Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Zusammenfassung

Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.

Zusammenfassung

Mikrotubuli-Depolymerisation Kraft zu liefern, um verschiedene Proteinkomplexe und Perlen-Protein-beschichteten in vitro zu transportieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind vermutlich eine wichtige Rolle bei der Mikrotubuli-abhängige Chromosomenbewegungen während der Zellteilung spielen, aber die entsprechenden Proteine ​​und ihre genauen Aufgaben sind schlecht definiert. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf an Assays, mit denen eine solche Beweglichkeit in vitro-Studie unter Verwendung von gereinigten Komponenten und definierten biochemischen Milieu entwickeln. Mikrotubuli sind jedoch inhärent instabil Polymere, ihre Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Die Protokolle beschreiben wir hier die Vorteile der segmentierten Mikrotubuli, die mit der Stabilisierung photoablatable Kappen hergestellt werden. Depolymerisation von solchen segmentierten Mikrotubuli mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung der Motilität Studien an den Mikrotubuli-Enden der Demontage. Diese Technik kann verwendet werden, um ca.RRY eine quantitative Analyse der Anzahl der Moleküle in der fluoreszenzmarkierte Proteinkomplexe, die mit dynamischen Mikrotubuli prozessiv Enden zu bewegen. Ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis in diesem und anderen quantitativen Fluoreszenz-Assays zu optimieren, sollte Deck behandelt, um unspezifische Absorption von löslichen fluoreszierend markierten Proteinen zu reduzieren. Detaillierte Protokolle vorgesehen sind, um der Unebenheit der Fluoreszenzbeleuchtung zu nehmen und zu bestimmen, die die Intensität eines einzelnen Fluorophors mit äquidistanten Gauß Form. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von segmentierten Mikrotubuli Mikrotubuli-abhängigen Bewegungen der Protein-beschichteten Mikroperlen zu untersuchen, die einen Einblick in die Fähigkeit der verschiedenen Motor-und nichtmotorisiertem Proteine ​​zu koppeln Mikrotubuli-Depolymerisation prozessive Fracht Bewegung.

Einleitung

Mikrotubuli sind hoch konserviert Strukturen des Zytoskeletts, die wichtig für die zelluläre Architektur, Zellbewegung, Zellteilung und intrazellulären Transport ¹ sind. Diese dynamischen Polymeren zusammen von Tubulin in Gegenwart von GTP und spontan zwischen Wachstum und Verkürzung ² wechseln. Mikrotubuli sind sehr dünn (nur 25 nm Durchmesser) daher besondere optische Techniken, um Kontrast verbessern sollte verwendet werden, um Mikrotubuli mit einem Lichtmikroskop zu beobachten. Frühere Arbeiten mit diesen Polymeren untersucht ihr dynamisches Verhalten mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) ^3. Diese und ähnliche Studien in v....

Protokoll

Benötigte Ausrüstung: Die unten beschriebenen Experimente erfordern einen Lichtmikroskop für DIC und Fluoreszenz-Bildgebung (Tabelle 1) ausgestattet. Hellfeld LED-Beleuchtung kann verwendet werden, um den Nachweis der Deckglas-Attached Mikrotubuli ³⁷ Samen, die nur schwer mit einer normalen Halogenlampe zu beobachten sind deutlich zu verbessern. Um den Flüssigkeitsstrom in der Mikroskopie Kammern zu steuern, sollten die Lösungen mit einer Schlauchpumpe in der Lage, Strömungsgeschwindigkeiten 10-100 ul / min ausgetauscht. Eine Spritzenpumpe kann auch verwendet werden, jedoch sollte darauf geachtet werden, um Luftblasen, die....

Ergebnisse

Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden. Hefe Kinetochor Komponente Dam1 ist mit Abstand der beste Tipp-Tracker der Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden ^14. Dieses 10-Untereinheit Komplex mit GFP-markierten leicht ausgedrückt und aus Bakterienzellen ^18,38 gereinigt, so dass wir empfehlen, es als eine positive Kontrolle für den Tipp-Tracking-Assay. Ein fluoreszierendes Protein, das mit dem Ende einer Depolymerisation der Mikrotubuli-Tracks als hell fluoresziere.......

Diskussion

Viele Einzelmolekül-Assays heutzutage routinemäßig speziell behandelt, um unspezifische Proteindeckknack drastisch zu reduzieren. Das Verfahren, das wir hier beschreiben, ist eine Modifikation der in Howard Labor ³² Original-Protokoll entwickelt, und wir finden, dass die Deckgläser Silanisierung ist die Mühe wert, auch mit DIC-basierte Assays Perle, die nicht mit Fluoreszenz. Kammern mit solchen Deckgebaut zeigen viel sauberer Oberflächen, und die in Gegenwart von löslichen Mikrotubuli-Bindungsprotein erhalte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tabelle 1. Mikroskopie und andere Geräte.
Mikroskop	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	andere Mikroskopmodelle, die DIC- und Epifluoreszenz-Bildgebung unterstützen, können verwendet werden
Objektiv	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Öl 1,49	100X, DIC, 1,3-1,49 NA
Objektivheizung	Bioptechs	150803, 150819-19
Leuchtstofffilterwürfel	Chroma	49004 oder 49008 41017 oder 49020	optimiert für Rhodamin-Fluoreszenz  optimiert für GFP-Fluoreszenz
Erfassungssoftware	Freeware MicroManager Molecular Devices	nicht anwendbar MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ andere Software kann zur Aufnahme von Bildern und für eine Partikelverfolgung verwendet werden
EMCCD-Kamera	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Hochempfindliche EMCCD-Kamera
Trapping-Laser	IPG Photonik	YLR-10-1064-LP	1.064 nm Laser, 10 W
Fluoreszenzanregungslaser	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP	Anregung von grünen Fluorophoren Anregung von roten Fluorophoren
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001
Kommerzielle Durchflusskammern	Warner Instruments	RC-20 oder RC-30
Perfusionspumpe	Cole Palmer Harvard Apparatur	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Beide Pumpen liefern die erforderliche Flüssigkeitsdurchflussrate, aber eine Schlauchpumpe kann mit sehr langsamer Geschwindigkeit pulsieren. Der Durchfluss mit einer Spritzenpumpe ist für einen weiten Bereich von Raten gleichmäßiger, aber diese Pumpe hat eine Trägheit.
Tabelle 2. Vorbereitung der Mikroskopiekammer.
Modifizierte Objektträger für wiederverwendbare Kammern	Precision Glassblowing of Colorado	Custom Order www.precisionglassblowing.com	Sonic steckt Objektträger unter Verwendung von Schaltplänen in Abbildung 1
Polyethylen-Schlauch	Intramedic	427410	Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm; verwenden Sie diese Röhren, um die zusammengebaute Kammer mit der Pumpe und dem Abfallbehälter zu verbinden
Polyethylenschlauch	Intramedic	427400	Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm; verwenden Sie diese Röhrchen zur Herstellung der wiederverwendbaren Kammer
Reguläre Objektträger	VWR	48312-003	Andere ähnliche Objektträger können verwendet werden
Deckgläser	VWR	48393-150, 48366-067	Andere ähnliche Deckgläser können verwendet werden
Silikondichtstoff	World Precision Instruments	KIT, SILIKONDICHTSTOFF 5 MIN AUSHÄRTUNG
Epoxidkleber	Loctite	83082
Cyanacrylat-Klebstoff	Scotch 3M	AD114	Oder Cyanacrylat-Klebstoff anderer Hersteller
Tabelle 3. Deckgläser Reinigung und Beschichtung.
Molekularsiebe, Güteklasse 564	Macron	4490-04
Deckglas-Färbeglas	Ted Pella, Inc.	21036
Deckglas Keramikhalter	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silan	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-Digoxigenin AB	Roche Applied Science	11093274910
Tabelle 4. Aufbereitung von Samen und segmentierten Mikrotubuli.
Tubulin	gereinigt aus Kuhgehirnen Cytoskeleton, Inc	T238P	Für Aufreinigungsprotokolle siehe 49– 51 Unmarkiertes Schweinetubulin
Markiertes Tubulin	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)	Rhodamin-markiertes Schweinetubulin Tubulin kann mit jedem aminreaktiven Farbstoff markiert werden, wie in der Referenz52 beschrieben.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot und Lagerung bei -70 ° C
VALAP	Vaseline, Lanolin und Paraffin in einem Massenverhältnis von 1:1:2		siehe Referenz9