Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Abstract

Um die Zelloberflächen-Lokalisierung eines mutmaßlichen Transmembran-Rezeptor in kultivierten Neuronen demonstrieren, das Protein markiert man auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen primären Antikörper gegen einen extrazellulären Teil des Proteins erhöht. Da die Rezeptoren an und von der Oberfläche gehandelt, wenn Zellen werden permeabilisiert, dann nach der Fixierung sowohl der Zelloberfläche und interne Protein um denselben markierten sekundären Antikörper nachgewiesen werden. Hier passten wir eine Methode verwendet, um Proteintransport ("Antikörper Zeit") zu studieren, um Label-Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt und Protein, die entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde in dieser Zeit an die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war differentiell . Die Fähigkeit, diese beiden Pools von Protein unterscheiden durch den Einbau einer Übernachtblockierungsschritt mit hochkonzentrierten unmarkierten sekundären Antikörpers nach einer anfänglichen incubatio möglich wurden der permeabilisierten Neuronen mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper. Nach dem Blockierungsschritt, Permeabilisierung der Neuronen erlaubt Detektion des internalisierten Pool mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörpers mit einem anderen Fluorophor markiert. Mit dieser Technik konnten wir wichtige Informationen über die subzelluläre Lage dieses mutmaßlichen Rezeptor zu erhalten, offenbart, dass es in der Tat auf der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf einen Bereich von Zelltypen und Zelloberflächen-Proteine, die eine geeignete Antikörpers an ein extrazelluläres Epitop ist.

Introduction

Bei der Festlegung der Funktion der neu identifizierten Proteine, Untersuchung der subzellulären Lokalisation und Menschenhandel des Proteins in Frage wichtige Hinweise auf die wahrscheinliche Rolle / s des Proteins ^1,2 bieten. Bioinformatische Analyse des Transkriptoms der Entwicklungs Neocortex ³ hat uns mit einer Liste von Genen veränderte Expression während der Maushirn Kortikogenese zeigt. Dann nahm eine Gen-Knockout-Ansatz, um festzustellen, dass das Protein durch eines dieser Gene, sez6 codiert, hat eine Schlüsselrolle in der Neuronenentwicklung. Wir beobachteten, dass die Beschlagnahme-verwandtes Gen 6 oder Sez6, Protein ist in ....

Protocol

1. Dissoziierte Hippocampus Neuron Kultur

1. Bereiten Deckgläser (Borosilikatglas):
   1. In 100%-igem Ethanol waschen.
   2. Luft trocknen unter UV-Bestrahlung.
   3. Mantel mit Poly-D-Lysin (0,5 mg / ml in 0,15 M Borat-Puffer, über Nacht bei 4 ° C).
   4. Am nächsten Tag (Tag der Kultur) 3x waschen in PBS dann Mantel mit Laminin (2,5 ug / ml, Natur Maus Laminin) + 5% v / v hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) in PBS für 2 Stunden bei 37 ° C.
2. Präparieren Sie embryonalen Tag 18 (E18) Rattenhippokampi und sammeln in PBS Calcium und Magnesium, auf Eis gekühlt enthält. Hinweis: Alle Versuchsprotokolle mit Tieren wurden ....

Results

Die Zweifarben-Fluoreszenz Immunfärbetechnik präsentierten nützlich zur Markierung von extrazellulären Domänen von Transmembran-Proteinen in lebenden Zellen (in 1 schematisch gezeigt). Während der Inkubationszeit, die Immunglobuline binden zugängliche Epitope und ein Anteil der Bevölkerung von Proteinmolekülen zusammen mit gebundenem Antikörper wird durch Endozytose aufgenommen. Zusätzlich kann neu synthetisierten Proteins an die Zelloberfläche über Terminhandel zu erreichen und recycelt Proteinmoleküle.......

Discussion

Die hier beschriebene Technik ist komplementär zu der Biotinylierung der Zelloberfläche (durch Arancibia-Carcamo et al. Bewertung) ¹² und es ist die Methode der Wahl für die Bewahrung von Informationen über die subzelluläre Lokalisation des internalisierten Protein, sofern eine geeignete primäre Antikörper an ein extrazelluläres Epitop ist. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von Proteintransport / Internalisierung über die Zeit (durch Fixieren Deck zu verschiedenen Zeiten während der Inkubation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS mit Ca und Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasalmedium	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081
Papain-Dissoziationssystem	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Rinderserum Albumin	Sigma Aldrich Australien	A9418
Hank' s ausgewogene Salzlösung ohne Calcium, Magnesium, Phenolrot	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich Australien	P0899
Natürliches Mauslaminin	Invitrogen	23017-015	Vor der Aliquote auf Eis auftauen
Fötales Rinderserum HyClone	Thermo Fisher
Fluordeoxyuridin	Sigma Aldrich Australien	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australien	U3003
18 mm Rundglas Deckgläser	Menzel Glä ser	CB00180RA1
VECTASHIELD wässriges Eindeckmedium	Vector Laboratories	H1400
Donkey Anti-Kaninchen Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab Fragment Ziege Anti-Kaninchen 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - Griff im Abzug
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-konjugierter Esel Anti-Kaninchen 2° Antikörper	Invitrogen - Molekulare Sonden	A21206