Method Article

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

DOI:

10.3791/51116

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April 21st, 2014

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1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

In This Article

Summary

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Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden.

Abstract

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Kardiomyozyten von erkrankten Herzen sind komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur, Erregung Kontraktion Kupplung und Membranionenströme unterzogen. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich für das erhöhte Risiko und die arrhythmogene Kontraktions Veränderungen, die zu den systolischen und diastolischen Dysfunktion bei Herzpatienten verantwortlich zu sein. Allerdings hat die meisten Informationen über die Veränderungen der Myozyten-Funktion im Herzerkrankungen aus Tiermodellen zu kommen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll und zu validieren, um lebensfähige Muskelzellen von kleinen chirurgischen Proben von ventrikulären Myokard von Patienten, die Herzchirurgie Operationen zu isolieren. Das Protokoll wird im Detail beschrieben. Elektrophysiologischen und intrazellulären Calciummessungen berichtet, um die Durchführbarkeit einer Anzahl von Einzelzellmessungen in menschlichen Kardiomyozyten mit diesem Verfahren erhalten zu demonstrieren.

Das Protokoll berichtet erWieder kann für zukünftige Untersuchungen der zellulären und molekularen Basis der funktionellen Veränderungen des menschlichen Herzens in Gegenwart verschiedener Herzkrankheiten sein. Außerdem kann diese Methode verwendet, um neue therapeutische Targets auf zellulärer Ebene zu identifizieren und die Wirksamkeit der neuen Verbindungen auf die menschliche Herzmuskelzellen zu testen, mit direktem Translationswert werden.

Introduction

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Dissection der elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzmuskels hat sich deutlich nach der Entwicklung von Techniken für die einzelnen Herzmuskelzellen Isolation vorangekommen. Die jüngsten Fortschritte im Verständnis der Herzkontraktion Anregung Kopplung (EC-Coupling) haben auch durch die Fähigkeit der Isolierung lebensfähigen Einzel Kardiomyozyten, die alle physiologischen Eigenschaften des intakten Gewebes behalten gemacht worden. Patch-Clamp-Verfahren werden routinemäßig verwendet, um die Funktion und pharmakologische Modulation von Herz sarkolemmalen Ionenströme zu untersuchen. Aufnahmen der intrazellulären Calcium-Dynamik mit Ca 2 +-sensitiven Fa....

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Protocol

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Die Versuchsprotokolle auf menschlichem Gewebe wurden von der Ethikkommission der Universität Careggi-Krankenhaus (; erneuert Mai 2009 2006/0024713) zugelassen. Jeder Patient hat eine schriftliche Einverständniserklärung.

1. Solutions und Vorbereitung der Ausrüstung

Lösungen werden in Tabelle 1 beschrieben. Ein vereinfachtes Flussdiagramm des Zellisolationsverfahren ist in Fig. 1 angegeben.

Lösung CP DB KB TB PS EB1 EB2

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Results

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Das oben beschriebene Verfahren wurde verwendet, um die funktionellen Störungen von Kardiomyozyten aus der Scheidewand des Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) die Myektomie Operation unterzog isoliert charakterisieren, verglichen mit nicht andernfalls nicht hypertrophe chirurgischen Patienten 21. Die in diesem Abschnitt enthalten sind, aus diesem Werkstück 21 ab und sind hier als ein Beispiel, wie diese Technik verwendet, um die Änderungen der Herzmuskelzellfunktion bei Herzerkrankunge.......

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Discussion

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Wir haben beschrieben und validiert, eine Methode, um praktikable Muskelzellen von chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu isolieren. Ausgehend vom zuvor beschriebenen Protokolle, die erfolgreich an isolierten Zellen von Vorhof chirurgischen Proben, die Technik benutzt hatte, um eine Trennung von einzelnen tragfähige Muskelzellen von erkrankten Myokard entwickelt und fein abgestimmt. Frühe Berichte zeigten, dass Isolierung einzelner Kardiomyozyten aus Brocken von atriale und ventrikuläre Gewebe selektiv beeinträcht.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der EU (STREP Projekt 241577 "BIG HEART" 7. Europäischen Forschungsrahmenprogramm, CP), Menarini International Operations Luxemburg (AM), Telethon GGP07133 (CP) und Gilead Sciences (AM) unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Magnesiumsulfat-Heptahydrat(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenosinSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurinSigma-AldrichT0625
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma-AldrichP5958
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP9333
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Kaliumbicarbonat (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
NatriumpyruvatSigma-AldrichP2256
2,3-Butandion-MonoximSigma-AldrichB0753
Natriumhydroxid(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-Glutaminsäure-Monokaliumsalz-MonohydratSigma-Aldrich49601
BrenztraubensäureSigma-Aldrich107360
3-HydroxybuttersäureSigma-Aldrich166898
Adenosin 5′-Triphosphat-Dikaliumsalz-Dihydrat (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
KreatinSigma-AldrichC0780
BernsteinsäureSigma-AldrichS3674
Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumin aus RinderserumSigma-AldrichA0281
Magnesiumchlorid (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Kollagenase aus Clostridium histolyticum, Typ VSigma-AldrichC9263
Proteinase, bakteriell, Typ XXIVSigma-AldrichP8038
Calciumchloridlösung, ~1 M in H2OSigma-Aldrich21115
Calciumchlorid 0,1 M LösungSigma-Aldrich53704
KaliummethansulfonatSigma-Aldrich83000
FluoForte ReagenzEnzo Life SciencesENZ-52015
Powerload Konzentrat, 100XLife TechnologiesP10020
Perfusion Fast-Step SystemWarner InstrumentsVC-77SP
Amphotericin B solubilisiertSigma-AldrichA9528
Multiclamp 700B Patch-Clamp-VerstärkerMolecular Devices
Digidata 1440AMolecular Devices
pClamp10.0 Molecular Devices
AufschlussgerätCUSTOMCUSTOMDas Gerät wird in unserem Labor aus Kunststoffrohren, gegossenem Sylgard und einem Motor hergestellt und ist in Abbildung 1C-1D und in Abbildung 7 detailliert beschrieben. Weitere Details können wir Ihnen auf Anfrage zur Verfügung stellen.
Silikonelastomer für die Bürsten des AufschlussgerätsDow CorningSYLGARD® 184
Rotierender Motor mit variabler Drehzahl für das AufschlussgerätCrouzetCrouzet 178-4765
Form für Bürsten zum Gießenvon Bürsten N.A.N.A.Die Form wird aus Standard-PTFE-Stäben mit einem Durchmesser von 2,5 cm nach Maß gefertigt.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Iso....

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Human Ventricular CardiomyocytesCardiomyocyte IsolationVentricular MyocardiumEnzymatic DigestionPatch Clamp RecordingAction Potential MeasurementCalcium Transient AnalysisCardioplegic SolutionStromal Vascular FractionCell Suspension

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