Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Zusammenfassung

Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.

Zusammenfassung

Mikrotubuli-Depolymerisation Kraft zu liefern, um verschiedene Proteinkomplexe und Perlen-Protein-beschichteten in vitro zu transportieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind vermutlich eine wichtige Rolle bei der Mikrotubuli-abhängige Chromosomenbewegungen während der Zellteilung spielen, aber die entsprechenden Proteine ​​und ihre genauen Aufgaben sind schlecht definiert. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf an Assays, mit denen eine solche Beweglichkeit in vitro-Studie unter Verwendung von gereinigten Komponenten und definierten biochemischen Milieu entwickeln. Mikrotubuli sind jedoch inhärent instabil Polymere, ihre Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Die Protokolle beschreiben wir hier die Vorteile der segmentierten Mikrotubuli, die mit der Stabilisierung photoablatable Kappen hergestellt werden. Depolymerisation von solchen segmentierten Mikrotubuli mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung der Motilität Studien an den Mikrotubuli-Enden der Demontage. Diese Technik kann verwendet werden, um ca.RRY eine quantitative Analyse der Anzahl der Moleküle in der fluoreszenzmarkierte Proteinkomplexe, die mit dynamischen Mikrotubuli prozessiv Enden zu bewegen. Ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis in diesem und anderen quantitativen Fluoreszenz-Assays zu optimieren, sollte Deck behandelt, um unspezifische Absorption von löslichen fluoreszierend markierten Proteinen zu reduzieren. Detaillierte Protokolle vorgesehen sind, um der Unebenheit der Fluoreszenzbeleuchtung zu nehmen und zu bestimmen, die die Intensität eines einzelnen Fluorophors mit äquidistanten Gauß Form. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von segmentierten Mikrotubuli Mikrotubuli-abhängigen Bewegungen der Protein-beschichteten Mikroperlen zu untersuchen, die einen Einblick in die Fähigkeit der verschiedenen Motor-und nichtmotorisiertem Proteine ​​zu koppeln Mikrotubuli-Depolymerisation prozessive Fracht Bewegung.

Einleitung

Mikrotubuli sind hoch konserviert Strukturen des Zytoskeletts, die wichtig für die zelluläre Architektur, Zellbewegung, Zellteilung und intrazellulären Transport ¹ sind. Diese dynamischen Polymeren zusammen von Tubulin in Gegenwart von GTP und spontan zwischen Wachstum und Verkürzung ² wechseln. Mikrotubuli sind sehr dünn (nur 25 nm Durchmesser) daher besondere optische Techniken, um Kontrast verbessern sollte verwendet werden, um Mikrotubuli mit einem Lichtmikroskop zu beobachten. Frühere Arbeiten mit diesen Polymeren untersucht ihr dynamisches Verhalten mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) ^3. Diese und ähnliche Studien in vitro gezeigt, dass unter typischen experimentellen Bedingungen, die Mikrotubuli unterziehen Katastrophe und Schalter auf der Depolymerisation nur selten, einmal alle 5-15 Minuten (diese Frequenz für 7-15 mM bei 28 bis 32 ° C untersucht löslich Tubulin-Konzentration ) ^4. Verschiedene Techniken wurden so Induktions vorgeschlagene Depolymerisation von Mikrotubuli in einer kontrollierten Weise. Mikrotubuli Verkürzung kann durch Waschen entfernt lösliche ^5,6 Tubulin, Mikrotubuli Schneiden mit einem Laserstrahl ⁷ oder ⁸ unter Verwendung von segmentierten Mikrotubuli, wie hier beschrieben, ausgelöst werden. Frühere Arbeiten mit segmentierten Mikrotubuli sowie stochastisch Schalt Polymere, hat festgestellt, dass die kleinen intrazellulären Ladungen, wie Chromosomen, Vesikel und Perlen-Protein-beschichtet ist, kann an den Enden der Mikrotubuli Verkürzung ^9-13 bewegen. Dieses Phänomen wird gedacht, um eine direkte Auswirkungen auf Chromosom Bewegungen in mitotischen Zellen zu haben, und die zugrunde liegenden Mechanismen sind derzeit aktiv untersucht ^14-16.

Kürzlich, fluoreszenzbasierten Techniken, einschließlich der vollständigen internen Reflexion (TIRF) Mikroskopie, wurden eingesetzt, um die Motilität mit dynamischen Mikrotubuli untersuchen endet ^17-24. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungs zwischen Mikrotubuli und Mikrotubuli-bindende Proteine ​​in Echtzeit unter Verwendung von Proteinen mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind. Mehrere Protein-Komplexe wurden gefunden, um prozessiv mit Verlängerung und / oder Verkürzung der Mikrotubuli-Enden zu bewegen. Sie umfassen die Mikrotubuli-assoziierten Proteinen Dam1 ^10,12,18, SKA1 ¹⁹ und ²⁰ XMAP215 sowie Kinesin-Motoren Kif18A ^21,22, MCAK ²³ und CENP-E ^24. Diese Proteine ​​zeigen prozessive tip-Tracking, die sich grundlegend von der der klassischen Spitze-Tracking-Proteine ​​wie EB1 ²⁵ ist. Obwohl EB1-Moleküle und die assoziierten Partner erscheinen stabil mit dynamischen Mikrotubuli-Enden, die einzelnen Moleküle bleiben an der Spitze der Mikrotubuli für nur ~ 0,8 s gebunden ist, schnell den Austausch mit dem löslichen Pool ²⁶ zugeordnet bleiben. Im Gegensatz dazu prozessive Spitze-trackers, wie Dam1, reisen mit Mikrotubuli-Enden für viele Mikrometer und ihre Assoziation mit Mikrotubuli-Tipps können für m dauernkeine Sekunden. Die Spitze Assoziation Zeit sowie die resultierende Geschwindigkeit der Verfolgung, hängt stark von der Anzahl der Moleküle, die die Spitze-Tracking-Komplex ²⁷ zu bilden. Größere Protein-Ensembles sind in der Regel viel besser Spitze-trackers. Zum Beispiel können solche komplexen Baugruppen der isolierten Hefe Kinetochore Mikrotubuli gekoppelt bleiben Enden für ²⁸ Stunden. Einige Mikrotubuli-bindende Proteine, wie zB Ndc80 Kinetochorenprotein Komplex gefunden werden nicht mit Mikrotubuli Bahnenden an einer Einzelmolekülebene, noch Ndc80 ist sehr effizient bei der Kopplung der Bewegung der Wulst Ladung ^19,29-31. So, um den Mechanismus der Spitze-Tracking von verschiedenen Protein-Komplexe, sowie deren biologische Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Spitze-Tracking in Abhängigkeit von der Anzahl der Moleküle in der Spitze-Tracking-Komplex zu untersuchen, sowie um zu bestimmen, die Fähigkeit dieser Komplexe Tarif Motilität auf der Oberfläche der Perle Ladung aufweisen.

Im Folgenden geben wir ausführliche Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli (1A) vorzubereiten und durchzuführen Experimenten. Zunächst werden die im Handel erhältlichen Glasobjektträger modifiziert, um kurze Polyethylenschlauch (Protokoll 1) befestigen. Die wiederverwendbare Mikroskopie Flusskammer wird dann aus wie eine Folie die chemisch oder Plasma-gereinigt und silanisierten Deckglas (Protokoll 2) ^32-34 montiert und. Die daraus resultierende Raumvolumen ist nur 20-25 ul (oder so klein wie 15 ul, siehe Anmerkung 3 in Protokoll Nr. 1), einschließlich des Volumens der Einlassschlauch. Kommerziell erhältlich Strömungskammern können auch verwendet werden, aber ihr Volumen ist in der Regel größer, was zu einer unnötigen Verschwendung von Proteinen. Wenn eine größere Kammer verwendet wird, sollte das Volumen aller Lösungen in folgenden Protokolle proportional skaliert werden. Mikrotubuli Samen werden dann mit langsam hydrolysierbaren GTP-Analog, GMPCPP (Guanosin-5'-[(α, β)-methyleno] Triphosphat) (Protokoll 3 hergestellt, zum Beispiel, siehe auch Hyman et al. ^35). Die Samen werden auf einem gereinigten Deck immobilisiert und die Oberfläche wird anschließend blockiert, um die unspezifische Absorption von anderen Proteinen verhindern, ³² (Protokoll 4 beschreibt Samen Immobilisierung mit Digoxigenin). Die segmentierten Mikrotubuli können dann mit Protokoll Nr. 5 hergestellt werden. Der Hauptgrund für diesen Ansatz ist, dass dynamische Mikrotubuli-Polymere, die in Gegenwart von GTP zu bilden, kann vorübergehend durch Addieren der kurzen "Kappen" von stabilen Tubulin-Segmente, die GMPCPP enthalten stabilisiert werden. Diese Kappen enthalten Rhodamin-markierten Tubulin, so können sie einfach mit einem 530-550 nm-Laser-oder Quecksilberbogenlampe (Protokoll Nr. 6) ³⁶ Beleuchten des Sichtfeldes entfernt werden. Die Fluoreszenzintensität der Spitze-Tracking-Signal kann dann verwendet werden, um die Anzahl der Moleküle, die mit der Demontage der Mikrotubuli-Enden reisen zu schätzen, unter Berücksichtigung der Unebenheiten des Mikroskops Feldbeleuchtung (Protokoll 7) werden. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden,Wechselwirkungen zwischen Depolymerisation von Mikrotubuli und Perlen-Protein-beschichteten, hergestellt wie in ²⁷ (Protokoll 8) beschrieben zu studieren. Einige Proteine ​​werden leicht an den Wänden des segmentierten Mikrotubuli binden, aber Laserpinzette können auch verwendet werden, um den Wulst in der Nähe der Mikrotubuli Wand halten, wodurch die Förderung ihrer verbindlich.

Protokoll

Benötigte Ausrüstung: Die unten beschriebenen Experimente erfordern einen Lichtmikroskop für DIC und Fluoreszenz-Bildgebung (Tabelle 1) ausgestattet. Hellfeld LED-Beleuchtung kann verwendet werden, um den Nachweis der Deckglas-Attached Mikrotubuli ³⁷ Samen, die nur schwer mit einer normalen Halogenlampe zu beobachten sind deutlich zu verbessern. Um den Flüssigkeitsstrom in der Mikroskopie Kammern zu steuern, sollten die Lösungen mit einer Schlauchpumpe in der Lage, Strömungsgeschwindigkeiten 10-100 ul / min ausgetauscht. Eine Spritzenpumpe kann auch verwendet werden, jedoch sollte darauf geachtet werden, um Luftblasen, die sich bilden können, wenn die Strömungsgeschwindigkeit schlagartig verändert vermeiden. Für den Umgang mit Perlen-Protein-beschichtet, zum Beispiel, um sie in der Nähe des segmentierten Mikrotubuli Wand zu bringen, kann ein 1064 nm Dauerstrich-Laserstrahls in das Mikroskop optischen Achse eingeführt werden und konzentriert sich mit hoher numerischer Apertur Objektiv (1.3 oder höher) zur Herstellung einer Falle. Für die quantitative Analyse der FluoreszenzIntensität einzelner Moleküle das Anregungslicht von einem Laser sollte Basis Quelle, da die Intensität dieser Lichtquelle vorgesehen sein, ist stabiler als das von einer Quecksilberlampe erzeugt. Mechanische Schwingungen zu minimieren, sollte das Mikroskop auf einem optischen Tisch gestellt werden. Weitere anspruchsvolle Ausrüstung erforderlich ist, um die Bewegung der Kugeln mit der Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden unter einer konstanten Kraft zu studieren, und die Single-Shot-Kraftsignale ^11,38,39 messen, werden diese Methoden an anderer Stelle beschrieben werden.

1. Wiederverwendbare Fertigungsflusskammern

Glasobjektträger für wiederverwendbare Strömungskammern können von einer lokalen Glasproduktionsanlage mit Schaltplänen in 1B bestellt werden (siehe Tabelle 2 für Details zu unseren Lieferanten). Mit Ultraschall-Fräsen ändern regelmäßigen Objektträger (75 mm x 25 mm, 1,0 mm dick) zwei Nuten 15 ± 1 mm lange zu machen, 1,0 ± 0,1 mm breit und 0,8 ± 0,05 mm tief.Abstand zwischen den nächstliegenden Enden sollte 14 ± 1 mm, dieser Abstand ist optimal für eine Kammer mit 22 mm x 22 mm Deckglas montiert. Siehe Tabelle 2 für eine Liste von anderen Materialien.

1. Platzieren einer 100 mm langen Polyethylenschlauch (OD 0,61 mm, Tabelle 2) in jeder Nut in dem Schieber, so ~ 5 mm Überhänge an den inneren Enden der Nuten. Befestigen Sie die Rohre innerhalb der Nuten mit Sekundenkleber, die Rohre vollständig innerhalb der Rillen Einbettung.
2. Füllen Sie die Rillen mit Epoxy-Kleber, unter Vermeidung von Verschütten der Leim in den Rohren. Lassen Sie den Kleber trocknen für ca. 1 Tag.
3. Mit einer scharfen Rasierklinge schneiden die erstarrte Masse Kleber 3-4 mm vom distalen Ende jeder Befestigungsstelle, das Entfernen der Teile proximal der Mitte der Folie. Die Rohre sollten in ihren Nuten bleiben. Das Entfernen der proximalen Teile werden auch geschnitten und entfernen Sie die inneren Überhänge, wodurch eine ebene Fläche mit zwei Rohröffnungen.
4. Füllen Sie eine Spritze mit Wasser und Testob die Rohre richtig arbeiten. Wenn die Flüssigkeit frei, einen Tropfen Epoxid-Kleber (~ 5 mm im Durchmesser) an den äußeren Enden der Hainen, trocken für 1 Tag (1D). Dies wird Kammern mehr haltbar, so dass sie immer wieder für viele Monate verwendet werden.
   Note 1: eine Kammer für ein inverses Mikroskop zu machen, sollten die Folien zusätzlich modifiziert werden, um zwei kleine Löcher an den entgegengesetzten Enden der Nuten (1C) bilden. Stecken Sie die Rohre durch die Löcher in der Folie, biegen Sie die Rohre und passen Sie sie fest in den Nuten (1E). Befolgen Sie die Schritte 1.2-1.4, aber entfernen Sie die Epoxid-Kleber von der gesamten Oberfläche, die verwendet werden, um eine Strömungskammer machen wird.
   Hinweis 2: Um Kammervolumen zu reduzieren, verwenden Fräsen, zwei Vertiefungen 0,050 ± 0,005 mm tief zu machen, so dass der zentrale Teil des Schlittens 5,0 ± 0,5 mm breit und leicht erhöht (siehe "geätzten Bereiche" auf 1B und 1C). Wenn ter Flusskammer montiert ist (wie unten beschrieben), legen Sie das doppelseitige Klebeband in diesen Vertiefungen.
   Hinweis 3: Um diese modifizierten Folien wiederverwenden, nach Beendigung der Experimente entfernen Sie das Deckglas und doppelseitiges Klebeband mit einer Rasierklinge. Entfernen des Dichtungsmittels durch Abziehen und durch Abwischen der Objektträger mit 70% Ethanol. Legen Sie die Folie in einem Behälter mit 1-2% der Laborgeschirrspülmittel, befestigen Schlauch mit einer Schlauchpumpe und perfuse 50-70 ml, folgen mit dem gleichen Volumen VE-Wasser, trocknen und lagern in einem staubfreien Fach.

2. Vorbereitung der Deckgläser

Dieses Protokoll dauert 6-8 Stunden und wird dazu beitragen, 12 Deckgläser vorbereiten. Sie werden eine keramische Deckhalter und drei Deckfärbung Gläser mit Deckel müssen; jar Volumen sollte 15 ml, so wird jeder 4 Deckgläser gestapelt zusammen zu halten. Ein Glas mit einem Deckel (250 ml) zu verwenden, um Deckgläser mit Silan inkubiert werden. Verwenden Sie reguläre No.1 Deckgläser (22 mm x 22 mm oder 22 mm x 30 mm, siehe Tabelle 2 und 3 für eine Liste der Materialien). Alle Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden, auch mit Handschuhen.

1. Setzen Sie die Deckgläser in die Glasdeckfärbung Gläser und füllen die Gläser mit Aceton. Inkubation für 1 h, waschen 10x mit VE-Wasser.
2. Inkubieren Sie die Deckgläser 10 min mit Ethanol und waschen wieder 10x mit VE-Wasser.
3. Vorbereiten "Piranha"-Lösung. Setz 60 ml Wasserstoffperoxidlösung (30% in Wasser) in einem wärmebeständigen Glasbehälter und langsam mit 100 ml Schwefelsäure (endgültige Verhältnis von Säure zu Wasserstoffperoxid-Lösung ist 5,3). Lösung erwärmt sich, das ist normal, aber seien Sie vorsichtig. Piranha-Lösung ist stark ätzend! Verwenden Sie dicke Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille!
4. Füllen Sie die Deckfärbung Gläser mit "Piranha"-Lösung, schließen Sie den Deckel und legen Sie die Gläser in einem Wasserbad auf 90 ° C für 1 Stunde vorgeheizt.
5. Gießen Sie die "Piranhas" Löauf und entsorgen wie von den Sicherheitsbestimmungen am Arbeitsplatz angewiesen. Wash Deckgläser 10x mit VE-Wasser.
6. Füllen Sie die Deck Küvetten mit 0,1 M KOH, Inkubation 10 min, 10x und waschen mit entsalztem Wasser. Dadurch werden alle Säurereste nach "Piranha"-Behandlung nach links auf den Deckgläsern zu neutralisieren.
7. Trockendeckgläser eine zu einem Zeitpunkt, indem jedes Deckglas mit Teflon beschichtet flachen Kanten Pinzette (um Schäden an einer Glasoberfläche zu minimieren) und beim Einblasen von Druck trockenem Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass Deck vollständig getrocknet, da Silan-Lösung wird mit Wasser hochreaktiv.
8. Stapeln Sie die getrockneten Deckgläser in Keramikhalter (12 Deckgläser pro Halter), die gründlich mit Stickstoff vorgetrocknet werden soll. Halten Sie die Keramikhalter abgedeckt, um Staub von Festhalten an der Deckfläche zu vermeiden.
9. Bedecken Sie den Boden von 250 ml Glas (6 cm Durchmesser) mit Molekularsiebe, Grad 564, für die Wasseraufnahme.
10. Füllen Sie das Glas mit 200 mlPlusOne Wehre Silan-Lösung und langsam tauchen ein Keramikträger mit Deckgläsern in einem Glas, den Deckel schließen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. Dies wird hydrophobe Beschichtung auf dem Deckglas Oberfläche.
11. Entfernen Sie langsam den Halter mit Deckgläsern aus dem Glas-und Transferdeckgläser eine zu einem Zeitpunkt in die Deck Küvetten mit Methanol gefüllt.
12. Platzieren eines Metall-oder Glassockel in das Wasserreservoir eines Ultraschallbad, so dass die Deck Küvette wird 2/3 seiner Höhe eintaucht. Ultraschallbehandlung bei 70 W für 20 min, Umkleide Methanol-Lösung alle 5 Minuten, dann spülen 10x mit VE-Wasser. Wenn die Silanisierung richtig funktioniert, werden die Deckgläser trocken erscheinen, wenn aus dem Wasser entfernt.
13. Restwasser mit Stickstoff gründlich entfernen, wie oben.
14. Zwischenlage die Deckgläser mit den Kimwipes Oberfläche-Oberfläche-Kontakt zwischen den Deck vermeiden. Deckgläser in einem abgedichteten Behälter für mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
    NAnmerkung 1: Die Schritte 2.1-2.6 kann durch die Reinigung der Deckgläser mit Plasma-Reiniger für 15 min bei 30 W, die gesamte Vorbereitungszeit stark reduziert ersetzt werden. Druck in der Reinigungskammer wird bei 100-200 Torr eingestellt. Sowohl atmosphärische und komprimierten Sauerstoff verwendet werden. Stapeln Sie die Plasma gereinigte Deckgläser in Keramikhalter und gehen Sie zu Schritt 2.7.

3. Vorbereitung der GMPCPP-stabilisierten Mikrotubuli Seeds

Dieser Vorgang dauert ca. 1 Stunde und die daraus resultierenden Mikrotubuli-Samen sind für 1-2 Tage bei Raumtemperatur stabil. Siehe Tabelle 4 für eine Liste von Reagenzien.

1. Mix auf Eis:
   • 10 ul unmarkiert Tubulin (100 uM, Tabelle 4) in BRB-80-Puffer (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl _2, pH 6,9 mit KOH; Ergänzung mit 1-2 mM DTT mit frischen Aliquot für jedes Experiment).
   • 2,6 &mgr; l Digoxigenin-markierten Tubulin (Tabelle 4). Stellen Sie die Lautstärke je nach Vorbereitung,so daß das endgültige Verhältnis von unmarkierten zu markierten Tubulin ist ~ 1:10 liegt. Gut mischen durch Pipettieren.
   • 1,4 &mgr; l 10 mM GMPCPP (Endkonzentration 1 mM)
2. Inkubieren 15 min bei 35 ° C werden die Keime wachsen 2-3 um lang. Stellen Sie Zeit, wenn verschiedene Mikrotubuli Länge gewünscht ist.
3. In 35 ul BRB-80 (bis 35 ° C vorgewärmt), mischen durch Pipettieren und Zentrifuge für 15 min bei 25.000 xg, um die Samen bei Raumtemperatur pelletieren.
4. Überstand verwerfen, waschen Sie die Pellet durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von 50 ul warmen BRB-80.
5. Resuspendieren und Pellet in 25 ul BRB-80.

4. Die Befestigung der Mikrotubuli Seeds zu den Deckgläser

Protokolle 4 und 5 benötigen 2-3 Stunden, so dass zwei Strömungskammern pro Tag eingesetzt.

1. Montieren Flusskammer gemäß den Anweisungen des Herstellers mit silanisierten Deckgläser und gehen Sie zu Schritt 4.2. Wenn Sie maßgeschneiderte Deckgläser (Protokoll 1), folgen Sie den Schritten below.
   1. Bringen Sie zwei Stücke von doppelseitigen Klebeband (5 mm x 30 mm) auf der Mittel ~ 5 mm an, legte silanisierten Deckglas oben auf der Kassette drücken fest.
   2. Füllen Sie die Kammer mit BRB-80 durch eine der Röhren und stecken beide Röhrchen mit Rund Zahnstocher.
   3. Drücken Sie einen kleinen Tropfen zweifarbige Kwik Gussdichtstoff auf einem kleinen Kunststoffpetrischale, und schnell, aber gründlich mischen mit einem Zahnstocher. Das Dichtmittel wird grün, gelten sofort, sorgfältig Abdichten aller Kanten des Deckglases. Wenn das Dichtmittel dringt zu tief unter dem Deckglas, öffnen Sie eine der Röhren durch Entfernen der Zahnstocher-Stecker und sanften Druck auf Dichtmittel aus undichten im Inneren der Rohre zu verhindern.
   4. Lassen Sie die Trockenkammer für 10 min und bestätigen, dass die Strömung nicht, bevor Sie fortfahren beschränkt.
2. Zeigen die Kammer auf einem Mikroskoptisch 32 ° C vorgewärmt und bringen eines der Rohre mit einer Pumpe, welche die Flüssigkeit zu pumpen heraus. Die Länge der Einlassröhresollte minimiert werden, um den unnötigen Verlust von Reagenzien zu vermeiden: Die empfohlene Länge beträgt 5-7 cm. Tauchen dieses Ende in einer 0,5 ml mit BRB-80-Puffer Fläschchen. Diese und alle folgenden Lösungen sollte auf 32-35 ° C vorgewärmt werden
3. Tragen Sie einen sanften Druck mit einer Pumpe oder heben Sie einfach das Ende des Auslaufrohrs den Squeeze-out die Luftblasen, die gelegentlich bilden können, wenn das Einlassrohr abgezogenem Stecker.
4. Stellen Sie die Pumprate bei 100 ml / min. Mit 2 Kammervolumina von Anti-Digoxigenin-Antikörper verdünnt 1:30 BRB-80 Waschen, Inkubation 15 min auf Antikörper-Adsorption zu ermöglichen.
5. Mit 5-10 Kammervolumina von warmem BRB-80 Waschen, Inkubation 10 min mit 1% Pluronic F-127 in BRB-80, um die hydrophobe Oberfläche des silanisierten Deck blockieren.
6. Mit 5-10 Kammervolumen der Motilität Puffer (BRB-80 mit 0,4 mg / ml Casein ergänzt) waschen.
7. Reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 10 ml / min und perfuse Mikrotubuli Samen verdünnt 1:200-1:600 ​​in 30-40 ul Motilität Puffer. Inkubation 15 kmn die Förderung der Bindung der Samen auf die Deckglas-Antikörper adsorbiert.
8. Waschen Sie die Kammer bei 100 ml / min mit 400 ul der Motilität Puffer um ungebundenes Material zu entfernen.
   Hinweis 1: Die resultierende Dichte von 10-30 Samen sollten je Mikroskopfeld (2A) sein. Zu beheben, verwenden Sie fluoreszierend markierten Tubulin während der Polymerisation (Schritt 3.1) zur leichteren Erkennung der Deckglas-Attached-Samen.
   Anmerkung 2: Axonemes von Chlamydomonas ⁴⁰ oder anderen biologischen Quellen, sowie die Häutchen von lysierten und deciliated Tetrahymena-Zellen ⁴¹ hergestellt werden, können auch als Mikrotubuli Keimbildner verwendet werden. Diese sind nützlich für die Erstellung Nucleatoren kleine Mikrotubuli-Arrays und werden bevorzugt, wenn die Mikrotubuli mit bestimmten Anzahl von Protofilamenten sind erwünscht (GMPCPP Samen Keime ein Mikrotubuli, die ≥ 14 Protofilamenten ⁴² enthält). Diese Strukturen können auf die gereinigten Deckgläser durch unspezifische Absorption angebracht werden, aber der Atta-chment gewöhnlich weniger stabil, verglichen mit Antikörper-basierte Befestigung, insbesondere bei der Verwendung von silanisierten Deck.

5. Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli

Alle Lösungsvolumina beziehen sich auf Kammervolumen 15-20 ul; proportional zu erhöhen, wenn größere Kammer verwendet.

1. Vorwärmen unmarkierten Tubulin-Mischung für 30 Sekunden (45 &mgr; l Motilität Puffer mit 1 mM Mg-GTP und mit 10-15 &mgr; M unmarkiertem Tubulin ergänzt) bei 35 ° C. Perfundieren bei 30 ml / min.
2. Überwachen Mikrotubuli Wachstum mit DIC Optik (2B, Video 1). Während 5-7 min Inkubation die Mikrotubuli wachsen normalerweise ~ 10 um lang.
3. Vorbereitung Rhodamin-Tubulin-Mischung (65 ul Puffer Motilität mit 0,5 mM GMPCPP und 2-5 &mgr; M Rhodamin-markierten Tubulin mit 0,5-1 Mol-Verhältnis von Rhodamin an Tubulin ergänzt) und erwärmen die Lösung bei 35 ° C für 30 sek.
4. Perfundieren sofort bei 30 μl / min. Inkubation für 8-10 min, um die Bildung von stabilen Leuchtstoffkappen an den Mikrotubuli-Tipps zu fördern. Stabile Mikrotubuli-Segmente werden auch spontan Keime und wird mit DIC-Optik sichtbar.
5. Die Kammer gut waschen mit 100 ul Motilität Puffer bei 20 ml / min auf Tubuline und Nukleotide, sowie lösliche Mikrotubuli-Fragmente zu entfernen.
6. Mit DIC, bestätigen, dass die Mikrotubuli sichtbar (Abbildung 2D) sind, deren Zahl jedoch abnehmen sollte, weil viele Mikrotubuli während der Abdeckung demontieren (Video 2 zeigt ein typisches Feld mit segmentierten Mikrotubuli).
   Anmerkung 1: Segmentierte Mikrotubuli sind sehr stabil und für mindestens 2 Stunden verwendet werden. Die Lebensdauer dieser Mikrotubuli nimmt jedoch mit übermäßigen Lösungsaustausch oder wenn 2-Mercaptoethanol wird in der Bildpuffer verwendet.

6. Experimentelle Beobachtung der Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli Ends

1. IntrodUCE 30-50 ul fluoreszierendes Protein (0,1-20 nM) in die Kammer mit 10 &mgr; l / min. Wenn Protein Festhalten an dem Deckglas ist offensichtlich, ergänzen die Motilität Puffer mit 8.4 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-Tracking erfordert zusätzlich 10 mM DTT oder 0,5-1% &bgr; ME ^10.
2. Begrenzen Sie die Beleuchtungsfeld mit Hilfe eines Mikroskops Feldblende, die unnötige Bleich-und Demontage der Mikrotubuli zu vermeiden.
3. Video starten Erfassung mit GFP-Filterwürfel, dann auf Rhodamin-Filterwürfel wechseln, ohne Unterbrechung der Bildaufnahme. Die roten Segmente an den Mikrotubuli-Enden sollte klar ersichtlich sein, sie beginnen zu verblassen und zerfallen schnell (Video 3).
4. Weiter zu beleuchten, bis die Kappen fast verschwinden (in der Regel für 10 bis 20 Sekunden, aber dieses Mal wird mehr für die mit einem niedrigeren Rhodamin Markierungsverhältnis gewachsen Kappen), und wechseln Sie zurück zu dem GFP-Protein Kanal aufzeichnen Tracking mit Mikrotubuli-Demontage.
5. Analysieren Sie dieresultierenden Sequenzen durch den Bau Kymographen, dh zweidimensionale Bilder, die Fluoreszenzintensität entlang der Mikrotubuli-Achse zeigen, zu verschiedenen Zeiten während Beobachtung) mit MetaMorph, frei verfügbare ImageJ oder andere Bildbearbeitungssoftware (2E).
   Anmerkung 1: Erfassungsrate sollte in Abhängigkeit von der Zeitsteuerung der beobachteten Ereignisse angepasst werden. Die empfohlene Rate beträgt 2-3 Frames pro Sekunde (fps) für den langsamen, Ring-Größe ^27, aber Dam1 Komplexe Aufnahmezeit für einzelne Moleküle sollte> 20 fps ¹⁹ sein.
   Hinweis 2: Ein hochempfindliches EMCCD, z. B. ANDOR iXon3 wird für die schnelle Aufnahme von tip-Tracking-Veranstaltungen mit Depolymerisation von Mikrotubuli benötigt. Die empfohlenen Einstellungen für Andor iXon3 Kamera sind: Gewinn 5x, EM, erhalten 200, 1 MHz Auslesegeschwindigkeit, 16-Bit-Sensor-Modus, 80 ms Belichtungszeit.
   Hinweis 3: Verwenden TIRF Mikroskopie Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern, jedoch kürzer Mikrotubuli sollte verwendet werden, wie that die fluoreszierenden stabilisierende Kappen bleiben innerhalb der Reichweite des evaneszenten Feld.

7. Quantitative Analyse der Molekülgröße von Mikrotubuli Tip-Tracking-Komplexe

Der Grund für diesen Ansatz besteht darin, die Anzahl der Moleküle in einer Spitze-Tracking-Komplex durch Finden des Verhältnisses der Gesamtfluoreszenzintensität des Spitzenverfolgungskomplex mit der Intensität eines einzelnen Fluorophors zu bestimmen. Dieser Ansatz kann auf GFP-Fusionsproteine ​​und Proteine ​​mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert angewandt werden, sondern es kann die Anzahl der Moleküle in der Spitze-Tracking-Komplexen unterschätzen, wenn einige Proteinmoleküle in den Zubereitungen sind nicht fluoreszierend.

1. Rekordphotobleaching Kinetik für die fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle.
   1. Zubauen regelmäßigen Mikroskopie Kammer unter Verwendung einer nicht-modifizierten Glas-Objektträger, zwei Streifen von doppelseitigem Klebeband und ein sauberes Deckglas, das unter Verwendung des gesamten Protokolls 2 hergestellt werden kann, oder nur die Schritte 2,1-2,6 dieserProtokoll.
   2. Etwa 50 nM Protein in Puffer Motilität, kurz waschen mit Puffer Motilität und Abdichtung der Kammer mit VALAP (Tabelle 4). Optimieren Proteinkonzentration auf das Feld mit gleichmäßig verteilt Spots (3A), was einzelne Moleküle und ihre kleine Aggregate (Trimere und Tetramere, die sich spontan in der Lösung bilden oder kann erscheinen, wenn mehrere Einzelmoleküle sind eng zusammen und kann nicht aufgelöst werden kann) erhalten . Dieser Schritt ist für den Erhalt einer Mehrspitzenverteilung des Photobleichschritte und genaue Bestimmung einer Schrittweite (siehe unten) sehr wichtig.
   3. Minimieren Sie die Beleuchtung Laserintensität, bei der die einzelnen fluoreszierenden Flecken sind noch sichtbar, mit geringerer Beleuchtung die Photobleaching Zeit verlängert, kann so länger Photobleaching Spuren erhalten werden. Auch die Belichtungszeit zu minimieren, um die Wahrscheinlichkeit von mehr als einem Fluorophor Bleich während eines Rahmens zu verringern. Die empfohlene EinstellungAndor iXon3 Kamera: Gewinn 5.0x, gewinnen EM 999, 10 MHz Auslesegeschwindigkeit, 50-100 ms Belichtungszeit.
   4. Konzentrieren Sie sich auf der Oberfläche des Deckglases, schließen Sie die Beleuchtung Verschluss, zu bewegen, um eine frische Feld, öffnen Sie die Beleuchtung Verschluss und Bilder zu erwerben, bis alle Komplexe gebleicht (danach als img (x, y) bezeichnet).
2. Korrigieren der erfassten Bilder für Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung (Fig. 3B).
   1. Bereiten Lösung nach Fluorophor, z. B. 1 &mgr; M Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) in BRB-80. Eine solche Lösung kann vorher hergestellt, aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden
   2. Bauen Sie eine Kammer, wie in Abschnitt 7.1.1, aber mit einem regulären Deckglas. In Fluorophorlösung und Abdichtung der Kammer mit VALAP.
   3. Sammeln> 50 Bilder der gesamten Mikroskopfeld: bewegen die Bühne, um ein neues ungebleichten Bereich, während die Beleuchtung Shutter geschlossen ist, und sofort nach dem Öffnen des Verschlusses die Bilder zu erwerben.
   4. (3C). Das resultierende Bild zeigt die Verteilung der Beleuchtungsintensität des Feldes (Illum (x, y), wobei x und y-Koordinaten des Pixels entsprechen).
   5. Bestimmen Sie die maximale Helligkeit der Pixel dieses Bildes (Max (Illum)).
   6. Mit der geschlossenen Jalousie und Beleuchtung mit gleichen Kameraeinstellungen, wie in Abschnitt 7.2.3 ein Bild erwerben, bestimmen die durchschnittliche Pixelintensität dieses Bildes; dieser Wert auf CN, Kamerarauschen entspricht.
   7. Mit den obigen Werten und Bild (Illum (x, y)) zu normalisieren, das experimentelle Bild (img (x, y)) unter Verwendung des folgenden Ausdrucks:
      
      Verwenden Sie das resultierende Bild img ^Norm (x, y) für die quantitative Analyse der brightness der stationären fluoreszierende Komplexe, aber auch, um die Bilder mit tip-Heften Komplexe (3D) zu normalisieren.
3. Bestimmen Intensität eines einzelnen Fluorophors.
   1. Mit normalisierten Bilder img ^Norm (x, y) und einem Bildverarbeitungs-Software wählen Sie eine Leuchtstoff Ort mit einem kreisförmigen Bereich (5-6 Pixel im Durchmesser) und bestimmen seine integrale Intensität für alle Frames, die Erzeugung der Photobleaching Spuren. Vermeiden Sie sehr helle Punkte (> 5-mal heller als die Dimmer sind).
   2. Mit der gleichen kreisförmigen Bereich Werkzeug, wählen Sie mindestens 3 Spot-freie Zonen, erzeugen die entsprechenden Photobleaching Spuren, mittlere und fit mit exponentiellen Abfall-Funktion.
   3. Tabellarisieren diesem Hintergrund Intensitätskurve, um die experimentellen Zeitpunkten entsprechen und subtrahieren sie von den Photobleaching Kurven.
   4. Glätten Sie die Kurven Photobleaching (Durchschnitt mit der Schiebefenster von 3-5 Punkte). Sichtprüfung der resultierenden Kurven undverwerfen jede Kurve, die einen abrupten Anstieg in der Fluoreszenz oder Fehlen offensichtlicher Bleichen (3E) zeigt.
   5. Für jeden der verbleibenden Kurven (in der Regel 50-70% der Gesamtzahl der Kurven), visuell gewünschte endgültige Plateau, wenn die Fluoreszenzfleck hat gebleicht. Kürzen dieses Segment nur ~ 100 Punkten verlassen und diese durchschnittlich Intensitäten. Subtrahieren Sie diesen Wert aus die verkürzte Photobleaching Kurve, um kleine Schwankungen zu minimieren, ist die Hintergrundwerte und die Größe des Hintergrundspitze (unten) zu reduzieren.
   6. Plotten eines Histogramms der Intensitäten für alle Zeitpunkte von 20 oder mehr Photobleichen Kurven (> 1.000 Zeitpunkte). Das Histogramm sollte mindestens 4 verschiedene Peaks (siehe Anm. 2) zu zeigen.
   7. Setzen Sie das Histogramm mit äquidistanten Gauß-Verteilung mit ^10,43 MATLAB, Mathematica oder ähnliche Software (3F):
      
      whier ein _i und σ _i, d und N sind Anpassungsparameter. Parameter A _i und σ _i entsprechen Amplitude und Breite des i-ten Peaks und d ist der Abstand zwischen den Spitzen ist, N ganze Zahl, die der Gesamtzahl der Spitzen in der Verteilung entspricht. Wenn Zentren der ersten 3 oder mehr Peaks zeigen eine gute Übereinstimmung mit visuell der angepassten Linie, der Abstand zwischen diesen Peaks (Parameter-d) entspricht einem Fluoreszenzintensität eines einzelnen Fluorophors.
      Hinweis 1: Anzahl der untersuchten Punkte (Abschnitt 7.3.6) sollte erhöht werden, wenn das Mikroskopiesystem weist erhebliche Vibrationen oder gibt es eine weitere Lärmquelle (z. B. instabile Laserstrahl).
      Hinweis 2: Es ist wichtig, zu erhalten> 3 Spitzen für die genaue Analyse mit äquidistanten Gauß-Passform. Wenn weniger Spitzen erhalten werden, die falsche (zB Doppel) Schrittgröße erhalten werden konntewenn die Beleuchtungsverhältnisse nicht optimal sind, sind z. B. wenn die Punkte bleichen zu schnell und einzelnen Schritte nicht gut gelöst.
4. Bestimmen Sie die Molekülgröße des tip-Tracking-Komplex.
   1. Verwenden Sie Bilder mit Protokoll Nr. 6 gesammelt und wählen Sie die ersten 2-4 Frames, die unmittelbar nach dem Öffnen des Verschlusses erworben wurden. Wenn das Feld für einige Zeit beleuchtet, bevor die Spitze-Tracking beobachtet wurde, eine Schätzung der ursprünglichen Intensität von der Kinetik der Photobleichung unter den gleichen Versuchsbedingungen.
   2. Durchschnittlich die ausgewählten Bilder und normalisieren das resultierende Bild wie in den Abschnitten 7.2.5-7.2.7.
   3. Messen integrale Intensität der Fluoreszenzspitze Verfolgungskomplex mit dem gleichen Bereichsgröße, wie in Abschnitt 7.3.1.
   4. Messen integrale Intensität von 3 Hintergrundflächen in der Nähe der Spitze-Tracking-Anlage und mit der gleichen Region, ist der Mittelwert dieser Werte und subtrahieren von der Intensität der tip-Tracking-Komplex aus Abschnitt 7.4.3.
   Berechnung der Anzahl der Fluorophor-Moleküle im Komplex durch Dividieren der Fluoreszenzintensität in Abschnitt 7.4.4 über die Intensität der einzelnen Fluorophor in Abschnitt 7.3.5 erhalten wird.
   Anmerkung 1: Es ist wünschenswert, dass die Beleuchtungs-und Erfassungseinstellungen für Protokoll 7.4 sind die gleichen wie in Protokoll 7.1. Wenn entweder die Belichtungszeit oder Laserintensität wurde während dieser Schritte eingestellt, sollten die resultierende Fluoreszenzwerte entsprechend skaliert werden. Jedoch ist die Genauigkeit eines solchen Skalierung durch Abbildung der gleichen Probe (zB Fluoreszenzzeit) unter diesen verschiedenen Bedingungen und die Berechnung des Verhältnisses der erhaltenen Intensitäten nachgewiesen werden.

8. Mikrotubuli-Tip-Tracking durch die Protein-beschichteten Kügelchen

1. Führen Sie Experimente mit tip-Tracking-Perlen durch Auslösen MT Demontage wie in Protokoll 6. Die Intensität der Lichtquelle DIC sollte reduziert werden, um gleichzeitig betrachten Rhodamin-Fluoreszenz mitDIC-Bildgebung.
2. Vorbereitung der Kügelchen nach Grishchuk et al. ¹⁰ und Asbury et al. ¹¹ einführen 30-50 ul der Perlensuspension in die Kammer mit 10 &mgr; l / min. Die vorgeschlagene Wulst Konzentration 10 ^-16 -10 ^-17 M.
3. Bei Verwendung aufrechten Mikroskop, entfernen Sie die Kammer von der Mikroskoptisch und invertieren es für 5-10 min zu ermöglichen Perlen an der Deck sedimentieren. Dies fördert eine bessere Bindung des Wulstes an die Mikrotubuli der Deckbunden, aber dieses Verfahren ist nicht erfolgreich, mit 0,5 &mgr; m Polystyrolkügelchen, die wenig schwerkraftbasierten Sedimentation während einer so kurzen Zeit zu zeigen.
4. Wählen Sie eine Perle, die auf dem Deckglas-bunden Mikrotubuli gebunden ist; der Wulst sollten in einer klaren Lichtbogen ⁴⁴ (4A) zu bewegen. Der gefesselte Wulst sollte 1-3 um weg von der Deckfläche, die deutlich sichtbar ist wegen der gelegentlichen Deckglas-Perlen, die m befestigt bleiben liegenotionless.
5. Wechseln Sie zu Rhodamin-Filterwürfel und beginnen Sammeln von Bildern, während mit DIC Beleuchtung.
6. Verschluß geöffnet, um das Bildfeld (mit einer Feldblende beschränkt) mit einer Quecksilberlampe oder 530-550 nm-Laser zu beleuchten. Aufzeichnen, bis die Perle löst oder bewegt sich mit der Demontage der Mikrotubuli Ende (Zahlen 4D, 4F und 4G).
   Hinweis 1: Optische Falle kann verwendet werden, um die Interaktion zwischen Mikrotubuli Wand-und Perlenprotein beschichtete fördern. Dies ist besonders nützlich bei der Arbeit mit Perlen mit Kinesin-Motoren (4E-G) beschichtet. Folgen Sie dieselben Protokolle wie oben, jedoch ergänzen Motilität Puffer mit 2 mM Mg-ATP. In Schritt 8.3, erfassen einen frei schwebenden Perle mit dem 1064-nm-Laserlicht, bewegen Sie die Bühne, um die gefangenen Perle näher an der segmentierten Mikrotubuli Wand zu bringen. Beginnen Bildgebung mit wenig Licht und DIC über die Rhodamin-Filterwürfel und warten auf die Perle zu Fuß in Richtung der Mikrotubuli bedeckten Ende zu beginnen. Achterner die gerichtete Wulst Bewegung wird beobachtet, schließen Sie den Auslöser zum Einfangen Strahl, und öffnen Sie den Auslöser für Leuchtstoff-Beleuchtung. Aufzeichnen, bis die Perle löst oder Tracks mit der Demontage der Mikrotubuli Ende.

Ergebnisse

Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden. Hefe Kinetochor Komponente Dam1 ist mit Abstand der beste Tipp-Tracker der Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden ^14. Dieses 10-Untereinheit Komplex mit GFP-markierten leicht ausgedrückt und aus Bakterienzellen ^18,38 gereinigt, so dass wir empfehlen, es als eine positive Kontrolle für den Tipp-Tracking-Assay. Ein fluoreszierendes Protein, das mit dem Ende einer Depolymerisation der Mikrotubuli-Tracks als hell fluoresziere...

Diskussion

Viele Einzelmolekül-Assays heutzutage routinemäßig speziell behandelt, um unspezifische Proteindeckknack drastisch zu reduzieren. Das Verfahren, das wir hier beschreiben, ist eine Modifikation der in Howard Labor ³² Original-Protokoll entwickelt, und wir finden, dass die Deckgläser Silanisierung ist die Mühe wert, auch mit DIC-basierte Assays Perle, die nicht mit Fluoreszenz. Kammern mit solchen Deckgebaut zeigen viel sauberer Oberflächen, und die in Gegenwart von löslichen Mikrotubuli-Bindungsprotein erhalte...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tabelle 1. Mikroskopie und andere Geräte.
Mikroskop	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	andere Mikroskopmodelle, die DIC- und Epifluoreszenz-Bildgebung unterstützen, können verwendet werden
Objektiv	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Öl 1,49	100X, DIC, 1,3-1,49 NA
Objektivheizung	Bioptechs	150803, 150819-19
Leuchtstofffilterwürfel	Chroma	49004 oder 49008 41017 oder 49020	optimiert für Rhodamin-Fluoreszenz  optimiert für GFP-Fluoreszenz
Erfassungssoftware	Freeware MicroManager Molecular Devices	nicht anwendbar MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ andere Software kann zur Aufnahme von Bildern und für eine Partikelverfolgung verwendet werden
EMCCD-Kamera	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Hochempfindliche EMCCD-Kamera
Trapping-Laser	IPG Photonik	YLR-10-1064-LP	1.064 nm Laser, 10 W
Fluoreszenzanregungslaser	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP	Anregung von grünen Fluorophoren Anregung von roten Fluorophoren
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001
Kommerzielle Durchflusskammern	Warner Instruments	RC-20 oder RC-30
Perfusionspumpe	Cole Palmer Harvard Apparatur	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Beide Pumpen liefern die erforderliche Flüssigkeitsdurchflussrate, aber eine Schlauchpumpe kann mit sehr langsamer Geschwindigkeit pulsieren. Der Durchfluss mit einer Spritzenpumpe ist für einen weiten Bereich von Raten gleichmäßiger, aber diese Pumpe hat eine Trägheit.
Tabelle 2. Vorbereitung der Mikroskopiekammer.
Modifizierte Objektträger für wiederverwendbare Kammern	Precision Glassblowing of Colorado	Custom Order www.precisionglassblowing.com	Sonic steckt Objektträger unter Verwendung von Schaltplänen in Abbildung 1
Polyethylen-Schlauch	Intramedic	427410	Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm; verwenden Sie diese Röhren, um die zusammengebaute Kammer mit der Pumpe und dem Abfallbehälter zu verbinden
Polyethylenschlauch	Intramedic	427400	Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm; verwenden Sie diese Röhrchen zur Herstellung der wiederverwendbaren Kammer
Reguläre Objektträger	VWR	48312-003	Andere ähnliche Objektträger können verwendet werden
Deckgläser	VWR	48393-150, 48366-067	Andere ähnliche Deckgläser können verwendet werden
Silikondichtstoff	World Precision Instruments	KIT, SILIKONDICHTSTOFF 5 MIN AUSHÄRTUNG
Epoxidkleber	Loctite	83082
Cyanacrylat-Klebstoff	Scotch 3M	AD114	Oder Cyanacrylat-Klebstoff anderer Hersteller
Tabelle 3. Deckgläser Reinigung und Beschichtung.
Molekularsiebe, Güteklasse 564	Macron	4490-04
Deckglas-Färbeglas	Ted Pella, Inc.	21036
Deckglas Keramikhalter	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silan	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-Digoxigenin AB	Roche Applied Science	11093274910
Tabelle 4. Aufbereitung von Samen und segmentierten Mikrotubuli.
Tubulin	gereinigt aus Kuhgehirnen Cytoskeleton, Inc	T238P	Für Aufreinigungsprotokolle siehe 49– 51 Unmarkiertes Schweinetubulin
Markiertes Tubulin	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)	Rhodamin-markiertes Schweinetubulin Tubulin kann mit jedem aminreaktiven Farbstoff markiert werden, wie in der Referenz52 beschrieben.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot und Lagerung bei -70 ° C
VALAP	Vaseline, Lanolin und Paraffin in einem Massenverhältnis von 1:1:2		siehe Referenz9