St.) empfohlen.
    Exsudat gesammelt aus 15 Blättern ist in der Regel ausreichend für eine Spur auf einem SDS-PAGE-Gel (Proteine), für die mRNA-Extraktion, GC-MS (Zucker und Metaboliten). Für Lipidanalyse die Bündelung von 2-3 Proben (Exsudat 30-45 Blätter) wird empfohlen und führt zu klareren Ergebnissen.

4. Die anschließende Analyse (Für Video zeigen wir nur 4.4)

1. Für Protein-Analyse, resuspendieren Probe in 15 ul Wasser und 30 ul Lämmli Puffer, Hitze bis 95 ° C für 5 min, schnell Spin-Down jede precipitates und laden gesamte Probe auf einem SDS-PAGE-Gel (45 ul Laden Taschen). Die Proben sollten mit kolloidalem Coomassie oder andere empfindliche Flecken gefärbt werden, da Proteinfülle ist sehr gering.
2. Für Zucker und kleine Metabolitenanalyse, fügen Derivatisierungsmittel auf die getrocknete Probe, wie in der Literatur ¹⁴ beschrieben.
3. mRNA analysiert unter Verwendung von RT-PCR, Microarray-oder RNA-Seq-Analyse werden.
4. Für Lipidanalyse sofort Pool zwei vor drei Proben und Partition gegen Chloroform: Methanol (1:1) im Abzug wie folgt: in eine gleiche Menge Chloroform: Methanol zu jeder Probe, Wirbel für ein paar Sekunden, und Zentrifuge für 4 min bei 400 x g. Sammeln Sie die untere (organische) Phase in ein Glasrohr mit Teflon-Kappe und wiederholen Partition mit der oberen Phase noch dreimal. Die vereinigten organischen Phasen unter einem Strom von N ₂ und legt weitere Analyse (Dünnschichtchromatographie: DC ^{14, 37;} Flüssig-Chromatographie-Massenspektrometrie: LC-MS ^14).

Ergebnisse

Es hat sich in den vergangenen Jahren deutlich, dass die Komplexität des Phloemsaft kann die Antwort auf die Frage, wie Pflanzen senden unterschiedliche Entwicklungs-und Stress-Signale für eine optimale Reaktion sein. Mit EDTA-erleichtert Phloem Ausschwitzen kann die Möglichkeit bieten, Phloemexsudaten aus Pflanzen, die nicht geeignet sind für andere Ansätze, sondern kann aus wirtschaftlichen oder physiologischen Interesse sein zu analysieren.

Diese Methode ermöglicht die Ernte genug Phloemexsudaten zu Phloem-lokalisierten Proteine ​​zu identifizieren und erkennen Veränderungen in ihrer Ebene in Reaktion auf die Entwicklung oder Stress (Abbildung 3). Wie die Abbildung zeigt, Proteine ​​sind in sehr geringer Menge, und doch ist ihr hoch genug für die anschließende Proteomik Experimente mit LC-MS/MS oder Western-Blot-Analyse. Würdigung in Kürbisgewächse legen nahe, dass das Schneiden der Stammzellen zu einer Störung des Wasser Potential Balance und einem nachfolgenden Einstrom von Wasser führt undmögliche Verunreinigungen aus dem Apoplast ^41. Doch Sammlung für Zeiten zwischen einem bis acht Stunden keinen Einfluss auf die Phloem Protein profile / Zusammensetzung in Arabidopsis (. Nur die absolute Höhe variiert Guelette et al), die Menge des Proteins gesammelt und das Muster der Proteine ​​gefunden variiert zwischen den Arten (Arabidopsis: An; Perilla, Spur I und NI) und Behandlungen (Perilla in verschiedenen Längen Tag gewachsen, Spur I und NI). Als Ergebnis proteinhaltigen Signale visualisiert werden können, identifiziert und verfolgt.

mRNA-und Mikro-RNAs können auch in Phloemexsudaten durch dieses Verfahren identifiziert werden. Allerdings ist die Behandlung mit RNAse-Inhibitor erforderlich, um den Abbau der mRNA in der verlängerten Ausschwitzen der Zeit zu verhindern. Da die Siebelementen nicht enthalten funktionelle Chloroplasten, Rubisco kleinen oder großen Untereinheit (RbcS oder RbcL, respectively) mRNAs kann als negative Kontrollen verwendet werden, während bekannt PhloemLokalisierten mRNA wie Ubiquitin konjugierendes Enzym kann als positive Kontrolle (Abbildung 4) verwendet werden.

Ebenso können Zucker oder kleinen Metaboliten analysiert entweder mit GC-MS oder LC-MS werden. Hier sei erwähnt, dass die Phloemexsudaten eine große Anzahl von funktionellen Enzymen, darunter fast die gesamte Glykolyse ¹² enthalten. Daher kann die Verwendung von verschiedenen Zeitpunkten während der Stoffwechselprozesse Exsudat Kollektion offenbaren. Ein Beispiel ist in Abbildung 5 dargestellt: In allen Ausscheidungen, Saccharose ist das am häufigsten vorkommende Metaboliten, das ist die offensichtlichste nach einer Sammlung für 1 Stunde. Nach fünf Stunden wurde die Saccharose zu Fructose-Verhältnis leicht reduziert. Wenn die gleiche Exsudat für eine Stunde gesammelt und links auf der Bank für die nächsten vier Stunden wird die Saccharose zu Fructose Verhältnis zu einem viel größeren Ausmaß reduziert, was darauf hindeutet, dass die aktive Enzyme im Phloem führen zu einem Abbau von Saccharose Ausscheidungen bei Raumtemperaturtemperatur (für weitere Interpretationen Spitze sehen ^14). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen, dass Phloembeladung und Transport von Molekülen aus Begleiter Zellen in die Siebelementen während Ausschwitzen fortsetzen kann, bis das System verliert seine Vitalität ^34.

Lipide in den Phloemexsudaten und durch die Erweiterung, sind Fern-Lipid-Signalisierung ein relativ neues Feld von Interesse in Plant Science. Aufgrund ihrer hydrophoben Natur Lipide sind nur in geringen Konzentrationen und können an andere Moleküle zur Solubilisierung gebunden. Dennoch kann die EDTA-erleichtert Ausschwitzen für die Sammlung von ausreichend Material zur Visualisierung (DC, Fig. 6) und identifizieren (LC-MS, Fig. 7) Phloem Lipide aus mehreren Pflanzenarten. Wie die Abbildung zeigt, ist es möglich, zu erkennen und zu trennen mehrere Lipide. LC-MS ermöglicht es, verschiedene Lipidspezies zu identifizieren und Veränderungen innerhalb der Lipid-Profile von differe überwachennt Genotypen oder Behandlungen. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Lipiden der Pflanzenentwicklung und Stressantwort.

Abbildung 1. Ablaufschema der Sammlung Phloemexsudaten von Arabidopsis oder Perilla. Verschiedene Wege führen zu unterschiedlichen Endprodukten, die in blau angegeben. Für die Herstellung von RNA, RNase-Inhibitor (100 U / ml, Roche) mit dem Wasser, in das das Phloem Exsudat gesammelt worden.
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Abbildung 2. Aufbau von Materialien für Phloem Exsudat sammelnion. Das Setup zeigt alle Materialien für die Protokoll-Schritte 3.1-3.4 benötigt.
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. Abbildung 3 Proteine ​​in Phloem gefunden Ausscheidungen von zwei verschiedenen Pflanzenarten Arabidopsis (At) und Perilla (I und NI, verschiedene Längen Tag); MW: Molekulargewichtsmarker (Spur 2). Proteine ​​wurden unter Verwendung eines 10-20% Gradienten-SDS-PAGE.
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Abbildung 4. Analysisdie Anwesenheit von mRNA für Rubisco kleinen und großen Untereinheit (Erythrozyten und RbcL, jeweils) und Ubiquitin konjugierendes Enzym (UBC). mRNA von Arabidopsis Blättern (L), Blattstiele (P) und Phloemexsudaten (Ph) wurde gesammelt, revers transkribiert und spezifisch Transkripte visualisiert unter Verwendung von PCR. Die Figur wurde von Guelette et al modifiziert. ^14.
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Abbildung 5. GC-MS Profil Phloemexsudaten für unterschiedliche Höhe der Zeit gesammelt. Beachten Sie, wie die relative Menge von Saccharose Änderungen ab 1 Stunde Sammlung (A) bis 5 Stunden nach der Entnahme Zeit (B). Exsudat Profil nach der Sammlung für 1 Stunde mit dem "Inkubation" bei Zimmertemperatur gefolgt (RT) für vier Stunden (C). Blatt Metabolitenprofil (D).
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Abbildung 6. Dünnschichtchromatogram Vergleich Lipide aus Perilla (links) und Arabidopsis (rechts) Blätter und Phloemexsudaten. Sternchen zeigen Lipide spezifisch für Phloemexsudaten. DGDG: Digalactosyldiacylglycerol; PG: Phosphatidylglycerin; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, die Teil der Figur zeigt Arabidopsis Lipide aus Guelette et al modifiziert ^14..
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Abbildung 7. Lipid Profil Phloemexsudaten von Arabidopsis (Chloroform-Phase) mit LC-MS / Negativ-Ionen-Modus. Graphen in der oberen (Mutante, A) und unten (Wildtyp, B) zeigen die Unterschiede in den Lipid-Profile zwischen zwei verschiedenen Genotypen (durch Pfeile angedeutet).
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Diskussion

Die EDTA-erleichtert Sammlung von Phloemexsudaten ist sehr einfach, benötigt minimale Ausrüstung und ist für die meisten Pflanzen. Insgesamt erstreckt sich dieses Verfahren die Möglichkeit, Phloemexsudaten von mehr Arten zu analysieren. Obwohl das Exsudat verdünnt wird, ist es leicht, viele verschiedene Proben zu sammeln oder von vielen Pflanzen zu skalieren, um eine große Menge von Material. Dies ermöglicht dann zum Nachweis von neuen Verbindungen, die in sehr geringer Menge sind und ansonsten übersehen werden.

Diese Methode kann für mehrere Pflanzenarten eingesetzt werden und arbeitet als für die, die in diesem Manuskript beschrieben aufgelistet. Wenn neue Arten entdeckt werden, sind die beiden Aspekte, die geändert werden müssen möglicherweise die Anzahl der Blätter verwendet und die Zeit der Absonderung. In den meisten Fällen sollte ein fünf-bis 8 Stunden Ausschwitzen geeignet sein. Um die Verwendung dieser Methode für eine neue Pflanzenarten zu bestätigen, muss Exsudat gesammelt und eine oder mehrere der nachfolgenden Analyse wie in Protokoll Teil 4 n beschriebeneeds durchgeführt werden. In Abhängigkeit von der Intensität des Signals beobachtet, kann die Auffangvolumen müssen skaliert werden. In der Regel wird Lipid-und Protein-Analyse erfordern mehr Material als Zucker und Metabolit-Analyse seit der ehemalige weniger reichlich in Phloemexsudaten sind.

Da der EDTA-erleichtert Exsudat Sammlung beinhaltet geschnitten Oberflächen sowie eine möglicherweise schädliche Wirkung von EDTA, haben mehrere Punkte berücksichtigt werden: (1) nach der einstündigen Inkubation mit EDTA, haben die Blattstiele gründlich gewaschen werden. Dadurch werden alle Verbindungen von verletzten Zellen sowie die EDTA selbst, die Zellen beschädigen oder stören die Extraktion gewonnen. (2) Positive und negative Kontrollen enthalten müssen, damit Daten, die von Phloemsaft abgeleitet werden und nicht von verletzten Zellen (siehe kritischen Schritte unten). (3) Phloemsaft enthält zwar mehrere Enzyme, die aktiv sein konnte während Exsudat Sammlung. Daher wird in einigen Fällen kann es nützlich sein, fo sammelnr unterschiedliche Mengen an Zeit. (4) Da das Verfahren Exsudation in Wasser beteiligt sind, ist eine absolute Quantifizierung der Verbindungen nicht möglich.

Kritische Schritte: Der Schlüssel für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode ist die Verwendung von Vorsicht beim Umgang mit der Probe nicht zu verletzen keine Zellen sowie die Verwendung geeigneter Kontrollen (vgl. Rz ^14).. Eine geeignete Steuerung ist die Sammlung von Phloemexsudaten ohne vorherige Behandlung mit EDTA. In diesem Fall wird das Phloem Dichtung selbst und nicht Exsudat gesammelt werden können. Alle Verbindungen verunreinigt, die aus den Zellen Verwundeten hier erfasst werden. Ein zweiter würde die Analyse von Zuckern in dem Exsudat sein. In Arabidopsis sollte Saccharose die vorherrschende Metaboliten im Phloemsaft sein, mit Fructose Saccharose-Verhältnis von 1.04 bis 01.08 (Ref. ^{8, 14).}

Für die RNA-Extraktion die Verwendung einer RNAse-Inhibitor notwendig ist. Darüber hinaus ist eine positive Kontrolle von zuvor described Phloem-lokalisierten mRNA (UBC9: Ubiquitin conjugating Enzym 9, ^{At4g27960, 8, 14)} und eine negative Kontrolle von zum Beispiel ein Chloroplasten-mRNA (Rubisco LSU) sind ratsam.

Weil das Exsudat enthält aktive Enzyme wird eine Zeit natürlich empfohlen, dass Änderungen im Phloem Profil machen, sind nicht nur aufgrund von Variationen in der Abholzeit. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, Proteinase-Inhibitoren zu verwenden. Allerdings müssen die Ermittler im Auge zu behalten, dass die gesammelte Exsudat konzentriert werden und dass keine zugesetzten Verbindungen werden weitgehend konzentriert werden. Ein zweiter wichtiger Schritt innerhalb des Protokolls ist das Nachschneiden der Blattstiel unter EDTA. Dieser Schritt dient einem doppelten Zweck: Erstens, entfernt es keine verschlossenen Sieb Platten und verhindert gleichzeitig die Bildung neuer Stecker wodurch für freien Durchfluss des Phloemsaft. Zweitens, entfernt es die Kavitationsblase im Xylem erzeugt beim Schneiden und ermöglicht somit Xylem Transport. Die Größe des zweiten Zuschnitts abhängens auf die Pflanzen verwendet werden. In Anlagen mit größeren Blattstiele sollte einige Millimeter (ca. 1 cm) über dem ersten Schnitt in Pflanzen wie Arabidopsis sein, sind 1-2 mm ausreichend.

Die Verwendung dieser Methode kann zur Entdeckung neuer Verbindungen in Phloemexsudaten die haben signalisiert, Entwicklungs-oder biomedizinischen Auswirkungen führen könnte. Es hat eine mehr gefragt in tiefen Einblick in Fern-Lipid-Signalisierung, die ein wenig untersuchtes Feld innerhalb Pflanzenwissenschaften aufgrund des fehlenden Zugangs zum Phloem war.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Flache Petrischale aus Glas oder Kunststoff (7-15 cm)	PYREX oder Corning		Jede saubere, flache Schale funktioniert
Chloroform	EMD	CX1054-1	Nur offene Behälter im Abzug
Methanol	J.T.Baker	9070-03
Schraubverschluss-Röhrchen	VWR International	53283-800
Schraubverschluss-Röhrchen	Sun Sri	13-425
Eppendorf Rohre	Denville	C2170