Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren Chlamydia Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Infektionskrankheiten durch Arten der intrazelluläre Bakterium Chlamydia verursacht entlocken eine große Belastung für die globale Gesundheit, einschließlich sexuell übertragbare Krankheit, entzündliche Erkrankungen des Beckens, Blindheit, Pneumonie und möglicherweise Atherosklerose ^1-4. Die Fähigkeit von Chlamydia um mit der Wirtszelle wechselwirken, innerhalb einer Vakuole (genannt die Aufnahme), ist ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Infektion von Zellen und dem Host. Die Aufnahme ist eine neuartige pathogenen Fach, die Chlamydien-Wachstum ermöglicht und wird dynamisch über die gesamte 2-3 Tag Entwicklungszyklus von Chlamydia ⁵ modifiziert. Die obligat intrazelluläre Natur der Chlamydien stellt zahlreiche Herausforderungen für die Forschung, insbesondere für direkt an das Studium der einzigartigen Biologie der Eingliederung. Ein großes Handicap war die Unfähigkeit, entweder intrazellulären Chlamydien oder ihre Aufnahme von Fluoreszenz Ansatz effizient visualisierenes in lebenden Zellen. Eine neue Entdeckung hat endlich enthüllt die Mittel, um GFP-exprimierenden C. generieren trachomatis ^6; aber dieses Ergebnis noch nicht auf eine spezifische Markierung der Aufnahme geführt. Einige Techniken zur Markierung von Bakterien und Einschlüsse ^7,8 beschrieben worden, aber sie Mängel auf, wie nicht-Spezifität transiency und die Anfälligkeit gegen Ausbleichung leiden. Ein Schlüssel Entdeckung von unserer Arbeitsgruppe gegründet, eine neue Strategie für die Beleuchtung der Aufnahme mit GFP-exprimierenden Wirtszellen ^9. Diese Strategie rationell nutzt die intrinsische Undurchlässigkeit der Einschlußmembran bis größer als 520 Da ^{10 Molekülen.} Wenn Zellen entwickelt, um stabil eine bestimmte cytosolische fluoreszierende Protein (zB GFP oder mCherry) zum Ausdruck bringen, sind Chlamydia Einschlüsse mit außergewöhnlicher Klarheit durch ihre vollständigen Ausschluss der Fluoreszenz sichtbar. Diese umgekehrte Imaging-Strategie ermöglicht eine sofortige Visualisierung von Einschlüssen für alle Chlamydia Arten und es kann leicht für die meisten Wirtszellen von Interesse angepasst werden. Als Demonstration der Nützlichkeit wurde dieses Verfahren bisher verwendeten zu offenbaren und zu definieren, die zellulären Austrittswege für Chlamydia spp ^9.

Hier haben wir weiter zu zeigen, wie dieses Verfahren durchgeführt wird, und kann genutzt werden, um Schlüssel quantitative Daten über die Aufnahme Wachstumsdynamik abgeleitet werden. Darüber hinaus kann sie wirksam für teure Antikörper-basierte Zählverfahren ersetzen und kann in Kombination mit anderen fluoreszierenden Markern, wie mKate2 exprimierenden Chlamydia ¹¹ verwendet werden. Diese leistungsstarke Kombination von Werkzeugen ermöglicht Erforschung der physikalischen Eigenschaften des Chlamydien-Aufnahme-Membran im Inneren lebenden Wirtszellen.

1. Erzeugung von Leuchtstoff-Wirtszelllinien

1. Tag 1. Platte 293T-Zellen (oder andere retrovirale Verpackungslinie) auf 6-Well-Platten mit ² × 10 6 Zellen / Vertiefung, zu sein ~ 75% konfluent am nächsten Tag. Falls gewünscht, um die Platte zwei Vertiefungen für jede Retrovirus verwendet werden.
2. Tag 2. Saugen Sie Zellen und 2 ml frisches Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin). Transfektion von Zellen mit 5-8 & mgr; g jedes der retroviralen Vektor (enthaltend GFP) und Verpackungsvektor (z. B. pVSVg) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 oder einem ähnlichen Reagenz, und nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Inkubieren Zellen mit DNA für 4-6 Stunden in einem 37 ° C _CO 2 -Inkubator und anschließend Ersetzen Medium mit 1 ml Wachstumsmedium.
4. Inkubieren Zellen für 48 Stunden in 37 ° C _CO 2 -Inkubator.
5. Tag 3. Platte Zielzellen (z. B. HeLa) auf Platten mit 6 Vertiefungen bei einer Dichte von etwa ¹⁰ 5 Zellen / Vertiefung sein ~ 50% konfluentnächster Tag. Stellen Sie sicher, positive Transfektion in 293T-Zellen durch die Überwachung GFP-Fluoreszenz auf einem inversen Mikroskop.
6. Tag 4. Sammeln Retrovirus enthaltende Überstände abgehoben 293T-Zellen mit einer Pipette und Den Überstand durch ein 0,45 um-Celluloseacetat-Spritzenfilter.
7. Entfernen Sie Medium aus HeLa-Zellen und 0,5 ml Wachstumsmedium, das 16 ug / ml Polybren. Hinzufügen ~ 0,5 ml filtriert Retrovirus an Zellen tropfenweise und inkubieren Zellen in einem 37 ° C _CO 2 Inkubator für 24 Stunden. Speichern alle verbleibenden Retrovirus (dh aus dem Bohrloch zu duplizieren) bei 4 ° C.
8. Tag 5. Wenn zwei Vertiefungen wurden vorgenommen, um zusätzliche Retrovirus, wiederholen Sie Schritt 1.7 zu erzeugen, die in Reihe mit den übrigen retrovirale Partikel zu infizieren.
9. Tag 6. Passage transfizierten HeLa-Zellen 1: 1 in einem 10 cm Schale, die Auswahl-Antibiotika (zB 500 ug / ml Neomycin).
10. Warten Sie ausreichend Zeit für die transduzierten Zellen in Anwesenheit von Selektions antibio wieder wachsenTiC, wonach Zellen können durch Standard-Techniken mit einer geringeren Konzentration an Selektionsantibiotikum vermehrt werden (z. B. 200 ug / ml Neomycin).
    Anmerkung: Die Zellen können auch klonal für optimale Helligkeit zu dieser Zeit ausgewählt werden, wenn nötig.

2. Erzeugung von GFP-exprimierenden Chlamydia trachomatis

1. Vorbereitung 2x CaCl _2-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl _{2) und} 4SP Puffer (0,4 M Saccharose, 16 mM _Na 2 HPO _4).
2. Tag 1. Tauen Sie gefrorenes C. trachomatis Lager auf Eis und sofort zu verdünnen 10 ul Bakterien in 50 ul 2x _CaCl2 Puffer. In 3 ug Plasmid-DNA (z. B. pASK-GFP-mKate2-L2), gut mischen und Inkubation für 30 min bei 25 ° C.
3. Während dieser Stufe herzustellen Wirtszellen durch Trypsinierung eine T-75-Kolben McCoys-Zellen in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. Resuspend Zellpellet in geeigneten Volumen 1x _CaCl2 Puffer zu einer Endkonzentration von 4 x ¹⁰ 7 Zellen / ml zu ergeben.
4. Nach der 30 min Inkubation (aus Stufe 2.2) wird mit 100 & mgr; l an Transformationsgemisch Rohr (Gesamtvolumen 200 ul) hergestellt McCoy-Zellen und Inkubation weitere 20 min bei 25 ° C. Zugabe von 100 ul dieser transformierten Zellgemisches auf eine einzelne Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen und Überlagerung mit 2 ml Wachstumsmedium. Inkubieren bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage.
5. Tag 3. Lyse McCoy Zellen mit C infiziert trachomatis durch Ersatz-Medium mit 1 ml _dH 2 O und Kratzen Zellen mit einem gebogenen 1.000 ul Pipettenspitze. 1 ml 4SP Puffer und übergeben Suspension durch eine 27,5 G-Nadel ~ 5 mal für eine effiziente Zelllyse und Freisetzung von C. trachomatis.
6. Übertragungs 2 ml des Zellysats, die C. trachomatis in eine T-75-Kolben mit einer konfluenten Monolayer von frisch plattierten McCoy Zellen; 8 ml DMEM (ohne FBS) und Inkubation für 2 Stunden bei 25 ° C bis C ermöglichen trachomatis, sich an Zellen zu haften.
7. Saugen Sie Zellen und fügen Sie frisches Wachstumsmedium mit 10 U / ml Penicillin G und 1 ug / ml Cycloheximid ergänzt. Kolben für 48 h Inkubieren bei 37 ° C _CO 2 -Inkubator.
8. Tag 4. Stellen Sie sicher, durch Lichtmikroskopie, die Zellen infiziert und Einschlüsse enthalten anomale Chlamydia. Identifizieren Einschlüsse so hell Vakuolen auf einer Standard-Lichtmikroskop, und anomale Chlamydia Körper als ringartige Objekte innerhalb Einschlüsse, die größer als 2 & mgr; m Durchmesser.
9. Tag 5. Lyse Kultur durch Ersatz-Medium mit 2 ml _dH 2 O und kratzen Zellen in einer Suspension. 2 ml 4SP Puffer und übergeben Suspension durch eine 27,5 G-Nadel ~ 5 mal.
10. Verwenden Sie 2 ml Zelllysat, einen frischen Monoschicht von McCoy-Zellen in einem gut in einer 6-Well-Platte zu infizieren. Zellen mit Lysat Inkubieren für 2 Stunden bei 25 ° C, absaugen und fügen Sie frisches WachstumsMedium, das Penicillin G und Cycloheximid.
11. Inkubieren Zellen in einem 37 ° C _CO 2 -Inkubator für 3-5 Tage in Abhängigkeit von dem allgemeinen Gesundheitszustand der Zellen.
12. Wiederholen Sie die Schritte 2,9-2,10 einmal oder mehrmals, falls erforderlich, Passagieren Kulturen an die frische Wells in einer 6-Well-Platte, bis die normalen Suche Einschlüsse (ohne anomale Stellen) entstanden. Zu dieser Zeit verwenden einen invertierten Fluoreszenzmikroskop, um zu überprüfen, dass C. trachomatis auszudrücken mKate2 (rot).
13. Scale-up infizierten Kulturen zur Erzeugung von hohem Titer Chlamydienvorräte, beispielsweise durch Ernten Chlamydia Anten aus infizierten McCoy oder HeLa-Zellen in T-150 Kolben gezüchtet.

3. Infektion von Zellen mit Chlamydia

1. Platte GFP-HeLa-Zellen auf Wunsch Kulturgefäß, zum Beispiel Glasbodenschalen oder Kammer-Objektträgern für die hochauflösende Bildgebung, oder 24-Well-Platten für IFU Entschlossenheit und Multiwell-Screening.
2. Auftauen frozen Röhrchen mit C. trachomatis, C. muridarum, oder C. pneumoniae auf Eis und verdünnter in HBSS auf gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI), beispielsweise MOI = 1.
3. Führen entweder statisch oder Zentrifugation gestützten Infektionen bezogen auf die Chlamydia-Stamm, der verwendet wird.
   1. Bei Infektionen mit C. trachomatis LGV Serovar L2 oder C. muridarum waschen GFP-HeLa-Zellen mit HBSS und Inkubation mit verdünntem Bakterien für 2 h bei 25 ° C. Absaugen und waschen Sie die Zellen mit HBSS, und inkubieren Zellen in Wachstumsmedium in 37 ° C _CO 2 Inkubator.
   2. Bei Infektionen mit C. trachomatis Serovar D oder C pneumoniae, waschen GFP-HeLa-Zellen mit HBSS und fügen verdünnt Bakterien-Zellen. Zeigen Multiwellplatte oder Glasbodenschale (vom Band in einer Multiwellplatte Deckel gesichert) in einer Multiwellplatte Inhaber einer Schwingbecherrotor Anlage in einer Tischzentrifuge.
   3. Zentrifuge Zellen bei 900 g bei 25 ° C für 1 Stunde. Entfernen Kulturgefäße aus der Zentrifuge und in eine 37 ° C _CO 2 Inkubator für 1 Stunde.
   4. Saugen Sie Zellen in einer Biosicherheitswerkbank, waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS, und fügen Sie frisches Wachstumsmedium. Ortszellen in einem 37 ° C _CO 2 -Inkubator.

4. Live Cell Visualisierung von Chlamydia Einschlüsse

1. Entfernen Chlamydia infiziert GFP-HeLa-Zellen, die aus _CO 2 Inkubator und mit RPMI ersetzen Medium ohne Phenolrot + 5% FBS.
2. Berg Zellen auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse-Ti-E oder ähnliches) mit einem 20-fach oder höher Öl-Objektiv.
3. Verwenden von Imaging-Software (Volocity 6 oder ähnliches), konzentrieren sich auf und identifizieren Chlamydia infiziert GFP-HeLa-Zellen: grüne Zellen, die große schwarze Löcher (Chlamydia Einschlüsse).
4. Markieren Sie die xyz Positionen der Regionen, die Chlamydia infizierten Zellen von Interesse unter Verwendung von Imaging-Software (Volocity 6 oder ähnliches). Führen Sie dies durch manuelles "Hinzufügen von Punkten", während in der XY-Bühne Ansichtsmodus. Auf diese Weise werden XYZ-Koordinaten für jeden markierten Stelle gespeichert.
5. Im Dialogfeld Acquisition, zu konfigurieren Software auf grün (GFP, HeLa Cytosol) und rot (mKate2, C. trachomatis) Kanälen und mit einer Rate von neuen Bildern pro Kanal alle 5 min zu erwerben.
6. Erwerben Sie die Bildsequenz mit der Übernahme-Protokoll oben eingegeben, indem Sie auf die "Aufnahme / Aufnahme" Taste.

5. Quantifizierung von Inclusion Wachstumsparameter in lebenden Zellen

1. Zu gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion (z. B. 24, 48 hpi) entfernen Chlamydia infiziert GFP-HeLa-Zellen von Inkubator und montieren auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: A-20X oder 40X Klimaziel mit einer hohen NA ist am besten geeignet für 24-Well-Platten und ein 40X Öl-Objektiv ist für Kammer-Objektträgern empfohlen. Wachsen Zellen auf beiden Substrat für dieses assay.
2. Konzentrieren Sie sich auf Mittelebenen von Zellen, in denen Einschlüsse sind bei ihrer maximalen Durchmesser und liefern gestochen scharfe Kanten.
3. Erwerben Sie Bilder für viele Bereiche in jeder Vertiefung (mindestens 10 pro Loch); Brunnen stellen typischerweise Wiederholungen oder experimentelle Variablen.
4. Zählen Sie die Anzahl der Einschlüsse von Hand, mit dem Auge (Einschlüsse sind schwarz Fächer in GFP-HeLa-Zellen) oder verwenden Imaging-Software-Algorithmen, um automatisch zu identifizieren und zu zählen Einschlüsse.
   1. Finden GFP-HeLa-Zellen durch Fluoreszenzintensität (Befehl 'Objekte zu finden ") und stellen Fluoreszenzschwellenintensität basierend auf relativen Intensitäten der Zellen.
   2. Filter selektierten Objekte mit Größe Richtlinien halten diese nur größer als 5 & mgr; m ^2. Dies ist 'Bevölkerung 1'.
   3. Übernehmen "Löcher füllen in Objects 'Befehl mit" Bevölkerung 1' als Eingang. Dieser Schritt erzeugt "Bevölkerung 2 '.
   4. Subtract "Bevölkerung 1" von "population 2 'positiv geprägt Chlamydia Einschlüsse, bezeichnet als Ertrag "Bevölkerung 3'.
   5. Bewerben Größe Filter auf ('Filter Bevölkerung' Kommando) "Bevölkerung 3 ', zum Beispiel halten Objekte größer als 25 & mgr; m ² für Einschlüsse in Zellen, die für 24 Stunden oder mehr infiziert. Für Frühinfektion Zeiten, wie vor 18 Stunden, stellen Größe Filter auf Objekte größer als 4 & mgr; m ² zu halten, da diese Einschlüsse sind viel kleiner. Größe Filterergebnisse in einer Population von als "Einschlüsse" bezeichneten Objekte.
   6. Berechnen Sie quantitative Daten aus Bildern, zum Beispiel Einbeziehung Nummer, Aufnahme Größe und Einbindung Umfang, mit Imaging-Software.

Säugetierzellen, die cytosolische fluoreszierende Proteine ​​(zB GFP) kann konstruiert werden, um die Beleuchtung des Chlamydiaeinschlüssen einem lebenden, infizierten Zellkulturen zu ermöglichen. Nach Infektion mit Chlamydia, sind Einschlüsse leicht als schwarze Flecken in den Wirtszellen (Abbildung 1) sichtbar. Die Klarheit der fluoreszenz fehlt Einschlüsse für die automatisierte Identifikation der Einschlüsse in zahlreichen Bereichen und / oder den Behandlungen (Figur 1) ausgenutzt werden. Sobald fluoreszierende Wirtszellen erzeugt wurden, ist ein leistungsfähiges neues Workflow für die schnelle, quantitative Analyse von Chlamydien-Infektion Ebenen in experimentellen Proben aktiviert. Eine wichtige Anwendung ist die Bestimmung von Chlamydia Aufnahme bildenden Einheiten (IFU) in lebenden infizierten Zellen (Figur 2). Dieses experimentelle Strategie vermeidet die Notwendigkeit für Immunfluoreszenzverfahren, die routinemäßig auf dem Gebiet verwendet werden, die beide zeitaufwändig undkostspielig.

Ein weiteres Schlüsselmerkmal der beschriebenen Abbildungs ​​Ansatzes ist, dass sie leicht auf irgendwelche Chlamydia Spezies oder Stamm aufgebracht werden, und ferner können für die Ableitung von wichtigen biologischen Eigenschaften von Chlamydien Einschlüssen ausgenutzt werden. Als ein Beispiel kann eine Zeitverlaufsanalyse der GFP-HeLa-Zellen mit C infiziert trachomatis LGV Serovar L2, C. trachomatis Serovar D, C. muridarum und C. pneumoniae wurde bei 16, 24 und 48 hpi (Figur 3) durchgeführt. Für jede dieser Chlamydia Spezies und Stämme wurden Einschlüsse markiert und analysiert, um ihre mittlere Fläche zu berechnen, Umfangslänge, und die Anzahl pro Zelle bei angegebenen Zeiten (Abbildung 4). Diese Attribute liefern wichtige Informationen über die Biologie der Chlamydieneinschlüsse und darüber informieren, wie sie mit der Wirtszelle interagieren. Das beschriebene Verfahren stellt eine einfache Vorgehensweise für den Zugriff auf diese Informationen in einer Weise, dass su rpasses, was durch andere experimentelle Techniken erreicht werden. Eine abschließende Nützlichkeit des Umkehrmarkierungsstrategie ist für die Echtzeit-Bildgebung des Chlamydiaeinschlüssen in lebenden Zellen. Ein Beispiel hierfür ist in der Film 1 dargestellt ist.

Abbildung 1. Automatisierter Nachweis von C. trachomatis Einschlüssen. (A) GFP-HeLa-Zellen wurden mit (B) mKate2 exprimierenden C. infiziert trachomatis L2 und bei 24 hpi abgebildet. Eine Bildverarbeitungssoftware basierten Algorithmus wurde verwendet, um Chlamydieneinschlüsse automatisch zu identifizieren durch (c) Auswählen schwarze Löcher in GFP-HeLa-Zellen, in orange markiert. (D) ein zusammengesetztes Bild der infizierten Zellen von den Feldern A und B wird ebenfalls gezeigt. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. .jove.com / files / ftp_upload / 51.131 / 51131fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die Quantifizierung von Chlamydia Aufnahme bildenden Einheiten (IFU) in GFP-HeLa-Zellen. GFP-HeLa-Zellen wurden mit C infiziert trachomatis L2 an zwei verschiedenen Multiplizitäten der Infektion und bei 24 hpi abgebildet. Einschlüsse für 10 Felder pro Infektion nachgewiesen und gezählt unter Verwendung von automatisierten Software und die Ergebnisse sind angegeben (n = 3). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Zeitlicher Verlauf der C. trachomatis Serovar L2, C. trachomatis Serovar D, C. muridarum und C. pneumoniae-Infektion in GFP-HeLa-Zellen. GFP-HeLa-Zellen wurden mit C infiziert trachomatis LGV Serovar L2 und von Live-Fluoreszenzmikroskopie bei (A) 16 hpi, (B) 24 hpi, und (C) 48 hpi abgebildet. GFP-HeLa-Zellen mit C infiziert trachomatis Serovar D bei (D) 16 hpi, (E) 24 hpi und (F) 48 hpi abgebildet. GFP-HeLa-Zellen mit C infiziert muridarum wurden bei (G) 16 hpi (H) 24 hpi und (I) 48 hpi abgebildet. GFP-HeLa-Zellen mit C infiziert pneumoniaewurden bei (J) 16 hpi (K) 24 hpi und (L) 48 hpi abgebildet. Repräsentative Bilder werden für alle Infektionen und mal aufgerufen. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Repräsentative quantitative Daten aus Zeitverlauf Experimenten abgeleitet. Einschlüsse von GFP-HeLa-Zellen mit (A) C infiziert trachomatis LGV Serovar L2, (B) C. trachomatis Serovar D, (C) C. muridarum und (D) C. pneumoniae nachgewiesen wurden und bei 16, 24 aufgezählt, und 48 hpi (5 Felder pro Zeitintervall, n = 3). Physikalische Eigenschaften von chlamydial Einschlüsse für die Aufnahme-Oberfläche, Aufnahme Umfangslänge und die Anzahl der Einschlüsse pro Zelle quantitativ bestimmt. Fehlerbalken stellen den SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. Film 1. Zeitraffer-Video der mCherry-HeLa-Zellen mit GFP-C infiziert trachomatis L2, bei 48 hpi gemacht. Video wurde aus einer Reihe von Zeitraffer-Aufnahmen bei 5 min-Intervallen für 125 min entnommen zusammengestellt. Geschleift Video wechselt in mCherry-HeLa-Zellen (rot), C. trachomatis L2 (grün) und eine Zusammenführung der beiden Felder aus.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.