Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Mikrotubuli sind hoch konserviert Strukturen des Zytoskeletts, die wichtig für die zelluläre Architektur, Zellbewegung, Zellteilung und intrazellulären Transport ¹ sind. Diese dynamischen Polymeren zusammen von Tubulin in Gegenwart von GTP und spontan zwischen Wachstum und Verkürzung ² wechseln. Mikrotubuli sind sehr dünn (nur 25 nm Durchmesser) daher besondere optische Techniken, um Kontrast verbessern sollte verwendet werden, um Mikrotubuli mit einem Lichtmikroskop zu beobachten. Frühere Arbeiten mit diesen Polymeren untersucht ihr dynamisches Verhalten mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) ^3. Diese und ähnliche Studien in vitro gezeigt, dass unter typischen experimentellen Bedingungen, die Mikrotubuli unterziehen Katastrophe und Schalter auf der Depolymerisation nur selten, einmal alle 5-15 Minuten (diese Frequenz für 7-15 mM bei 28 bis 32 ° C untersucht löslich Tubulin-Konzentration ) ^4. Verschiedene Techniken wurden so Induktions vorgeschlagene Depolymerisation von Mikrotubuli in einer kontrollierten Weise. Mikrotubuli Verkürzung kann durch Waschen entfernt lösliche ^5,6 Tubulin, Mikrotubuli Schneiden mit einem Laserstrahl ⁷ oder ⁸ unter Verwendung von segmentierten Mikrotubuli, wie hier beschrieben, ausgelöst werden. Frühere Arbeiten mit segmentierten Mikrotubuli sowie stochastisch Schalt Polymere, hat festgestellt, dass die kleinen intrazellulären Ladungen, wie Chromosomen, Vesikel und Perlen-Protein-beschichtet ist, kann an den Enden der Mikrotubuli Verkürzung ^9-13 bewegen. Dieses Phänomen wird gedacht, um eine direkte Auswirkungen auf Chromosom Bewegungen in mitotischen Zellen zu haben, und die zugrunde liegenden Mechanismen sind derzeit aktiv untersucht ^14-16.

Kürzlich, fluoreszenzbasierten Techniken, einschließlich der vollständigen internen Reflexion (TIRF) Mikroskopie, wurden eingesetzt, um die Motilität mit dynamischen Mikrotubuli untersuchen endet ^17-24. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungs zwischen Mikrotubuli und Mikrotubuli-bindende Proteine ​​in Echtzeit unter Verwendung von Proteinen mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind. Mehrere Protein-Komplexe wurden gefunden, um prozessiv mit Verlängerung und / oder Verkürzung der Mikrotubuli-Enden zu bewegen. Sie umfassen die Mikrotubuli-assoziierten Proteinen Dam1 ^10,12,18, SKA1 ¹⁹ und ²⁰ XMAP215 sowie Kinesin-Motoren Kif18A ^21,22, MCAK ²³ und CENP-E ^24. Diese Proteine ​​zeigen prozessive tip-Tracking, die sich grundlegend von der der klassischen Spitze-Tracking-Proteine ​​wie EB1 ²⁵ ist. Obwohl EB1-Moleküle und die assoziierten Partner erscheinen stabil mit dynamischen Mikrotubuli-Enden, die einzelnen Moleküle bleiben an der Spitze der Mikrotubuli für nur ~ 0,8 s gebunden ist, schnell den Austausch mit dem löslichen Pool ²⁶ zugeordnet bleiben. Im Gegensatz dazu prozessive Spitze-trackers, wie Dam1, reisen mit Mikrotubuli-Enden für viele Mikrometer und ihre Assoziation mit Mikrotubuli-Tipps können für m dauernkeine Sekunden. Die Spitze Assoziation Zeit sowie die resultierende Geschwindigkeit der Verfolgung, hängt stark von der Anzahl der Moleküle, die die Spitze-Tracking-Komplex ²⁷ zu bilden. Größere Protein-Ensembles sind in der Regel viel besser Spitze-trackers. Zum Beispiel können solche komplexen Baugruppen der isolierten Hefe Kinetochore Mikrotubuli gekoppelt bleiben Enden für ²⁸ Stunden. Einige Mikrotubuli-bindende Proteine, wie zB Ndc80 Kinetochorenprotein Komplex gefunden werden nicht mit Mikrotubuli Bahnenden an einer Einzelmolekülebene, noch Ndc80 ist sehr effizient bei der Kopplung der Bewegung der Wulst Ladung ^19,29-31. So, um den Mechanismus der Spitze-Tracking von verschiedenen Protein-Komplexe, sowie deren biologische Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Spitze-Tracking in Abhängigkeit von der Anzahl der Moleküle in der Spitze-Tracking-Komplex zu untersuchen, sowie um zu bestimmen, die Fähigkeit dieser Komplexe Tarif Motilität auf der Oberfläche der Perle Ladung aufweisen.

(1A) vorzubereiten und durchzuführen Experimenten. Zunächst werden die im Handel erhältlichen Glasobjektträger modifiziert, um kurze Polyethylenschlauch (Protokoll 1) befestigen. Die wiederverwendbare Mikroskopie Flusskammer wird dann aus wie eine Folie die chemisch oder Plasma-gereinigt und silanisierten Deckglas (Protokoll 2) ^32-34 montiert und. Die daraus resultierende Raumvolumen ist nur 20-25 ul (oder so klein wie 15 ul, siehe Anmerkung 3 in Protokoll Nr. 1), einschließlich des Volumens der Einlassschlauch. Kommerziell erhältlich Strömungskammern können auch verwendet werden, aber ihr Volumen ist in der Regel größer, was zu einer unnötigen Verschwendung von Proteinen. Wenn eine größere Kammer verwendet wird, sollte das Volumen aller Lösungen in folgenden Protokolle proportional skaliert werden. Mikrotubuli Samen werden dann mit langsam hydrolysierbaren GTP-Analog, GMPCPP (Guanosin-5'-[(α, β)-methyleno] Triphosphat) (Protokoll 3 hergestellt, zum Beispiel, siehe auch Hyman <em> et al. ^35). Die Samen werden auf einem gereinigten Deck immobilisiert und die Oberfläche wird anschließend blockiert, um die unspezifische Absorption von anderen Proteinen verhindern, ³² (Protokoll 4 beschreibt Samen Immobilisierung mit Digoxigenin). Die segmentierten Mikrotubuli können dann mit Protokoll Nr. 5 hergestellt werden. Der Hauptgrund für diesen Ansatz ist, dass dynamische Mikrotubuli-Polymere, die in Gegenwart von GTP zu bilden, kann vorübergehend durch Addieren der kurzen "Kappen" von stabilen Tubulin-Segmente, die GMPCPP enthalten stabilisiert werden. Diese Kappen enthalten Rhodamin-markierten Tubulin, so können sie einfach mit einem 530-550 nm-Laser-oder Quecksilberbogenlampe (Protokoll Nr. 6) ³⁶ Beleuchten des Sichtfeldes entfernt werden. Die Fluoreszenzintensität der Spitze-Tracking-Signal kann dann verwendet werden, um die Anzahl der Moleküle, die mit der Demontage der Mikrotubuli-Enden reisen zu schätzen, unter Berücksichtigung der Unebenheiten des Mikroskops Feldbeleuchtung (Protokoll 7) werden. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden,Wechselwirkungen zwischen Depolymerisation von Mikrotubuli und Perlen-Protein-beschichteten, hergestellt wie in ²⁷ (Protokoll 8) beschrieben zu studieren. Einige Proteine ​​werden leicht an den Wänden des segmentierten Mikrotubuli binden, aber Laserpinzette können auch verwendet werden, um den Wulst in der Nähe der Mikrotubuli Wand halten, wodurch die Förderung ihrer verbindlich.

Benötigte Ausrüstung: Die unten beschriebenen Experimente erfordern einen Lichtmikroskop für DIC und Fluoreszenz-Bildgebung (Tabelle 1) ausgestattet. Hellfeld LED-Beleuchtung kann verwendet werden, um den Nachweis der Deckglas-Attached Mikrotubuli ³⁷ Samen, die nur schwer mit einer normalen Halogenlampe zu beobachten sind deutlich zu verbessern. Um den Flüssigkeitsstrom in der Mikroskopie Kammern zu steuern, sollten die Lösungen mit einer Schlauchpumpe in der Lage, Strömungsgeschwindigkeiten 10-100 ul / min ausgetauscht. Eine Spritzenpumpe kann auch verwendet werden, jedoch sollte darauf geachtet werden, um Luftblasen, die sich bilden können, wenn die Strömungsgeschwindigkeit schlagartig verändert vermeiden. Für den Umgang mit Perlen-Protein-beschichtet, zum Beispiel, um sie in der Nähe des segmentierten Mikrotubuli Wand zu bringen, kann ein 1064 nm Dauerstrich-Laserstrahls in das Mikroskop optischen Achse eingeführt werden und konzentriert sich mit hoher numerischer Apertur Objektiv (1.3 oder höher) zur Herstellung einer Falle. Für die quantitative Analyse der FluoreszenzIntensität einzelner Moleküle das Anregungslicht von einem Laser sollte Basis Quelle, da die Intensität dieser Lichtquelle vorgesehen sein, ist stabiler als das von einer Quecksilberlampe erzeugt. Mechanische Schwingungen zu minimieren, sollte das Mikroskop auf einem optischen Tisch gestellt werden. Weitere anspruchsvolle Ausrüstung erforderlich ist, um die Bewegung der Kugeln mit der Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden unter einer konstanten Kraft zu studieren, und die Single-Shot-Kraftsignale ^11,38,39 messen, werden diese Methoden an anderer Stelle beschrieben werden.

1. Wiederverwendbare Fertigungsflusskammern

Glasobjektträger für wiederverwendbare Strömungskammern können von einer lokalen Glasproduktionsanlage mit Schaltplänen in 1B bestellt werden (siehe Tabelle 2 für Details zu unseren Lieferanten). Mit Ultraschall-Fräsen ändern regelmäßigen Objektträger (75 mm x 25 mm, 1,0 mm dick) zwei Nuten 15 ± 1 mm lange zu machen, 1,0 ± 0,1 mm breit und 0,8 ± 0,05 mm tief.Abstand zwischen den nächstliegenden Enden sollte 14 ± 1 mm, dieser Abstand ist optimal für eine Kammer mit 22 mm x 22 mm Deckglas montiert. Siehe Tabelle 2 für eine Liste von anderen Materialien.

1. Platzieren einer 100 mm langen Polyethylenschlauch (OD 0,61 mm, Tabelle 2) in jeder Nut in dem Schieber, so ~ 5 mm Überhänge an den inneren Enden der Nuten. Befestigen Sie die Rohre innerhalb der Nuten mit Sekundenkleber, die Rohre vollständig innerhalb der Rillen Einbettung.
2. Füllen Sie die Rillen mit Epoxy-Kleber, unter Vermeidung von Verschütten der Leim in den Rohren. Lassen Sie den Kleber trocknen für ca. 1 Tag.
3. Mit einer scharfen Rasierklinge schneiden die erstarrte Masse Kleber 3-4 mm vom distalen Ende jeder Befestigungsstelle, das Entfernen der Teile proximal der Mitte der Folie. Die Rohre sollten in ihren Nuten bleiben. Das Entfernen der proximalen Teile werden auch geschnitten und entfernen Sie die inneren Überhänge, wodurch eine ebene Fläche mit zwei Rohröffnungen.
4. Füllen Sie eine Spritze mit Wasser und Testob die Rohre richtig arbeiten. Wenn die Flüssigkeit frei, einen Tropfen Epoxid-Kleber (~ 5 mm im Durchmesser) an den äußeren Enden der Hainen, trocken für 1 Tag (1D). Dies wird Kammern mehr haltbar, so dass sie immer wieder für viele Monate verwendet werden.
   Note 1: eine Kammer für ein inverses Mikroskop zu machen, sollten die Folien zusätzlich modifiziert werden, um zwei kleine Löcher an den entgegengesetzten Enden der Nuten (1C) bilden. Stecken Sie die Rohre durch die Löcher in der Folie, biegen Sie die Rohre und passen Sie sie fest in den Nuten (1E). Befolgen Sie die Schritte 1.2-1.4, aber entfernen Sie die Epoxid-Kleber von der gesamten Oberfläche, die verwendet werden, um eine Strömungskammer machen wird.
   Hinweis 2: Um Kammervolumen zu reduzieren, verwenden Fräsen, zwei Vertiefungen 0,050 ± 0,005 mm tief zu machen, so dass der zentrale Teil des Schlittens 5,0 ± 0,5 mm breit und leicht erhöht (siehe "geätzten Bereiche" auf 1B und 1C). Wenn ter Flusskammer montiert ist (wie unten beschrieben), legen Sie das doppelseitige Klebeband in diesen Vertiefungen.
   Hinweis 3: Um diese modifizierten Folien wiederverwenden, nach Beendigung der Experimente entfernen Sie das Deckglas und doppelseitiges Klebeband mit einer Rasierklinge. Entfernen des Dichtungsmittels durch Abziehen und durch Abwischen der Objektträger mit 70% Ethanol. Legen Sie die Folie in einem Behälter mit 1-2% der Laborgeschirrspülmittel, befestigen Schlauch mit einer Schlauchpumpe und perfuse 50-70 ml, folgen mit dem gleichen Volumen VE-Wasser, trocknen und lagern in einem staubfreien Fach.

2. Vorbereitung der Deckgläser

Dieses Protokoll dauert 6-8 Stunden und wird dazu beitragen, 12 Deckgläser vorbereiten. Sie werden eine keramische Deckhalter und drei Deckfärbung Gläser mit Deckel müssen; jar Volumen sollte 15 ml, so wird jeder 4 Deckgläser gestapelt zusammen zu halten. Ein Glas mit einem Deckel (250 ml) zu verwenden, um Deckgläser mit Silan inkubiert werden. Verwenden Sie reguläre No.1 Deckgläser (22 mm x 22 mm oder 22 mm x 30 mm, siehe Tabelle 2 und 3 für eine Liste der Materialien). Alle Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden, auch mit Handschuhen.

1. Setzen Sie die Deckgläser in die Glasdeckfärbung Gläser und füllen die Gläser mit Aceton. Inkubation für 1 h, waschen 10x mit VE-Wasser.
2. Inkubieren Sie die Deckgläser 10 min mit Ethanol und waschen wieder 10x mit VE-Wasser.
3. Vorbereiten "Piranha"-Lösung. Setz 60 ml Wasserstoffperoxidlösung (30% in Wasser) in einem wärmebeständigen Glasbehälter und langsam mit 100 ml Schwefelsäure (endgültige Verhältnis von Säure zu Wasserstoffperoxid-Lösung ist 5,3). Lösung erwärmt sich, das ist normal, aber seien Sie vorsichtig. Piranha-Lösung ist stark ätzend! Verwenden Sie dicke Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille!
4. Füllen Sie die Deckfärbung Gläser mit "Piranha"-Lösung, schließen Sie den Deckel und legen Sie die Gläser in einem Wasserbad auf 90 ° C für 1 Stunde vorgeheizt.
5. Gießen Sie die "Piranhas" Löauf und entsorgen wie von den Sicherheitsbestimmungen am Arbeitsplatz angewiesen. Wash Deckgläser 10x mit VE-Wasser.
6. Füllen Sie die Deck Küvetten mit 0,1 M KOH, Inkubation 10 min, 10x und waschen mit entsalztem Wasser. Dadurch werden alle Säurereste nach "Piranha"-Behandlung nach links auf den Deckgläsern zu neutralisieren.
7. Trockendeckgläser eine zu einem Zeitpunkt, indem jedes Deckglas mit Teflon beschichtet flachen Kanten Pinzette (um Schäden an einer Glasoberfläche zu minimieren) und beim Einblasen von Druck trockenem Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass Deck vollständig getrocknet, da Silan-Lösung wird mit Wasser hochreaktiv.
8. Stapeln Sie die getrockneten Deckgläser in Keramikhalter (12 Deckgläser pro Halter), die gründlich mit Stickstoff vorgetrocknet werden soll. Halten Sie die Keramikhalter abgedeckt, um Staub von Festhalten an der Deckfläche zu vermeiden.
9. Bedecken Sie den Boden von 250 ml Glas (6 cm Durchmesser) mit Molekularsiebe, Grad 564, für die Wasseraufnahme.
10. Füllen Sie das Glas mit 200 mlPlusOne Wehre Silan-Lösung und langsam tauchen ein Keramikträger mit Deckgläsern in einem Glas, den Deckel schließen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. Dies wird hydrophobe Beschichtung auf dem Deckglas Oberfläche.
11. Entfernen Sie langsam den Halter mit Deckgläsern aus dem Glas-und Transferdeckgläser eine zu einem Zeitpunkt in die Deck Küvetten mit Methanol gefüllt.
12. Platzieren eines Metall-oder Glassockel in das Wasserreservoir eines Ultraschallbad, so dass die Deck Küvette wird 2/3 seiner Höhe eintaucht. Ultraschallbehandlung bei 70 W für 20 min, Umkleide Methanol-Lösung alle 5 Minuten, dann spülen 10x mit VE-Wasser. Wenn die Silanisierung richtig funktioniert, werden die Deckgläser trocken erscheinen, wenn aus dem Wasser entfernt.
13. Restwasser mit Stickstoff gründlich entfernen, wie oben.
14. Zwischenlage die Deckgläser mit den Kimwipes Oberfläche-Oberfläche-Kontakt zwischen den Deck vermeiden. Deckgläser in einem abgedichteten Behälter für mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
    NAnmerkung 1: Die Schritte 2.1-2.6 kann durch die Reinigung der Deckgläser mit Plasma-Reiniger für 15 min bei 30 W, die gesamte Vorbereitungszeit stark reduziert ersetzt werden. Druck in der Reinigungskammer wird bei 100-200 Torr eingestellt. Sowohl atmosphärische und komprimierten Sauerstoff verwendet werden. Stapeln Sie die Plasma gereinigte Deckgläser in Keramikhalter und gehen Sie zu Schritt 2.7.

3. Vorbereitung der GMPCPP-stabilisierten Mikrotubuli Seeds

Dieser Vorgang dauert ca. 1 Stunde und die daraus resultierenden Mikrotubuli-Samen sind für 1-2 Tage bei Raumtemperatur stabil. Siehe Tabelle 4 für eine Liste von Reagenzien.

1. Mix auf Eis:
   • 10 ul unmarkiert Tubulin (100 uM, Tabelle 4) in BRB-80-Puffer (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl _2, pH 6,9 mit KOH; Ergänzung mit 1-2 mM DTT mit frischen Aliquot für jedes Experiment).
   • 2,6 &mgr; l Digoxigenin-markierten Tubulin (Tabelle 4). Stellen Sie die Lautstärke je nach Vorbereitung,so daß das endgültige Verhältnis von unmarkierten zu markierten Tubulin ist ~ 1:10 liegt. Gut mischen durch Pipettieren.
   • 1,4 &mgr; l 10 mM GMPCPP (Endkonzentration 1 mM)
2. Inkubieren 15 min bei 35 ° C werden die Keime wachsen 2-3 um lang. Stellen Sie Zeit, wenn verschiedene Mikrotubuli Länge gewünscht ist.
3. In 35 ul BRB-80 (bis 35 ° C vorgewärmt), mischen durch Pipettieren und Zentrifuge für 15 min bei 25.000 xg, um die Samen bei Raumtemperatur pelletieren.
4. Überstand verwerfen, waschen Sie die Pellet durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von 50 ul warmen BRB-80.
5. Resuspendieren und Pellet in 25 ul BRB-80.

4. Die Befestigung der Mikrotubuli Seeds zu den Deckgläser

Protokolle 4 und 5 benötigen 2-3 Stunden, so dass zwei Strömungskammern pro Tag eingesetzt.

1. Montieren Flusskammer gemäß den Anweisungen des Herstellers mit silanisierten Deckgläser und gehen Sie zu Schritt 4.2. Wenn Sie maßgeschneiderte Deckgläser (Protokoll 1), folgen Sie den Schritten below.
   1. Bringen Sie zwei Stücke von doppelseitigen Klebeband (5 mm x 30 mm) auf der Mittel ~ 5 mm an, legte silanisierten Deckglas oben auf der Kassette drücken fest.
   2. Füllen Sie die Kammer mit BRB-80 durch eine der Röhren und stecken beide Röhrchen mit Rund Zahnstocher.
   3. Drücken Sie einen kleinen Tropfen zweifarbige Kwik Gussdichtstoff auf einem kleinen Kunststoffpetrischale, und schnell, aber gründlich mischen mit einem Zahnstocher. Das Dichtmittel wird grün, gelten sofort, sorgfältig Abdichten aller Kanten des Deckglases. Wenn das Dichtmittel dringt zu tief unter dem Deckglas, öffnen Sie eine der Röhren durch Entfernen der Zahnstocher-Stecker und sanften Druck auf Dichtmittel aus undichten im Inneren der Rohre zu verhindern.
   4. Lassen Sie die Trockenkammer für 10 min und bestätigen, dass die Strömung nicht, bevor Sie fortfahren beschränkt.
2. Zeigen die Kammer auf einem Mikroskoptisch 32 ° C vorgewärmt und bringen eines der Rohre mit einer Pumpe, welche die Flüssigkeit zu pumpen heraus. Die Länge der Einlassröhresollte minimiert werden, um den unnötigen Verlust von Reagenzien zu vermeiden: Die empfohlene Länge beträgt 5-7 cm. Tauchen dieses Ende in einer 0,5 ml mit BRB-80-Puffer Fläschchen. Diese und alle folgenden Lösungen sollte auf 32-35 ° C vorgewärmt werden
3. Tragen Sie einen sanften Druck mit einer Pumpe oder heben Sie einfach das Ende des Auslaufrohrs den Squeeze-out die Luftblasen, die gelegentlich bilden können, wenn das Einlassrohr abgezogenem Stecker.
4. Stellen Sie die Pumprate bei 100 ml / min. Mit 2 Kammervolumina von Anti-Digoxigenin-Antikörper verdünnt 1:30 BRB-80 Waschen, Inkubation 15 min auf Antikörper-Adsorption zu ermöglichen.
5. Mit 5-10 Kammervolumina von warmem BRB-80 Waschen, Inkubation 10 min mit 1% Pluronic F-127 in BRB-80, um die hydrophobe Oberfläche des silanisierten Deck blockieren.
6. Mit 5-10 Kammervolumen der Motilität Puffer (BRB-80 mit 0,4 mg / ml Casein ergänzt) waschen.
7. Reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 10 ml / min und perfuse Mikrotubuli Samen verdünnt 1:200-1:600 ​​in 30-40 ul Motilität Puffer. Inkubation 15 kmn die Förderung der Bindung der Samen auf die Deckglas-Antikörper adsorbiert.
8. Waschen Sie die Kammer bei 100 ml / min mit 400 ul der Motilität Puffer um ungebundenes Material zu entfernen.
   Hinweis 1: Die resultierende Dichte von 10-30 Samen sollten je Mikroskopfeld (2A) sein. Zu beheben, verwenden Sie fluoreszierend markierten Tubulin während der Polymerisation (Schritt 3.1) zur leichteren Erkennung der Deckglas-Attached-Samen.
   Anmerkung 2: Axonemes von Chlamydomonas ⁴⁰ oder anderen biologischen Quellen, sowie die Häutchen von lysierten und deciliated Tetrahymena-Zellen ⁴¹ hergestellt werden, können auch als Mikrotubuli Keimbildner verwendet werden. Diese sind nützlich für die Erstellung Nucleatoren kleine Mikrotubuli-Arrays und werden bevorzugt, wenn die Mikrotubuli mit bestimmten Anzahl von Protofilamenten sind erwünscht (GMPCPP Samen Keime ein Mikrotubuli, die ≥ 14 Protofilamenten ⁴² enthält). Diese Strukturen können auf die gereinigten Deckgläser durch unspezifische Absorption angebracht werden, aber der Atta-chment gewöhnlich weniger stabil, verglichen mit Antikörper-basierte Befestigung, insbesondere bei der Verwendung von silanisierten Deck.

5. Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli

Alle Lösungsvolumina beziehen sich auf Kammervolumen 15-20 ul; proportional zu erhöhen, wenn größere Kammer verwendet.

1. Vorwärmen unmarkierten Tubulin-Mischung für 30 Sekunden (45 &mgr; l Motilität Puffer mit 1 mM Mg-GTP und mit 10-15 &mgr; M unmarkiertem Tubulin ergänzt) bei 35 ° C. Perfundieren bei 30 ml / min.
2. Überwachen Mikrotubuli Wachstum mit DIC Optik (2B, Video 1). Während 5-7 min Inkubation die Mikrotubuli wachsen normalerweise ~ 10 um lang.
3. Vorbereitung Rhodamin-Tubulin-Mischung (65 ul Puffer Motilität mit 0,5 mM GMPCPP und 2-5 &mgr; M Rhodamin-markierten Tubulin mit 0,5-1 Mol-Verhältnis von Rhodamin an Tubulin ergänzt) und erwärmen die Lösung bei 35 ° C für 30 sek.
4. Perfundieren sofort bei 30 μl / min. Inkubation für 8-10 min, um die Bildung von stabilen Leuchtstoffkappen an den Mikrotubuli-Tipps zu fördern. Stabile Mikrotubuli-Segmente werden auch spontan Keime und wird mit DIC-Optik sichtbar.
5. Die Kammer gut waschen mit 100 ul Motilität Puffer bei 20 ml / min auf Tubuline und Nukleotide, sowie lösliche Mikrotubuli-Fragmente zu entfernen.
6. Mit DIC, bestätigen, dass die Mikrotubuli sichtbar (Abbildung 2D) sind, deren Zahl jedoch abnehmen sollte, weil viele Mikrotubuli während der Abdeckung demontieren (Video 2 zeigt ein typisches Feld mit segmentierten Mikrotubuli).
   Anmerkung 1: Segmentierte Mikrotubuli sind sehr stabil und für mindestens 2 Stunden verwendet werden. Die Lebensdauer dieser Mikrotubuli nimmt jedoch mit übermäßigen Lösungsaustausch oder wenn 2-Mercaptoethanol wird in der Bildpuffer verwendet.

6. Experimentelle Beobachtung der Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli Ends

1. IntrodUCE 30-50 ul fluoreszierendes Protein (0,1-20 nM) in die Kammer mit 10 &mgr; l / min. Wenn Protein Festhalten an dem Deckglas ist offensichtlich, ergänzen die Motilität Puffer mit 8.4 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-Tracking erfordert zusätzlich 10 mM DTT oder 0,5-1% &bgr; ME ^10.
2. Begrenzen Sie die Beleuchtungsfeld mit Hilfe eines Mikroskops Feldblende, die unnötige Bleich-und Demontage der Mikrotubuli zu vermeiden.
3. Video starten Erfassung mit GFP-Filterwürfel, dann auf Rhodamin-Filterwürfel wechseln, ohne Unterbrechung der Bildaufnahme. Die roten Segmente an den Mikrotubuli-Enden sollte klar ersichtlich sein, sie beginnen zu verblassen und zerfallen schnell (Video 3).
4. Weiter zu beleuchten, bis die Kappen fast verschwinden (in der Regel für 10 bis 20 Sekunden, aber dieses Mal wird mehr für die mit einem niedrigeren Rhodamin Markierungsverhältnis gewachsen Kappen), und wechseln Sie zurück zu dem GFP-Protein Kanal aufzeichnen Tracking mit Mikrotubuli-Demontage.
5. Analysieren Sie dieresultierenden Sequenzen durch den Bau Kymographen, dh zweidimensionale Bilder, die Fluoreszenzintensität entlang der Mikrotubuli-Achse zeigen, zu verschiedenen Zeiten während Beobachtung) mit MetaMorph, frei verfügbare ImageJ oder andere Bildbearbeitungssoftware (2E).
   Anmerkung 1: Erfassungsrate sollte in Abhängigkeit von der Zeitsteuerung der beobachteten Ereignisse angepasst werden. Die empfohlene Rate beträgt 2-3 Frames pro Sekunde (fps) für den langsamen, Ring-Größe ^27, aber Dam1 Komplexe Aufnahmezeit für einzelne Moleküle sollte> 20 fps ¹⁹ sein.
   Hinweis 2: Ein hochempfindliches EMCCD, z. B. ANDOR iXon3 wird für die schnelle Aufnahme von tip-Tracking-Veranstaltungen mit Depolymerisation von Mikrotubuli benötigt. Die empfohlenen Einstellungen für Andor iXon3 Kamera sind: Gewinn 5x, EM, erhalten 200, 1 MHz Auslesegeschwindigkeit, 16-Bit-Sensor-Modus, 80 ms Belichtungszeit.
   Hinweis 3: Verwenden TIRF Mikroskopie Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern, jedoch kürzer Mikrotubuli sollte verwendet werden, wie that die fluoreszierenden stabilisierende Kappen bleiben innerhalb der Reichweite des evaneszenten Feld.

7. Quantitative Analyse der Molekülgröße von Mikrotubuli Tip-Tracking-Komplexe

Der Grund für diesen Ansatz besteht darin, die Anzahl der Moleküle in einer Spitze-Tracking-Komplex durch Finden des Verhältnisses der Gesamtfluoreszenzintensität des Spitzenverfolgungskomplex mit der Intensität eines einzelnen Fluorophors zu bestimmen. Dieser Ansatz kann auf GFP-Fusionsproteine ​​und Proteine ​​mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert angewandt werden, sondern es kann die Anzahl der Moleküle in der Spitze-Tracking-Komplexen unterschätzen, wenn einige Proteinmoleküle in den Zubereitungen sind nicht fluoreszierend.

1. Rekordphotobleaching Kinetik für die fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle.
   1. Zubauen regelmäßigen Mikroskopie Kammer unter Verwendung einer nicht-modifizierten Glas-Objektträger, zwei Streifen von doppelseitigem Klebeband und ein sauberes Deckglas, das unter Verwendung des gesamten Protokolls 2 hergestellt werden kann, oder nur die Schritte 2,1-2,6 dieserProtokoll.
   2. Etwa 50 nM Protein in Puffer Motilität, kurz waschen mit Puffer Motilität und Abdichtung der Kammer mit VALAP (Tabelle 4). Optimieren Proteinkonzentration auf das Feld mit gleichmäßig verteilt Spots (3A), was einzelne Moleküle und ihre kleine Aggregate (Trimere und Tetramere, die sich spontan in der Lösung bilden oder kann erscheinen, wenn mehrere Einzelmoleküle sind eng zusammen und kann nicht aufgelöst werden kann) erhalten . Dieser Schritt ist für den Erhalt einer Mehrspitzenverteilung des Photobleichschritte und genaue Bestimmung einer Schrittweite (siehe unten) sehr wichtig.
   3. Minimieren Sie die Beleuchtung Laserintensität, bei der die einzelnen fluoreszierenden Flecken sind noch sichtbar, mit geringerer Beleuchtung die Photobleaching Zeit verlängert, kann so länger Photobleaching Spuren erhalten werden. Auch die Belichtungszeit zu minimieren, um die Wahrscheinlichkeit von mehr als einem Fluorophor Bleich während eines Rahmens zu verringern. Die empfohlene EinstellungAndor iXon3 Kamera: Gewinn 5.0x, gewinnen EM 999, 10 MHz Auslesegeschwindigkeit, 50-100 ms Belichtungszeit.
   4. Konzentrieren Sie sich auf der Oberfläche des Deckglases, schließen Sie die Beleuchtung Verschluss, zu bewegen, um eine frische Feld, öffnen Sie die Beleuchtung Verschluss und Bilder zu erwerben, bis alle Komplexe gebleicht (danach als img (x, y) bezeichnet).
2. Korrigieren der erfassten Bilder für Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung (Fig. 3B).
   1. Bereiten Lösung nach Fluorophor, z. B. 1 &mgr; M Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) in BRB-80. Eine solche Lösung kann vorher hergestellt, aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden
   2. Bauen Sie eine Kammer, wie in Abschnitt 7.1.1, aber mit einem regulären Deckglas. In Fluorophorlösung und Abdichtung der Kammer mit VALAP.
   3. Sammeln> 50 Bilder der gesamten Mikroskopfeld: bewegen die Bühne, um ein neues ungebleichten Bereich, während die Beleuchtung Shutter geschlossen ist, und sofort nach dem Öffnen des Verschlusses die Bilder zu erwerben.
   4. (3C). Das resultierende Bild zeigt die Verteilung der Beleuchtungsintensität des Feldes (Illum (x, y), wobei x und y-Koordinaten des Pixels entsprechen).
   5. Bestimmen Sie die maximale Helligkeit der Pixel dieses Bildes (Max (Illum)).
   6. Mit der geschlossenen Jalousie und Beleuchtung mit gleichen Kameraeinstellungen, wie in Abschnitt 7.2.3 ein Bild erwerben, bestimmen die durchschnittliche Pixelintensität dieses Bildes; dieser Wert auf CN, Kamerarauschen entspricht.
   7. Mit den obigen Werten und Bild (Illum (x, y)) zu normalisieren, das experimentelle Bild (img (x, y)) unter Verwendung des folgenden Ausdrucks:
      
      Verwenden Sie das resultierende Bild img ^Norm (x, y) für die quantitative Analyse der brightness der stationären fluoreszierende Komplexe, aber auch, um die Bilder mit tip-Heften Komplexe (3D) zu normalisieren.
3. Bestimmen Intensität eines einzelnen Fluorophors.
   1. Mit normalisierten Bilder img ^Norm (x, y) und einem Bildverarbeitungs-Software wählen Sie eine Leuchtstoff Ort mit einem kreisförmigen Bereich (5-6 Pixel im Durchmesser) und bestimmen seine integrale Intensität für alle Frames, die Erzeugung der Photobleaching Spuren. Vermeiden Sie sehr helle Punkte (> 5-mal heller als die Dimmer sind).
   2. Mit der gleichen kreisförmigen Bereich Werkzeug, wählen Sie mindestens 3 Spot-freie Zonen, erzeugen die entsprechenden Photobleaching Spuren, mittlere und fit mit exponentiellen Abfall-Funktion.
   3. Tabellarisieren diesem Hintergrund Intensitätskurve, um die experimentellen Zeitpunkten entsprechen und subtrahieren sie von den Photobleaching Kurven.
   4. Glätten Sie die Kurven Photobleaching (Durchschnitt mit der Schiebefenster von 3-5 Punkte). Sichtprüfung der resultierenden Kurven undverwerfen jede Kurve, die einen abrupten Anstieg in der Fluoreszenz oder Fehlen offensichtlicher Bleichen (3E) zeigt.
   5. Für jeden der verbleibenden Kurven (in der Regel 50-70% der Gesamtzahl der Kurven), visuell gewünschte endgültige Plateau, wenn die Fluoreszenzfleck hat gebleicht. Kürzen dieses Segment nur ~ 100 Punkten verlassen und diese durchschnittlich Intensitäten. Subtrahieren Sie diesen Wert aus die verkürzte Photobleaching Kurve, um kleine Schwankungen zu minimieren, ist die Hintergrundwerte und die Größe des Hintergrundspitze (unten) zu reduzieren.
   6. Plotten eines Histogramms der Intensitäten für alle Zeitpunkte von 20 oder mehr Photobleichen Kurven (> 1.000 Zeitpunkte). Das Histogramm sollte mindestens 4 verschiedene Peaks (siehe Anm. 2) zu zeigen.
   7. Setzen Sie das Histogramm mit äquidistanten Gauß-Verteilung mit ^10,43 MATLAB, Mathematica oder ähnliche Software (3F):
      
      whier ein _i und σ _i, d und N sind Anpassungsparameter. Parameter A _i und σ _i entsprechen Amplitude und Breite des i-ten Peaks und d ist der Abstand zwischen den Spitzen ist, N ganze Zahl, die der Gesamtzahl der Spitzen in der Verteilung entspricht. Wenn Zentren der ersten 3 oder mehr Peaks zeigen eine gute Übereinstimmung mit visuell der angepassten Linie, der Abstand zwischen diesen Peaks (Parameter-d) entspricht einem Fluoreszenzintensität eines einzelnen Fluorophors.
      Hinweis 1: Anzahl der untersuchten Punkte (Abschnitt 7.3.6) sollte erhöht werden, wenn das Mikroskopiesystem weist erhebliche Vibrationen oder gibt es eine weitere Lärmquelle (z. B. instabile Laserstrahl).
      Hinweis 2: Es ist wichtig, zu erhalten> 3 Spitzen für die genaue Analyse mit äquidistanten Gauß-Passform. Wenn weniger Spitzen erhalten werden, die falsche (zB Doppel) Schrittgröße erhalten werden konntewenn die Beleuchtungsverhältnisse nicht optimal sind, sind z. B. wenn die Punkte bleichen zu schnell und einzelnen Schritte nicht gut gelöst.
4. Bestimmen Sie die Molekülgröße des tip-Tracking-Komplex.
   1. Verwenden Sie Bilder mit Protokoll Nr. 6 gesammelt und wählen Sie die ersten 2-4 Frames, die unmittelbar nach dem Öffnen des Verschlusses erworben wurden. Wenn das Feld für einige Zeit beleuchtet, bevor die Spitze-Tracking beobachtet wurde, eine Schätzung der ursprünglichen Intensität von der Kinetik der Photobleichung unter den gleichen Versuchsbedingungen.
   2. Durchschnittlich die ausgewählten Bilder und normalisieren das resultierende Bild wie in den Abschnitten 7.2.5-7.2.7.
   3. Messen integrale Intensität der Fluoreszenzspitze Verfolgungskomplex mit dem gleichen Bereichsgröße, wie in Abschnitt 7.3.1.
   4. Messen integrale Intensität von 3 Hintergrundflächen in der Nähe der Spitze-Tracking-Anlage und mit der gleichen Region, ist der Mittelwert dieser Werte und subtrahieren von der Intensität der tip-Tracking-Komplex aus Abschnitt 7.4.3.
   Berechnung der Anzahl der Fluorophor-Moleküle im Komplex durch Dividieren der Fluoreszenzintensität in Abschnitt 7.4.4 über die Intensität der einzelnen Fluorophor in Abschnitt 7.3.5 erhalten wird.
   Anmerkung 1: Es ist wünschenswert, dass die Beleuchtungs-und Erfassungseinstellungen für Protokoll 7.4 sind die gleichen wie in Protokoll 7.1. Wenn entweder die Belichtungszeit oder Laserintensität wurde während dieser Schritte eingestellt, sollten die resultierende Fluoreszenzwerte entsprechend skaliert werden. Jedoch ist die Genauigkeit eines solchen Skalierung durch Abbildung der gleichen Probe (zB Fluoreszenzzeit) unter diesen verschiedenen Bedingungen und die Berechnung des Verhältnisses der erhaltenen Intensitäten nachgewiesen werden.

8. Mikrotubuli-Tip-Tracking durch die Protein-beschichteten Kügelchen

1. Führen Sie Experimente mit tip-Tracking-Perlen durch Auslösen MT Demontage wie in Protokoll 6. Die Intensität der Lichtquelle DIC sollte reduziert werden, um gleichzeitig betrachten Rhodamin-Fluoreszenz mitDIC-Bildgebung.
2. Vorbereitung der Kügelchen nach Grishchuk et al. ¹⁰ und Asbury et al. ¹¹ einführen 30-50 ul der Perlensuspension in die Kammer mit 10 &mgr; l / min. Die vorgeschlagene Wulst Konzentration 10 ^-16 -10 ^-17 M.
3. Bei Verwendung aufrechten Mikroskop, entfernen Sie die Kammer von der Mikroskoptisch und invertieren es für 5-10 min zu ermöglichen Perlen an der Deck sedimentieren. Dies fördert eine bessere Bindung des Wulstes an die Mikrotubuli der Deckbunden, aber dieses Verfahren ist nicht erfolgreich, mit 0,5 &mgr; m Polystyrolkügelchen, die wenig schwerkraftbasierten Sedimentation während einer so kurzen Zeit zu zeigen.
4. Wählen Sie eine Perle, die auf dem Deckglas-bunden Mikrotubuli gebunden ist; der Wulst sollten in einer klaren Lichtbogen ⁴⁴ (4A) zu bewegen. Der gefesselte Wulst sollte 1-3 um weg von der Deckfläche, die deutlich sichtbar ist wegen der gelegentlichen Deckglas-Perlen, die m befestigt bleiben liegenotionless.
5. Wechseln Sie zu Rhodamin-Filterwürfel und beginnen Sammeln von Bildern, während mit DIC Beleuchtung.
6. Verschluß geöffnet, um das Bildfeld (mit einer Feldblende beschränkt) mit einer Quecksilberlampe oder 530-550 nm-Laser zu beleuchten. Aufzeichnen, bis die Perle löst oder bewegt sich mit der Demontage der Mikrotubuli Ende (Zahlen 4D, 4F und 4G).
   Hinweis 1: Optische Falle kann verwendet werden, um die Interaktion zwischen Mikrotubuli Wand-und Perlenprotein beschichtete fördern. Dies ist besonders nützlich bei der Arbeit mit Perlen mit Kinesin-Motoren (4E-G) beschichtet. Folgen Sie dieselben Protokolle wie oben, jedoch ergänzen Motilität Puffer mit 2 mM Mg-ATP. In Schritt 8.3, erfassen einen frei schwebenden Perle mit dem 1064-nm-Laserlicht, bewegen Sie die Bühne, um die gefangenen Perle näher an der segmentierten Mikrotubuli Wand zu bringen. Beginnen Bildgebung mit wenig Licht und DIC über die Rhodamin-Filterwürfel und warten auf die Perle zu Fuß in Richtung der Mikrotubuli bedeckten Ende zu beginnen. Achterner die gerichtete Wulst Bewegung wird beobachtet, schließen Sie den Auslöser zum Einfangen Strahl, und öffnen Sie den Auslöser für Leuchtstoff-Beleuchtung. Aufzeichnen, bis die Perle löst oder Tracks mit der Demontage der Mikrotubuli Ende.

Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden. Hefe Kinetochor Komponente Dam1 ist mit Abstand der beste Tipp-Tracker der Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden 14. Dieses 10-Untereinheit Komplex mit GFP-markierten leicht ausgedrückt und aus Bakterienzellen 18,38 gereinigt, so dass wir empfehlen, es als eine positive Kontrolle für den Tipp-Tracking-Assay. Ein fluoreszierendes Protein, das mit dem Ende einer Depolymerisation der Mikrotubuli-Tracks als hell fluoreszierende Fleck ständig Bewegung in Richtung der Deckglas-Attached-Samen (Video 3) gesehen. Es wird auch als schräge Linie auf einem entsprechenden kymograph (2E) angezeigt. Im Gegensatz dazu, wenn das Protein nicht zu-Spur-Spitze, verkürzt sich die Mikrotubuli ohne Darstellung Anreicherung des Fluoreszenzsignals auf der Mikrotubuli-Ende, wie menschliche Ndc80-GFP-Komplex 19 (Fig. 2F) gesehen. Wenn die prozessive Tracking beobachtet wird, die Rate der Mikrotubuli KurzEning kann durch Verfolgen der sich bewegenden Punkt oder durch Messung der Steigung der schrägen Linie an der entsprechenden kymograph bestimmt werden. Dies kann Informationen über die Stärke von Protein-Mikrotubulus-Ende Bindungs ​​45 zu geben. Proteine, die stark an die Mikrotubuli binden, wie der Ring Dam1 komplexen, verlangsamen die Geschwindigkeit der Depolymerisation der Mikrotubuli. Dieser Effekt hängt jedoch stark von der Größe des Spitzenverfolgungs komplex und die kleine Komplexe können wenig oder keinen Effekt auf die Geschwindigkeit der Mikrotubulus-Zerlegung 27 auszuüben. Somit sollte die Änderung in der Geschwindigkeit der Verkürzung der Mikrotubuli in Zusammenhang mit der Größe der Spitze-Tracking-Komplex interpretiert werden. Unter bestimmten Bedingungen kann das Tracking durch die Zunahme der Helligkeit der Spitzenverfolgungs Komplex begleitet werden, da die Depolymerisation Ende "sammelt" das Protein, das an die Mikrotubuli Gitter gebunden wurde. In diesem Fall wird die Geschwindigkeit der Depolymerisation oft verlangsamt gleichzeitig mit der zunehmenden Größe der Spitze-tracking-Komplex. In anderen Fällen ist die Beziehung komplexer. Zum Beispiel, viele Untereinheiten des Dam1 Proteinkomplex, in dem GFP wurde am N-Terminus Dam1 Untereinheit konjugiert ist, kann am Ende des Verkürzungs Mikrotubuli (Fig. 2G) gesammelt werden. Mikrotubuli Demontage schließlich Ständen; vermutlich, weil die Kraft des Mikrotubuli-Depolymerisation ist nicht stark genug, um Komplexe, die zu groß sind, zu bewegen. Die Demontage nimmt oft nach einem Rückgang in der Spitzenhelligkeit, die Dissoziation von einigen der Spitze-assoziierten Untereinheiten Dam1 10 gibt. Eine sorgfältige Untersuchung dieser Beziehungen ist wichtig, weil die Mikrotubuli-bindende Proteine, die nicht prozessiv verfolgen Sie können auch die Rate der Mikrotubuli-Demontage 19,31,46 verlangsamen.

Bead-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden. Viele Mikrotubuli-bindende Proteine ​​wurden bereits als Kuppler für die Mikroperlen-Bewegung mit dynamischen km identifiziertcrotubule endet 5,11,27,39,47. Auffallend ist, kann auch die Ndc80 Proteinkomplex die Mikrotubuli-Endrohr-Tracking durch die Sicken 29,30 aufrecht zu erhalten. Normalerweise Bindung zwischen Perlen und Mikrotubuli-Protein beschichtet ist stark, so dass, wenn Perlen werden auf die Mikroskopie Kammer hinzugefügt sie leicht binden an die segmentiert, Deckglas-Attached Mikrotubuli (Abb. 4A). Es ist nicht immer möglich, endgültig mit DIC, ob der Wulst wurde nur ein Mikrotubuli gebunden. Wir haben mehrere Kriterien entwickelt, die Aufzeichnung der Perlen, die Anlagen auf mehrere Mikrotubuli gebildet haben, zu vermeiden. Zuerst sollte eine Perle, die einem Mikrotubulus gebunden ist eine bogenförmige Bewegung zu zeigen, wie der Mikrotubuli schwenkt leicht rund um den Ort des Wachstums aus dem Deckglas angebracht Samen (4B). Zweitens, wenn das Stabilisierungs Kappe leuchtet, nur eine rote Segment sollte distal von der Saatgut-und Wulst (4C) zu sehen. Die Kappe kann oft gesehen werden following der Perle der bogenförmigen Bewegung bis in die Kappe Bleichmittel (Video 4). Drittens sollte die Markerbewegung (oder deren Ablösung) beobachtet kurz nachdem die Kappe gebleicht und die Richtung der Bewegung Wulst sollte mit Mikrotubuli Orientierung, die auf der Basis der obigen Beobachtungen abgeleitet wurde sein. Viertens, da die Mikrotubuli verkürzt und den Wulst bewegt sich auf das Saatgut, die Amplitude der bogenförmige Schwingungen sollten (Fig. 4D) zu verringern.

Wenn die Spur durch den Wulst ist sehr prozessiver, wie in Fig. 4D gezeigt ist, sind diese Kriterien oft erfüllt. Jedoch, wenn der Wulst Tracking nicht prozessive nach anfänglichem gerichtete Bewegung der Wulst trennt und beginnt Diffundieren zufällig. Mit größeren Kügelchen, z. B. 1 &mgr; m Glasperlen, ist dieses Wärmebewegung langsam genug ist, daß es als Bogen-enthaltende Bewegung mit der Verkürzung der Mikrotubuli Ende fehlinterpretiert werden könnte. Eine formale Kriterium basierend auf der GrößeWulst der Abweichung von der linearen Spur verwendet werden, um solche Ereignisse 29 zu unterscheiden. In unserer bisherigen Arbeit haben wir berechnet, durchschnittlich Wulst Ausflüge über die Mikrotubuli-Achse und geschätzt, dass, wenn dieser Wert überschritten, um 0,4 / 1 um des Mikrotubuli-Bewegung parallel Wulst war wahrscheinlich zufällig mit 95% Vertrauens diffundieren die Perle. Mit dieser Maßnahme haben wir festgestellt, dass auch in "Kontrolle" Perle Mittel, wie zB Perlen mit unspezifischen Antikörper oder Streptavidin-beschichteten Perlen in Verbindung mit biotinylierten Mikrotubuli verwendet beschichtet, 5% der Perlen wurden beurteilt prozessiv zu bewegen. Wenn eine höhere Genauigkeit gewünscht wird, Bewegungen von Kügelchen mit geringer Prozessivität zu überwachen, empfehlen wir die Verwendung einer Laserfalle, wo die gerichtete Wulst Bewegungen sind leichter zu identifizieren.

Laserfalle sollte auch genutzt werden, wenn die Perlen nicht zu dauerhaften Anlagen zu stabilen Mikrotubuli bilden. Wir verwendeten einen Laserstrahl auf Perlen mit verschiedenen Protein-Konstrukte plu beschichtet erfassens-Ende-gerichteten Kinesin CENP-E und auf "Start", wie Perlen auf den segmentierten Mikrotubuli Wände (4E) 24. In Anwesenheit von ATP bewegen diese Perlen schnell (20-25 um / min) in Richtung der bedeckten Mikrotubuli Plusenden, auf einem Kymographion, wie Bewegung führt in der schrägen Linie in Richtung der Kappe (4F und 4G) gerichtet ist. Nachdem die Kappe zerstört wird, eine Perle mit dem abgeschnittenen CENP-E-Protein beschichtet löst sich von der Mikrotubuli (grüner Pfeil in Abb. 4F). Jedoch kann die Volllängen-Protein CENP-E Wulst Bewegung in der Rückwärtsrichtung zu erhalten, dh in Richtung auf die Minus-Ende von Mikrotubuli (Video 5). Als Ergebnis der kymograph für solche Perlen zeigt ein Zickzack-Muster, was die Anwesenheit von sowohl Plus-und Minus-Ende-Ende gerichteten Bewegung durch den mit voller Länge beschichteten Kügelchen und nicht abgeschnitten CENP-E. Wir erwarten, dass andere Mikrotubuli-abhängigen Motoren können ähnlich Motilität 5,13 ausstellen

Abbildung 1. Flusskammer für in-vitro-Studien mit segmentierten oder dynamischen Mikrotubuli. A. Schematische Darstellung eines segmentierten Mikrotubuli (MT). Stabile MT Samen werden mit Digoxigenin (DIG)-markierten Tubulin und GMPCPP vorbereitet, angebracht, um über Anti-DIG-Antikörper Deckglas. Die unspezifische Bindung von Tubulin und andere Proteine ​​mit Pluronic F127 blockiert. Mikrotubuli sind aus den Samen mit unmarkiertem GTP-Tubulin und erweitert, und diese Verlängerungen sind mit kurzen Segmenten, die Rhodamin markiert und GMPCPP Tubulin (rot) begrenzt. MT Plus-Ende (mit + gekennzeichnet) können in der Regel angezeigt werden(-). B und C aus einer viel kürzeren minus Ende unterschieden. Detaillierte Regelungen des modifizierten Flusskammer gleitet, mit aufrechten und inversen Mikroskopen. Sonic-Steckplätze sind in gelb dargestellt. Die Zahlen sind in Millimeter. D und E. Seitenansichten der modifizierten Objektträger (nicht maßstabsgetreu) mit angeschlossenen Rohre;. Dicken Pfeile zeigen Flüssigkeitsstrom durch die Rohre nach der die Kammern sind komplett montiert (nicht dargestellt) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 2. Herstellung von segmentierten Mikrotubuli und typische Proteinspitze-Tracking-Ergebnisse. A. Deckglas angebracht Mikrotubuli-Samen Visualisierungmit DIC-Optik (Schritt 4.8 des Protokolls) sierte, Pfeile weisen auf einige der Samen. Das Bild ist ein Durchschnitt von 10 Frames erworben sequenziell (100 ms Belichtung jeweils). B. Gleiche Mikroskop Feld nach Tubulin und GTP wurden für 8 min bei 32 ° C inkubiert werden Mikrotubuli gesehen aus den Samen (Schritt 5.2 des Protokolls). C ausgehen. Ein Pseudo-farbige Bild zeigt eine segmentierte Mikrotubuli an der DIC (grün) angezeigt und die Rhodamin-markierten stabilisierende Kappen (Pfeile) mit Epi-Fluoreszenz (rot). D angesehen. Gleiche Bild wie auf Platte C, aber mit einem größeren Sichtfeld. Einige Mikrotubuli-Rhodamin enthaltenden Fragmente, die in Schritt 5.2 des Protokolls spontane Keimbildung in der Lösung, sind auch (Pfeilspitzen). E gesehen. Kymograph der Dam1-GFP-Protein die Verfolgung der Demontage Mikrotubuli-Ende. Farbcodierte Balken auf der linken Seite zeigen eine Leuchtstoffkanal für den Erwerb des entsprechenden Abschnitts der kymograph verwendet. Vertschen fluoreszierende Linien werden durch die Dam1-GFP-Komplexe, die an die Mikrotubuli binden und Wand zeigen wenig Bewegung, bis das Ende kommt von Mikrotubuli. F. Kymograph als auf E, aber mit GFP-markierten Ndc80 Komplex 19. Zunächst wird Mikrotubuli gleichmäßig dekoriert, obwohl erhöhte GFP-Fluoreszenz wird am Ende nach bedeckten Rhodamin Anregung beobachtet. Diese Zunahme hängt von der löslichen Pool von Ndc80-GFP-Protein, aber die zugrunde liegende Mechanismus ist nicht bekannt. Nachdem die Kappe zerfällt, wird Mikrotubuli Verkürzung offensichtlich aber es gibt wenig Bereicherung der Fluoreszenz an der Mikrotubuli-Spitze, was auf einen Mangel an tip-Tracking-Systems. G. Entfernung von der Spitze-Tracking Dam1 Ort, um die Axonem, die Mikrotubuli-Nukleation in diesem Versuch 10 verwendet wurde, wurde mit MetaMorph Trackpunkte Drop-In gemessen. Die anfänglichen Helligkeit der beweglichen komplexen entspricht etwa 15 Untereinheiten: genug, um eine einzelne Dam1 Ring bilden. Die Helligkeit der the bewegen Komplex wurde auf die Intensität der Deck-Attached regungslos Fluoreszenzpunkte für Bleich korrigieren normalisiert. Horizontal Maßstabsbalken: Platten A, B, D (10 um), Paneele C, F, E (3 um). Vertikale Skala Bars:. 10 Sek. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

3. Quantitative Analyse von Fluoreszenzsignalen. A. Beispielbild des Mikroskops Feld mit Dam1 Alexa488-Komplexe gebunden unspezifisch an dem Deckfläche. Hinweis Heterogenität in Punkten Helligkeit und Unebenheiten der Beleuchtung. Maßstab ist 2 um. B. Quantitative Darstellung der gleiche Bild wie in A. C D. Normierte Bild von Feld A aufgetragen als Intensität Oberfläche mit Mathematica 9 (Wolfram Research). Beachten Sie, dass diese Oberfläche ist flacher als auf B und die Spitzen in der Höhe weniger heterogen. E. Beispiele für die Photoblei Kurven mit CENP-E-GFP-Protein erhalten. Die integrale Intensität jeder Punkt wurde gesammelt, normalisiert zu berücksichtigen, Unebenheiten der Beleuchtung nehmen und die Kurven wurden geglättet (durchschnittlich mit der Schiebefenster von 5 Punkten). Signale, die in der oberen Reihe wurden von der weiteren Analyse in Abschnitt 7.3.4 beschriebenen Gründen ausgeschlossen. Kurven wie die in der unteren Reihe gezeigt wurden weiter verarbeitet und genutzt werden, um ein Histogramm auf Platte F zu bauen, wie in den Abschnitten 7.3.4-7.3.5. F beschrieben ng>. Histogramm der integralen Intensitäten von 22 Bleich CENP-E-GFP-Punkte (insgesamt 1.900 Datenpunkte) gesammelt. Rote Linie ist passend mit äquidistanten Gauß-Funktion, 5 deutliche Spitzen zu sehen sind. Die integrale Intensität eines einzelnen GFP-Fluorophor aus diesem Histogramm bestimmt war (64,7 ± 1,1) x 10 4 G au. Typische Photobleaching-Kurve für Dam1-Alexa488, verarbeitet, wie in Protokoll 7.3.5 beschrieben. H. Histogramm der integralen Intensitäten von 48 Photobleaching Dam1 Alexa488-Punkten (insgesamt 1.548 Datenpunkte) gesammelt; 4 deutliche Spitzen zu sehen sind. Die integrale Intensität eines Alexa488-Molekül unter diesen Bedingungen war (17,4 ± 0,8) x 10 3 au Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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4. Illustration der Bewegungen der Mikrotubuli-assoziierten Perlen. A. Schematische Darstellung des Experiments mit Perlen mit Mikrotubuli-bindenden Proteinen beschichtet. Dicken Pfeile geben die Richtung der Mikrotubuli-Demontage. B. Maximale Intensitätsprojektion der DIC Bilder einer GFP-Dam1-beschichtete Kügelchen, die stabil mit einem segmentierten Mikrotubuli (basierend auf 26 Bilder) befestigt war. Wulst zeigte die bogenförmige Bewegung (Pfeil), was darauf hindeutet, dass es zu einer Mikrotubuli-orientiert sind, wie durch eine gestrichelte Linie. C gezeigt befestigt. Einzelbild der gleichen Kugel nach Platte B, aber während der Stufe 8.6 des Protokolls unmittelbar nach der Fluoreszenz Verschluss geöffnet wurde genommen. Der Pfeil zeigt auf die Leuchtstoffkappe in der Nähe des Wulstes angeordnet ist, aber auf der gegenüberliegenden Seite von der Mikrotubuli-Bindungsstelle. D. Eine maximale Intensitätsprojektion zeigt die Flugbahn der Kugel die Bewegung mit der disassembling Mikrotubuli. Das Bild wurde von 115 Frames werden vom Anfang der Bildgebung (beachten Sie die bogenförmige Projektion) und bis Wulst Detachement (Video 4). E erworben erstellt. Schematische Darstellung des Experiments mit Perlen mit Plus-End-gerichteten Kinesin CENP-E beschichtet. Die Wulst ist in Kontakt mit Mikrotubuli mit Laserfalle gebracht. Die Falle wird dann abgeschaltet und die beginnt Wulst Weg zu Mikrotubuli-Plus-Ende. Nachdem der Mikrotubuli-stabilisierenden Kappe entfernen und Mikrotubuli zerlegt, kehrt der Wulst die Richtung seiner Bewegung. F. Kymograph zeigt eine 0,5 um Perle mit abgeschnittenen X. beschichtet laevis CENP-E Kinesin Weg zu Mikrotubuli-Plus-Ende 24. Nach der Wulst reiste etwa 1 um, wurde fluoreszierenden Verschluss geöffnet (roter Balken) und die Stabilisierung Kappe sichtbar wurde (rote Pfeilspitze). Der Wulst plötzlich gelöst (grüne Pfeilspitze), vermutlich, wenn der Motor angetroffen die Verkürzung der Mikrotubuli Ende. G Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Video 1. Herstellung von segmentierten Mikrotubuli. Video zeigt DIC Bilder einer Mikroskopfeld während der Herstellung der segmentierten Mikrotubuli. Imaging beginnt, nachdem die Mikrotubuli-Samen haben bereits auf dem Deckglas angebracht. Kleine runde Punkte sind von Partikeln in unserer Vorbereitung der Anti-Digoxigenin-Antikörper gefunden. Nach Tubulin und GTP hinzugefügt werden, beginnen Mikrotubuli aus den Samen (Schritt 5.2) zu verlängern. Nachdem sie die gewünschte Länge (8-15 um) zu erreichen, wird die Lösung schnell ausgetauscht werden, um Rhodaminated Tubulin und GMPCPP einzuführen. Während des Austauschs, Mikrotubuli-Polymere Knick in der direction der Strömung, aber nachdem die Pumpe gestoppt wird sie davon ausgehen, die unstrained Orientierung. Während der folgenden "Capping" Bühne, beginnt einige Tubulin zu Mikrotubuli spontan und kleine Fragmente zu sehen sind schwimmende in der Kammer zu polymerisieren. Sie werden während der folgenden Wasch (Schritt 5.5), die auch entfernt alle löslichen Tubulin und Nukleotide entfernt. Während dieser Phasen einige Mikrotubuli nicht den robusten Kappen montieren, und wenn lösliche Tubulin wird abgewaschen sie schnell demontieren. Die bedeckten Mikrotubuli sind jedoch für mehrere Stunden stabil, wenn sie nicht beleuchtet sind, wenn Rhodamin ist begeistert, die Kappen fragmentiert werden, und die nicht begrenzten Mikrotubuli-Segmente werden ausgesetzt. Die Bilder wurden jeden zweiten erworben, spielte bei 30 fps.

Video 2. Entdecklungsgabel von segmentierten Mikrotubuli. Video zeigt einen vollständig zusammengebauten segmentierten Mikrotubuli über DIC, gefolgt von Fluoreszenz-Bilder von der gleichen Mikrotubuli über die Rhodamin-Filterwürfel. A brechts rot Segment am Ende der Mikrotubuli (Pfeil) bewegt sich im Lichtbogen und verblasst schnell durch Fotobleichen. Bilder bei 6 fps erworben und bei 10 fps gespielt.

Video 3. Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Ende. Eine segmentierte Mikrotubuli (MT) ist sichtbar, dank der Dekoration von GFP-markierten Dam1, die verschiedene Punkte (grün Bilder) bildet. Rhodamin-Fluoreszenz ist dann aufgeregt, und die rote Kappe sichtbar wird, bewegt sich in einem sanften Bogen am Ende des Mikrotubulus (rot-Bilder), der Rest des Mikrotubuli nicht sichtbar ist, weil die Tubulin wurde einge nur am Ende des Polymers. Die Kappe Bleichmittel schnell, beginnt zu bröckeln und die Leuchtstoffwürfel wird wieder auf GFP schaltet, gerade rechtzeitig, um den Beginn der Verkürzung der Mikrotubuli-Segment, das nicht über die Rhodaminated Tubulin und GMPCPP sehen. Wenn die Depolymerisation Ende Dam1 Punkte erreicht, wird das Ende der Mikrotubuli leuchtend grün. Anschließend wird ein grün fluoreszierennt Spot gesehen bewegt sich mit der Demontage der Mikrotubuli, illustrieren die prozessive tip-Tracking-Systems. Die Konzentration von 3 nM Dam1 war, Bilder wurden erworben und bei 0,4 fps gespielt. Maßstabsbalken 5 um.

Video 4. Bead-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden. Glasperle mit Dam1 beschichtet ist, in Reise in einem Bogen, der angibt, dass er angebunden an das Deckglas von einem Mikrotubuli ist. Wenn Rhodamin-Fluoreszenz angeregt wird, wird die rote Kappe distal von der Raupe gesehen und bewegen sich synchron mit dem Wulst der Bewegung (Bilder in rot). Bald beginnt der Wulst bewegt gerichtet, während die bogenförmige Bewegung in der Amplitude (4D) abnimmt. DIC Bilder wurden über Rhodamin-Filterwürfel alle 300 ms erworben und gespielt 6 fps; Perle ist 1 um, Maßstab 5 um.

Video 5. Kinesin-beschichtete Kügelchen bewegen bidirektional auf der segmentierten Mikrotubuli. Imaging beginnt nach dem Wulst-CoAten mit voller Länge CENP-E Kinesin wurde auf der Mikrotubuli (MT) Wand. Der Pfeil zeigt auf die Anfangsposition Wulst. Die Wulst ist zu sehen, weg von dem Pfeil, der Motor geht auf das Plus-Ende der Mikrotubuli. Bald nach der Plus-Endkappe ist beleuchtet (Pfeilspitze, rot-Bilder), beginnt die Raupe in die entgegengesetzte Richtung zu bewegen. Nur in voller Länge CENP-E Kinesin koppeln können Bewegung der Perle der Verkürzung der Mikrotubuli Ende. Beads mit abgeschnittenen CENP-E beschichtet ist, kann in Richtung des Plus-MT Ende zu bewegen, aber sie lösen bald nach der Mikrotubuli-Depolymerisation ausgelöst wird (vgl. Figuren 4F und 4G). DIC Bilder wurden alle 1 Sek. erworben und spielte bei 16 fps; Perle ist 0,5 um.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.