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Immunology and Infection

फ्लोरोसेंटली टैग किए गए वैक्सिनिया वायरस प्रोटीन की कुशल पीढ़ी के लिए कार्यप्रणाली

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/51151
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Medicine, Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science, University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

क्षणिक प्रमुख चयन की विधि का उपयोग करके फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए प्रोटीन को एक साथ व्यक्त करने वाले रीकॉम्बिनेंट वैक्सिनिया वायरस की पीढ़ी के लिए एक तेजी से और मॉड्यूलर प्रोटोकॉल यहां वर्णित है।

Abstract

फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ वायरल प्रोटीन की टैगिंग वायरस-मेजबान बातचीत की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक अपरिहार्य दृष्टिकोण साबित कर दिया है । वैक्सिनिया वायरस (VACV), चेचक के उन्मूलन में उपयोग किया जाने वाला लाइव टीका, विशेष रूप से अपने बड़े विरियन आकार और आसानी के कारण फ्लोरोसेंट लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी है जिसके साथ इसे जीनोम स्तर पर इंजीनियर किया जा सकता है। हम यहां पुनः संयोजन वायरस पैदा करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। वैसिनिया प्रतिकृति के दौरान लक्षित समरूप पुनर्संयोजन के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं का निर्धारण किया गया था, जो निर्माण उत्पादन के सरलीकरण की अनुमति देता है। इसने फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और मेटाबोलिक चयन के साथ क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) के गठबंधन को फ्लोरोसेंटी लेबल वायरल प्रोटीन के लिए एक तेजी से और मॉड्यूलर दृष्टिकोण प्रदान करने में सक्षम बनाया। फ्लोरोसेंट रीकॉम्बिनेंट वायरस की पीढ़ी को व्यवस्थित करके, हम वायरस की प्रतिकृति के दौरान होने वाले वायरस-होस्ट इंटरप्ले के कई पहलुओं के उन्नत इमेजिंग विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को सुविधाजनक बनाने में सक्षम हैं।

Introduction

वैक्सिनिया वायरस (VACV) प्रोटोइटिक पॉक्सवायरस है और चेचक के कारक एजेंट वेरिओला वायरस से अत्यधिक संबंधित है। ये दोनों वायरस ऑर्थोपॉक्स जीनस के सदस्य हैं जिसमें अन्य उल्लेखनीय रोगजनक जैसे मंकीपॉक्स और एक्रोमेलिया वायरस (माउसपॉक्स)1शामिल हैं। ऑर्थोपॉक्सवायरस में बड़े डबल-फंसे डीएनए जीनोम (180-220 केबी) होते हैं जो 200 के ऊपर की ओर अनुमानित खुले पढ़ने के फ्रेम2,3हैं। इन वायरसों की प्रतिकृति में पेरिन्यूक्लियर वायरस कारखाने का गठन शामिल है, जहां परिपक्व वायरस (एमवी) बनाए जाते हैं, और ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क जहां एमवी का एक सबसेट लिपटे वायरस (डब्ल्यूवी) (रॉबर्ट्स और स्मिथ4द्वारा समीक्षा) उत्पन्न करने के लिए दो अतिरिक्त झिल्ली प्राप्त करता है। आर्थोपॉक्स जीनोम उच्च मात्रा में आनुवंशिक पुनर्संयोजन के कारण आनुवंशिक हेरफेर के लिए अत्यधिक उत्तरदायी होते हैं जो वावी जीनोम प्रतिकृति की एक विशेषता है और वायरल डीएनए पॉलीमरेज5द्वारा मध्यस्थता की जाती है। पुनः संयोजन वायरस पैदा करना समरूप पुनर्संयोजन और रैखिक डीएनए अणुओं पर निर्भर करता है, जो समरूपता के साथ छोटे होते हैं क्योंकि 12 बीपी वैक्सिनिया वायरस संक्रमित कोशिकाओं में पुनर्संयोजन में मध्यस्थता करने के लिए पर्याप्त है6। वैक्सिनिया वायरस के फ्लोरोसेंट लेबलिंग से आर्थोपॉक्स कणों के बड़े आकार के कारण बेहद उज्ज्वल वायरस कण पैदा हो सकते हैं, जो प्रति वीरन7कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के समावेश की अनुमति देता है। Vaccinia विदेशी डीएनए 8 के बड़े टुकड़े ले जाने की क्षमता है औरइसके अलावा, कठोर कैप्सिड समरूपता की कमी लचीलापन की एक डिग्री की अनुमति हो सकती है जब उनके अंतर्जात loci9से वायरल प्रोटीन जीन संलयन व्यक्त । VACV प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग उपकोशिकीय स्तर पर मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन के लिए अमूल्य साबित हुई है, विशेष रूप से वायरस प्रवेश10,परिवहन11-13,और मॉर्मोजेनेसिस के क्षेत्र में, विशेष रूप से लिपटे हुए विरियंस7।

एक तनु विकास फेनोटाइप14,15,मेटाबोलिक चयन16-18,या मार्कर जीन की अभिव्यक्ति(जैसे एक्स-गल 19 या फ्लोरोसेंट प्रोटीन13,20)के बचाव से पुनः संयोजन वायरस का चयन किया जा सकता है। यहां हम फ्लोरोसेंट और मेटाबोलिक चयन के एक शक्तिशाली संयोजन का उपयोग कर फ्लोरोसेंट वायरस के चयन का वर्णन करते हैं। फॉल्कनर और मॉस (1 99 0)21द्वारा विकसित क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) वैक्टर, रुचि के वांछित फ्लोरोसेंटली टैग किए गए जीन के साथ मार्कर को एकीकृत करने की अनुमति देते हैं। जब मेटाबोलिक चयन को हटा दिया जाता है, तो एक माध्यमिक पुनर्संयोजन घटना हो सकती है जो चयन जीन को उत्पादित करती है, लेकिन फ्लोरोसेंटली टैग किए गए वायरस प्रोटीन को बरकरार छोड़ देती है। नीचे चित्रा 2 प्रायोगिक प्रक्रिया का अवलोकन प्रदान करता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चयन जीन एमसीएचरी और एस्चेरिचिया कोलाई ग्वानाइन फॉस्फोरिबोसाइलट्रांसफरेज(जीपीटी)जीन हैं, दोनों एक सिंथेटिक अर्ली/लेट वायरल प्रमोटर से व्यक्त किए गए हैं और पहले कॉर्डेरो एट अल द्वारा उपयोग किए जाते थे। 22 इसके अलावा, ब्याज के टैग किए गए फ्यूजन प्रोटीन का फ्लोरेसेंस है। जब मेटाबोलिक चयन को हटा दिया जाता है, तो चयन योग्य मार्कर(रीचेरी और जीपीटी)को उत्पादित किया जाता है, जिससे केवल टैग किए गए जीन का फ्लोरेसेंस होता है, जो सही पुनः संयोजन वायरस की पहचान की अनुमति देता है। चयन मार्कर का एक्सिक्शन कई फ्लोरोसेंट टैग को संयोजित करने की संभावना प्रदान करता है, जिससे हमें एक साथ कई वायरल प्रोटीन को फ्लोरोसेंटी लेबल करने की क्षमता के साथ वायरस बनाने में सक्षम बनाया जा सके। पिछले अध्ययनों ने6वैक्सिनिया वायरस संक्रमित कोशिकाओं में संक्रमित रैखिक और परिपत्र डीएनए अणुओं के वैक्सिनिया पुनर्संयोजन के लिए न्यूनतम होमोलॉजी आवश्यकताओं को निर्धारित किया है। हम वैसिनिया वायरल जीनोम में अपने समावेश के माध्यम से जीपीटी-mCherry टीडीएस वेक्टर में फ्लैंकिंग हथियारों की अलग-अलग होमोलॉजी लंबाई की पुनर्संयोजन क्षमता निर्धारित करना चाहते थे। यह निर्धारित किया गया था कि टीडीएस वेक्टर में 100 बीपी के मुताबिक़ क्षेत्र वीएसवी जीनोम में पुनर्संयोजन डीएनए के सम्मिलन को लक्षित करने औरमध्यस्थताकरने के लिए पर्याप्त हैं। जबकि छोटे होमोलॉजी लंबाई भी पुनर्संयोजन को सक्षम करेगी, 100 बीपी होमोलॉजी लंबाई ने पर्याप्त पुनर्संयोजन वायरस प्रदान किए जिन्हें मेटाबोलिक और फ्लोरोसेंट चयन के साथ आसानी से पहचाना जा सकता है। इस आकार के डीएनए टुकड़ों को अपेक्षाकृत कम लागत पर व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है और पुनर्संयोजन वायरस के निर्माण के लिए कई वैक्टर के उत्पादन की बहुत सुविधा प्रदान करता है। हमने फ्लैंकिंग क्षेत्रों के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के संश्लेषण की लागत को कम रखते हुए अधिक पुनर्संयोजन आवृत्ति प्रदान करने के लिए होमोलॉजी की लंबाई को 150 बीपी तक बढ़ाने का विकल्प चुना।

Protocol

1. रिकॉम्बिनेशन वेक्टर बनाना

  1. होमोलॉजी के 150 बीपी लंबे फ्लैंकिंग क्षेत्रों (बाएं और दाएं हथियारों के रूप में संदर्भित) की पहचान करें, जो या तो एन-या सी-मरणासन्न रूप से ब्याज के वायरल जीन को लेबल करने के लिए आवश्यक है (चित्रा 1bदेखें)।
  2. पसंद के प्रतिबंध स्थलों की एक जोड़ी द्वारा अलग 150 बीपी बाएं और दाएं हथियारों को शामिल करते हुए एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम डिजाइन करें। इस पूरे अनुक्रम को प्रतिबंध साइटों की एक दूसरी जोड़ी (पहली जोड़ी के लिए अलग) द्वारा भी फ्लैंक किया जाना चाहिए ताकि टीडीएस वेक्टर में एक बार संश्लेषित होने के बाद निगमन की अनुमति दी जा सके। प्रतिबंध साइटों के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन करते समय ध्यान रखें कि दृश्य वांछित प्रविष्टि साइट के साथ फ्रेम में हैं।
  3. संश्लेषण के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन करते समय बाएं और दाएं हथियारों के बीच में प्रतिबंध साइटों को शामिल करें, जो पसंद के फ्लोरोसेंट टैग के खुले पढ़ने के फ्रेम को फ्लैंक करने वालों से मेल खाने चाहिए (चित्रा 1bदेखें)। बाएं हाथ और फ्लोरोसेंट टैग की शुरुआत के बीच तीन अमीनो एसिड लिंकर के रूप में नोटी प्रतिबंध साइट का उपयोग करना संभव है।
  4. पीसीआर द्वारा फ्लोरोसेंट टैग के दोनों ओर इन्हीं प्रतिबंध साइटों को शामिल करें (चित्रा 1cदेखें)।
  5. टीडीएस वेक्टर में संश्लेषित टुकड़े का क्लोन करें।
  6. होमोलॉजी के बाएं और दाएं हाथ के क्षेत्रों के बीच में प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके परिणामस्वरूप पुनर्संयोजन वेक्टर में फ्लोरोसेंट टैग का क्लोन बनाएं (चित्रा 1dदेखें)।

2. रिकॉम्बिनेंट वायरस जनरेशन

  1. चित्रा 2 केअनुसार, सीरम-मुक्त मीडिया में वैकेंसी वायरस के साथ बीएस-सी-1 कोशिकाओं के मोनोलेयर को संक्रमण की बहुलता (एमओआई) > 1 पर संक्रमित करें ।
  2. 1 घंटे के बाद संक्रमण, Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के साथ बचाव कोशिकाओं और सीरम मुक्त मीडिया में 3:1 के अनुपात में पुनर्संयोजन वेक्टर प्लाज्मिड और ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के मिश्रण के साथ ट्रांसफेक्ट ।
  3. 24 घंटे के बाद, परिमार्जन और कोई भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त DMEM में कोशिकाओं को ठीक करने और खुले कोशिकाओं को तोड़ने और वायरस कणों को जारी करने के लिए तीन फ्रीज-गल चक्र प्रदर्शन करते हैं ।
  4. 10% एफबीएस डीएमईएम और जीपीटी चयन रिएजेंट्स माइकोफेनोलिक एसिड (25 माइक्रोग्राम/एमएल) और xanthine (250 μg/ml) के तरल ओवरले के साथ एक पट्टिका परख करें:
    1. बीएस-सी-1 कोशिकाओं के मोनोलेयर के साथ 6-वेल प्लेट बीज करें।
    2. अलग-अलग सजीले टुकड़े के पर्याप्त पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए वायरस कणों वाले फ्रीज-गल कोशिकाओं के सीरियल कमजोर पड़ने के साथ 100% कॉन्फ्ल्यूरेंट सेल मोनोलेयर को संक्रमित करें।
    3. लिक्विड 10% एफबीएस के साथ ओवरले जिसमें डीएमईएम होता है जिसमें जीपीटी सेलेक्शन रिएजेंट्स होते हैं-क्रमशः 25 माइक्रोग्राम/एमएल और २५० माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता पर माइकोफेनोलिक एसिड और जांथिन ।
  5. 24 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, तरल ओवरले को हटा दें और वायरस में टीडीएस वेक्टर से रीचेरी के समावेश के अनुरूप फैलाना लाल फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन करने वाले सजीले टुकड़े की तलाश करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। लक्ष्य जीन और चुने गए फ्लोरोसेंट टैग के आधार पर, टैग किए गए जीन का स्थानीयकृत फ्लोरेसेंस भी उसी लाल पट्टिका में देखा जा सकता है।
  6. एक पिपेट टिप के साथ स्थानीयकृत स्क्रैपिंग और 5% एफबीएस के 100 माइक्रोन द्वारा प्रत्येक पुनर्संयोजन वायरस के लिए कई सजीले टुकड़े चुनें जिसमें डीएमईएम शामिल हैं, जो कोशिकाओं को एक एपपेनडोर्फ ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं, इसके बाद स्क्रैप कोशिकाओं के फ्रीज-विगलन के तीन दौर पुनः संयोजन वायरस जारी करने के लिए।
  7. विकास मीडिया में जीपीटी चयन अभिकर्षकों के साथ पुनः संयोजन वायरस को बढ़ाने के लिए 12-अच्छी प्लेट में कोशिकाओं के मोनोलेयर में फ्रीज-गल वायरस युक्त डीएमईएम जोड़ें। सफल प्रवर्धन 24 घंटे के बाद संक्रमण परिमार्जन।
  8. लाल फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन करने वाले सफलतापूर्वक परिलक्षित सजीले टुकड़े की एक पट्टिका परख करें, इस बार एक एगर उठे ओवरले और जीपीटी चयन के साथ, इस प्रकार:
    1. बीएस-सी-1 कोशिकाओं के मोनोलेयर के साथ 6-वेल प्लेट बीज करें।
    2. एफबीएस मुक्त डीएमईएम में वायरस के बढ़ते कमजोर पड़ने के साथ पुनः संयोजन वायरस और संक्रमित कुओं का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
    3. 1 घंटे के बाद संक्रमण, तरल मीडिया को हटाने और ०.५% के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ओवरले न्यूनतम आवश्यक माध्यम (MEM) में २.५% FBS, २९२ μg/ml एल-ग्लूटामाइन, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन और १०० μg/ml स्ट्रेप्टोमीसिन, GPT चयन reagents के साथ ।
  9. 2-3 दिन के बाद संक्रमण, फ्लोरेसेंस प्रदर्शित सजीले टुकड़े उठाओ कि दोनों लाल और चुना फ्लोरोसेंट टैग का रंग फिर से बढ़ाना है, कोई GPT चयन के साथ इस बार ।
  10. कोई चयन के साथ एक agarose ओवरले के साथ अगले पट्टिका परख प्रदर्शन करते हैं।
  11. सजीले टुकड़े उठाओ कि उनके फैलाना लाल फ्लोरेसेंस खो दिया है, लेकिन पसंद के टैग के अनुरूप स्थानीयकृत फ्लोरेसेंस बनाए रखने ।
  12. पुनर्संयोजन वायरस है कि mCherry और gpt चयन जीन खो दिया है, लेकिन चुना टैग के अनुरूप स्थानीयकृत फ्लोरेसेंस बनाए रखने के एक शुद्ध स्टॉक प्राप्त करने के लिए कोई चयन के साथ शुद्ध पट्टिका जारी रखें । चेक स्टॉक पट्टिका परख से शुद्ध हैं, सभी सजीले टुकड़े एक समान पट्टिका फेनोटाइप होना चाहिए।
  13. वायरल स्टॉक शुद्ध हैं सुनिश्चित करने के लिए जीनोमिक डीएनए की पीसीआर स्क्रीनिंग का उपयोग करें।
    1. डिजाइन प्राइमर जो फ्लोरोसेंट जीन प्रविष्टि साइट और प्राइमर को फ्लैंक करते हैं जो डाला फ्लोरोसेंट जीन को ही बढ़ाते हैं। इन प्राइमर के विभिन्न संयोजन पीसीआर एम्प्लिकोन का उत्पादन करेंगे जो जीन प्रविष्टि का पता लगाएगा और शुद्धता का संकेत देगा।
    2. वायरल स्टॉक को बढ़ाकर पीसीआर बीएस-सी-1 कोशिकाओं के 12-वेल प्लेट मोनोलेयर के एक कुएं में जांच की जाएगी।
    3. 24 घंटे बाद संक्रमण, डीएमईएम के 250 माइक्रोन में संक्रमित कोशिकाओं को परिमार्जन करें।
    4. सेंट्रलाइज संक्रमित कोशिकाएं (10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 18,000 x ग्राम), 500 माइक्रोन ते (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल और 1 एमएम ईडीटीए, पीएच 8) में 0.1% (v/v) एसडीएस के साथ सुपरनैंट और रिसिपेंड सेल पेलेट को हटा दें। कोशिकाओं को lyse करने के लिए भंवर।
    5. मिश्रण करने के लिए उलटा, 500 माइक्रोनल फिनोल-क्लोरोफॉर्म-आइसोअमिल एकोल डालें। सेंट्रलाइज (4 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 18,000 x ग्राम)। सुपरनेट लें और दोहराएं।
    6. मिश्रण करने के लिए उलटा 1 मिलीलीटर 100% इथेनॉल (ठंडा) और 50 माइक्रोन सोडियम एसीटेट जोड़कर सुपरनैंट पर इथेनॉल वर्षा करें।
    7. 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस रात या -80 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें। सेंट्रलाइज (30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 18,000 x ग्राम), सभी तरल को हटा दें और उपजी डीएनए को हवा सूखने दें। 50 माइक्रोन ते में पुनर्सुस्ल।
    8. जीनोमिक डीएनए पीसीआर स्क्रीनिंग के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इसका उपयोग करें।

3. एक से अधिक टैग ले जाने वाले रिकॉम्बिनेंट वायरस की पीढ़ी

  1. एक अलग टैग के साथ डबल या ट्रिपल लेबल वाले वायरस या प्रोटोकॉल 1 से दोहराने की प्रक्रिया बनाने के लिए फ्लोरोसेंट रिकॉम्बिनेंट वायरस के साथ एक ही सेल मोनोलेयर को कॉइनफेक्ट करें।
  2. वायरस की पट्टिका फेनोटाइप या पीसीआर स्क्रीनिंग के आधार पर वायरस को शुद्ध करें जीनोमिक डीएनए को अलग करें।

Representative Results

चित्रा 1 इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक विभिन्न निर्माणों को सूचीबद्ध करता है, जो या तो संश्लेषित(आंकड़े 1b और 1c)हैं या क्लोनिंग चरणों(चित्रा 1d)द्वारा बनाए गए हैं। चित्रा 2 चयन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के लिए चित्रित A3-GFP रिकॉम्बिनेंट VACV के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट पट्टिका छवियों के साथ प्रयोगात्मक प्रक्रिया की एक रूपरेखा प्रदान करता है। चित्रा 3में, वायरल स्ट्रक्चरल प्रोटीन ए 3 और एफ 13 पर लक्षित फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग किए गए प्रोटीन को व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन वैसिनिया वायरस दिखाए जाते हैं, जो क्रमशः आंतरिक वायरस कोर23 और बाहरी लिफाफे24का हिस्सा हैं। बनाए गए प्रत्येक रिकॉम्बिनेंट वायरस के लिए वायरल सजीले टुकड़े और संक्रमित कोशिकाओं की टिप्पणियों को चित्रित किया गया है। VACV जीनोम के साथ वैक्टर के अनुरूप पुनर्संयोजन की दक्षता, जिसमें होमोलॉजी के 70 बीपी क्षेत्रों के रूप में कम होते हैं, का परीक्षण किया गया था और परिणाम चित्र 4में चित्रित किए गए हैं। १०० बीपी होमोलॉजी युक्त वैक्टर के साथ पुनर्संयोजन से बने वायरल सजीले टुकड़े की पहचान करने की सापेक्ष सफलता लक्ष्य जीन के लिए १५० बीपी लंबाई छोड़ दिया और होमोलॉजी के सही हथियारों को संश्लेषित करने के लिए चुनने के पीछे तर्क था ।

Figure 1
चित्रा 1. क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) पुनर्संयोजन वेक्टर। }जीपीटी और एमसीएचरी सेलेक्शन मार्कर के साथ टीडीएस वेक्टर। (ख)होमोलॉजी के बाएं और दाएं हथियारों को होमोलॉजी के हथियारों के बीच में विशिष्ट प्रतिबंध स्थलों के साथ डिजाइन किया गया है और फ्लैंकिंग की जाती है । इस विधि में उपयोग किए जाने वाले बाएं और दाएं हथियारों के बीच प्रतिबंध स्थल नोटी और बाम्ही थे, नोटी साइट को जीन और फ्लोरोसेंट टैग के बीच एक लिंकर के रूप में भी इस्तेमाल किया जा रहा था। (ग)फ्लोरोसेंट टैग इस विधि के साथ संगत इसी प्रतिबंध साइटों द्वारा फ्लैंक किए जाते हैं। नियोजित कुछ टैग जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन), आरएफपी (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन), सेरूलन (ईसीएफपी पर एक सुधार, एक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन, साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस25)और मिनी-एसओजी, जीएफपी से इंजीनियर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं जो रोशनी26पर EM द्वारा हल करने योग्य उत्पाद बनाता है। (घ)अंतिम टीडीएस पुनर्संयोजन वेक्टर की पीढ़ी में शामिल क्लोनिंग कदम । बाएं और दाएं फ्लैंकिंग आर्म्स युक्त संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को पहले टीडीएस वेक्टर में क्लोन किया जाता है। यह एक पुनर्संयोजन वेक्टर प्रदान करता है जिसमें पसंद के किसी भी टैग को बाएं और दाएं हथियारों के बीच में शामिल प्रतिबंध साइटों में क्लोनिंग करके और बाहर शटल किया जा सकता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। एक पुनः संयोजन vaccinia वायरस बनाने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा। आनुवंशिक और सेलुलर स्तरों पर होने वाली घटनाओं को चित्रित किया गया है, साथ ही प्रतिनिधि पट्टिका छवियों के साथ A3-GFP-लेबल फ्लोरोसेंट vaccinia वायरस के निर्माण के बाद कदम रूपरेखा । (A)वैक्सिनिया वायरस से संक्रमित कोशिकाएं टीडीएस रिकॉम्बिनेशन वेक्टर से संक्रमित होती हैं। (ख)इस आंकड़े में केवल बाएं हाथ के पुनर्संयोजन के परिणाम को दर्शाया गया है और उदाहरण जीएफपी को पसंद के फ्लोरोसेंट टैग के रूप में उपयोग करता है । दाएं हाथ के पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप पूरे टीडीएस प्लाज्मिड को इसी तरह जीनोम में शामिल किया जाएगा, सिवाय टैग को मध्यवर्ती चरण में पूरे लक्ष्य जीन के लिए जोड़ा जाएगा, यानी चरण सी । एक पट्टिका परख पुनर्संयोजन मिश्रण के साथ एक सेल मोनोलेयर पर किया जाता है और जीपीटी चयन के अधीन होता है। (ग)क्रमशः रीचेरी और जीएफपी अभिव्यक्ति के अनुरूप लाल और हरे रंग की फ्लोरेसेंस दोनों का प्रदर्शन करने वाले सजीले टुकड़े चुने और परिलक्षित होते हैं । एक बार चयन हटा दिया जाता है, वहां लाल फ्लोरेसेंस की हानि gpt और mCherry जीन(डी)के नुकसान के अनुरूप होगा और विशेष रूप से हरी फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन सजीले टुकड़े उठाया और परिलक्षित(ई)। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3। टीडीएस पुनर्संयोजन प्रणाली के प्रतिनिधि परिणाम। छवियां 48 घंटे(ए, सी,ई, स्केल बार 100 माइक्रोन) के बाद पुनः संयोजन VACV संक्रमित कोशिकाओं की पूरी सजीले टुकड़े को दर्शातीहैं, 8 घंटे के बाद इसी रीकॉम्बिनेंट वायरस से संक्रमित एकल कोशिका की छवि के साथ(बी, डी, एफ,स्केल बार 10 माइक्रोन)। विषाणु कणों की कल्पना करने के लिए विषाणु-स्थानीयकृत प्रोटीन के अनुरूप जीन का चयन किया गया । ए 3 एक वायरल लिफाफा प्रोटीन है, जो वैक्सिनिया विरशन(ए, बी)का एक कोर प्रोटीन है और एफ 13(सी, डी)एक वायरल लिफाफा प्रोटीन है। फ्लोरोसेंटी लेबल वाले एक डबल-टैग वायरस को A3 और F13(ई, एफ)भी दिखाया गया है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. पुनर्संयोजन वैक्टर और वीएसवी जीनोम के बीच पुनर्संयोजन क्षमता का मात्रात्मक विश्लेषण। बीएस-सी-1 मोनोलेयर VACV से संक्रमित थे और 1 घंटे के बाद संक्रमण संक्रमित तीन पुनर्संयोजन वैक्टर या तो ५०० बीपी, १०० बीपी, या ७० बीपी VACV जीनोम के होमोलॉजी के क्षेत्रों युक्त के साथ । प्रत्येक वेक्टर में टीडीएस कैसेट भी शामिल था जिसमें जीपीटी और एमसीएचरी चयन जीन शामिल थे। कोशिकाओं को 24 घंटे बाद संक्रमण बरामद किया गया और उभरा वायरस जारी करने के लिए lysed । प्लेक परख जीपीटी चयन मीडिया के साथ सेल lysates पर प्रदर्शन किया गया और mCherry फ्लोरेसेंस दिखा सजीले टुकड़े सफल recombinants के रूप में गिना गया । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5। जीपीटी-एमएचरी टीडीएस वेक्टर का नक्शा जिसमें मल्टीपल क्लोनिंग साइट दिखाई गई है। वेक्टर को पहले22 बताया गया है और वेक्टर मैप झांग लैब ग्रुप (एससीयू) से ईज़ी प्लाज्मिड मैप v1.9 की मदद से बनाया गया था । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह तकनीक पुनः संयोजन वायरस के निर्माण के लिए एक कुशल और मॉड्यूलर प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जो फ्लोरोसेंट रूप से वायरल प्रोटीन को टैग करता है। विधि यह सुनिश्चित करती है कि वायरल जीनोम में एकमात्र परिवर्तन टैग या मार्कर के अलावा है, जो कोई चयन मार्कर को पीछे नहीं छोड़ता है। समरूप पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक छोटी बांह की लंबाई इसके प्रत्यक्ष संश्लेषण को सक्षम बनाती है, जो पीसीआर और क्लोनिंग के कई समय लेने वाले दौर को नष्ट करती है, जबकि रीचेरी और मेटाबोलिक जीपीटी चयन की फ्लोरेसेंस का उपयोग वायरल पुनर्संयोजन मध्यवर्ती को अलग करने के लिए किया जाता है। इन मध्यवर्ती हल किया जा सकता है, चयन को हटाने के बाद, एक टैग जीन के साथ एक वायरस के लिए या माता पिता के प्रकार के लिए वापस । फ्लोरोसेंट और मेटाबोलिक चयन दोनों के उपयोग को शामिल करने वाली एक समान विधि को पहले27 वर्णित किया गया है, हालांकि इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली विधि होमोलॉजी के छोटे, संश्लेषित क्षेत्रों का उपयोग करती है, जिससे ब्याज के टैग किए गए जीन के फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा वांछित पुनर्संयोजन वायरस की पहचान की अनुमति मिलती है। यह द्वितीयक चयन केवल अत्यधिक व्यक्त वायरल जीन को टैग करने के लिए लागू होता है जो पट्टिका परख में पर्याप्त फ्लोरेसेंस का उत्पादन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोई भी एक पूर्ण अभिव्यक्ति कैसेट के सम्मिलन की परिकल्पना कर सकता है, उदाहरण के लिए एक मजबूत वायरल प्रमोटर के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन। इस मामले में बाएं और दाएं हथियार वायरल जीन को टैग करने के बजाय प्रविष्टि के बिंदु को परिभाषित करेंगे।

कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो प्रायोगिक प्रक्रिया के दौरान सहायक साबित हुए। ऊपर वर्णित चरण २.३.३ में तरल ओवरले लाल/हरे फ्लोरोसेंट सजीले टुकड़े का पता लगाने और अलगाव के लिए महत्वपूर्ण साबित हुआ । हमारा मानना है कि जीपीटी चयन अभिकर्षकों और एगरेंग ओवरले के संयोजन ने पुनर्संयोजन वायरस के विकास को विचलित कर दिया और इसलिए ट्रांसफैक्शन के बाद वायरस को बढ़ाने के पहले कदम के लिए तरल ओवरले में बदल दिया। संवर्धन और शुद्धिकरण के लिए स्थानीय टैग रंग फ्लोरेसेंस दिखा फ्लोरोसेंट सजीले टुकड़े चुनना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि बाएं हाथ के पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप मध्यवर्ती को सजीले टुकड़े में मनाया जाता है यदि बाएं हाथ में भी प्रमोटर अनुक्रम होता है। टीडीएस वेक्टर में एमसीएचरी मार्कर जीन को जीएफपीद्वारा भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट टैग के रूप में रीचेरी के आसान समावेश और चयन के लिए अनुमति देने के लिए।

ऊपर वर्णित कुछ तकनीकें पुनर्संयोजन वैक्सिनिया वायरस बनाने के स्थापित तरीकों से थोड़ी भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, पुनर्संयोजन बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले वायरस का एमओआई सामान्य रूप से 128से कम होता है, हालांकि इस विधि द्वारा पुनर्संयोजन वैक्सिनिया वायरस के निर्माण के लिए उच्च एमओआई का उपयोग पर्याप्त रहा है। जीपीटी चयन अभिकर्मकों के उपयोग के लिए आम तौर पर चयन अभिकर्मक18के साथ कोशिकाओं के पूर्वकरण की आवश्यकता होती है, हालांकि उन्हें बचाव चरण के दौरान जोड़ने के बाद संक्रमण अभी भी वांछित पुनर्संयोजन का पर्याप्त चयन प्रदान किया, विशेष रूप से फ्लोरोसेंट चयन मार्कर की उपस्थिति के कारण भी।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इस तकनीक की सीमाओं में से एक यह है कि माध्यमिक फ्लोरेसेंस चयन कदम ब्याज के टैग किए गए प्रोटीन पर निर्भर करता है, एक स्तर पर जो पट्टिका परख में आंखों द्वारा इसका पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके बिना, वायरस को शुद्ध करना संभव होगा जो केवल रीचेरी फ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं, जिनमें से कम से कम 50% वांछित पुनर्संयोजन वायरस होते हैं, जिन्हें ऊपर चरण 2.12 में वर्णित पीसीआर जैसी आणविक रणनीतियों द्वारा पहचाना जा सकता है। एक और सीमा उनके टैगिंग के परिणामस्वरूप कुछ प्रोटीन की निष्क्रियता हो सकती है। फ्लोरोसेंट टैग म्यूटेशन से गुजरना या समय के साथ पासएजिंग के साथ recombinant वायरस द्वारा excised हो सकता है । इसलिए माइक्रोस्कोपी और पीसीआर द्वारा रिकॉम्बिनेंट वायरस स्टॉक के नियमित सैंपलिंग की सिफारिश की जाती है। अंत में, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की संख्या की एक सीमा हो सकती है जिसे एक ही वायरस में शामिल किया जा सकता है। इसका एक पहलू उन सभी को एक साथ कल्पना करने की क्षमता है; उपलब्ध फ्लोरोसेंट टैग के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की ओवरलैपिंग प्रकृति को देखते हुए, न्यूनतम स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ् माध्यम से सुनिश्चित करने के लिए उन्हें सावधानीपूर्वक चुनना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जीएफपी और सेरूलन जैसे बारीकी से संबंधित टैग का उपयोग करने से दोनों के बीच पुनर्संयोजन की संभावना खुल ती है, जो पुनर्संयोजन जीनोम में उनके स्थानों पर निर्भर करता है।

इस तकनीक की मॉड्यूलर प्रकृति अन्य धुंधला और/या टैग विकल्पों के साथ अनुकूलता के आधार पर फ्लोरोसेंट टैग के सरल प्रतिस्थापन को सक्षम बनाती है । चुनिंदा मार्कर को उत्तेजित करके, टीडीएस विधि विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के धारावाहिक को जोडऩे या फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए टीडीएस आधारित जीन विलोपन के साथ टीडीएस आधारित टैगिंग के संयोजन के लिए अनुमति देती है29का विश्लेषण करती है। इस दृष्टिकोण की उपयोगिता के लिए एक उदाहरण के रूप में, एक डबल-टैग फ्लोरोसेंट वायरस जो वायरस कोर और डब्ल्यूवी झिल्ली को लेबल करता है। इस वायरस के साथ इमेजिंग अध्ययन वायरस प्रतिकृति के दौरान आंदोलन, मॉर्फोजेनेसिस और वायरस के लपेटन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अभी तक अस्वाभावित vaccinia वायरल प्रोटीन भी टैग किया जा सकता है और इस तकनीक से अध्ययन किया ।

वायरस की कई विशेषताओं के कारण वैक्सिनिया वायरस का बड़े पैमाने पर इमेजिंग अध्ययनों में उपयोग किया गया है जो लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के अनुकूल हैं। फ्लोरोसेंट टैग वायरल जीनोम से व्यक्त किए जाते हैं, जिससे ट्रांसफैक्शन की आवश्यकता को समाप्त किया जाता है, जिससे संक्रमित जानवरों या गैर-संक्रमण कोशिकाओं से प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं को आसानी से विश्लेषण किया जा सके। प्रारंभ में, फ्लोरोसेंट VACVs का उपयोग वायरस आंदोलन30के सरल उपकोशिकीय ट्रैकिंग के लिए किया गया था, लेकिन हाल के दृष्टिकोणों में एफपीटी अध्ययन31,एकल वायरस कणों पर एफईआरपी32,प्रमोटर रिपोर्टर्स33,इंट्राविटल इमेजिंग34और संरचनात्मक अध्ययन35-37शामिल हैं। इन सभी तकनीकों को आसान और करीब पहुंच के भीतर हो सकता है फिर से संयोजन फ्लोरोसेंट वायरस बनाने की इस विधि के साथ मिलकर ।

Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल फेडरेशन डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट #1096623 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311  
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)  

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 83 वैक्सिनिया वायरस फ्लोरोसेंट प्रोटीन रीकॉम्बिनेंट वायरस क्षणिक प्रमुख चयन इमेजिंग उपकोशिकीय परिवहन
फ्लोरोसेंटली टैग किए गए वैक्सिनिया वायरस प्रोटीन की कुशल पीढ़ी के लिए कार्यप्रणाली
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Marzook, N. B., Procter, D. J.,… More

Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).

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