Methodenartikel

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

DOI:

10.3791/51154

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15. April 2014

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1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Transplantation von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) hält große Versprechungen in der regenerativen Neurologie. Die systemische Verabreichung von NPCs ist in effektive, invasiv und therapeutisch sehr wirksam Protokoll wandte sich Stammzellen im Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems betroffen zu liefern.

Zusammenfassung

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Neuronale Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) sind eine vielversprechende Quelle für die Stammzelltransplantation Ansätze mit dem Ziel Gehirn Reparatur oder Wiederherstellung in der regenerativen Neurologie. Diese Richtlinie wurde von der umfangreichen Beweise dafür, dass Gehirn Reparatur nach fokaler oder systemische NPC Transplantation in mehreren präklinischen Modellen von neurologischen Erkrankungen erreicht entstanden.

Diese experimentellen Daten wurden die Zellabgabe Route als eine der wichtigsten Hürden der restaurativen Stammzellen Therapien für Erkrankungen des Gehirns, die dringende Beurteilung erfordert identifiziert. DruckmessungVentrikuläre Stammzellentransplantation stellt einen logischen Ansatz zu diesen Pathologien gekennzeichnet durch isolierte und zugänglich Hirnläsionen wie Rückenmarksverletzungen und der Parkinson-Krankheit. Leider ist dieses Prinzip schlecht für Zustände, die durch eine multifokale, entzündliche und verbreitet (sowohl in Zeit und Raum) Art, einschließlich multipler Sklerose (MS). Als solche Gehirn-Targeting durch systemic NPC Lieferung hat sich zu einem niedrigen invasive und therapeutisch wirksame Protokoll zu den Zellen in das Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems (ZNS) betroffen zu liefern.

Dieses alternative Verfahren der Zellabgabe beruht auf der NPC pathotropism, insbesondere ihre angeborene Fähigkeit, (i) Erfassen der Umwelt über funktionelle Zelladhäsionsmoleküle und inflammatorische Zytokin und Chemokin-Rezeptoren; (Ii) überqueren Sie die undichte anatomische Barrieren nach intravenöser (iv.) Oder intracerebroventricular (ICV) Injektion; (Iii) sammeln sich an der Höhe des perivaskulären mehreren Stelle (n) von entzündlichen Hirn-und Rückenmarksverletzungen; und (iv) ausüben bemerkenswerte trophischen Gewebe-und Immun regulatorische Effekte auf verschiedenen Host-Zielzellen in vivo.

Hier beschreiben wir die Methoden, die wir für die iv entwickelt. und <em> ICV Lieferung von syngenen NPCs in Mäusen mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), als Modell der chronischen entzündlichen ZNS-Demyelinisierung und sehen die systemische Stammzell Lieferung als wertvolle Technik für die selektive Ausrichtung der entzündeten Gehirn in der regenerativen Neurologie.

Einleitung

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Starke Beweise von in vivo-Studien zur Bestätigung der therapeutischen Wirksamkeit der Transplantation von neuralen somatischen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPC) in Tiermodellen für Erkrankungen des ZNS 1-8 entstanden ist. Dennoch, eine Reihe von Fragen im Zusammenhang mit der Lieferung von Stammzellen in das Wirts erfordern eine sorgfältige Überlegung, bevor diese experimentellen Ergebnisse in klinische Anwendungen umgesetzt werden. Eine besonders erhebliche Hürde für die Entwicklung der (nicht-hämatopoetischen) Stammzellen restaurative Therapien für multifokale, chronisch-entzündliche Erkrankungen des Gehirns ist die Identifizierung der idealen Route der NPC-Injektion. Ein Unternehmen Verständnis der Pathophysiologie der Zielerkrankung (fokale oder multifokale; primäre entzündliche oder degenerative) und einer vorsichtigen Analyse der Machbarkeit und Risikofragen mit den Liefer Techniken verbunden sind, sind bei der Ermittlung der optimalen Protokoll für die Stammzell Lieferung.

Während der Schwerpunkt ( ZB. in das Nervensystem Parenchym) Stammzell-Transplantation ist ein logischer Ansatz für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen, die durch räumlich begrenzten Bereichen von Schäden (z. B. Parkinson-und Huntington-Krankheit, Gehirn und Rückenmark traumatische Verletzungen und Schlaganfall), kann die gleichen Ansatz zu beweisen unter Bedingungen, wie MS, wo eine multifokale, chronische und räumlich verbreitet ZNS-Schädigung akkumuliert im Laufe der Zeit praktisch nicht durchführbar. In diesem letzteren Fall wird Targeting Brennzellinjektionen an einzelne Läsionen auch durch die begrenzte Fähigkeit der transplantierten NPC gehinderte lange Strecken innerhalb des ZNS wandern über Parenchym, so veranlasst die Identifizierung von alternativen, geeigneten Methoden von ZNS-Targeting mit weniger invasiven NPC Transplantationen .

Große Versprechen, entstand aus den Beobachtungen, die NPCs Ziel eine intrakranielle Tumor (z. B.. Gliom) bei Mäusen, wenn außerhalb der CNS9 intravasal injiziert. Nach dieser bahnbrechendenIn-vivo-Nachweis der Stammzellen pathotrophism 10, umfangreiche Daten akkumuliert worden sind in Bezug auf die Machbarkeit und die therapeutische Wirksamkeit des systemischen Transplantation von NSC in Labortieren mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Modell für entzündliche ZNS-Schädigung, entweder über intravenöse (iv) oder intracerebroventricular (ICV). NPC Injektion 1,2,5,6,8 .. Wir haben zuerst gezeigt, dass dies abhängig von der Fähigkeit der transplantierten NPCs zum Ziel und geben Sie die entzündeten ZNS, und anschließend mehrere inter engagieren Kommunikationsprogramme in spezifischen Mikroumgebung in vivo 11. Um speziell auf die ZNS, NPCs sind direkt in die Rückenmarksflüssigkeit (CSF) Zirkulation durch icv Injektion oder in die Blutbahn über iv Injektion verabreicht. Nach Eingabe entweder die Blutbahn oder CSF, transplantiert NPCs interagieren aktiv mitdie Blut-Hirn-(BBB) ​​oder Blut Liquor (BCSFB) Barrieren und geben Sie die ZNS-Parenchym. Diese Wechselwirkung zwischen dem Transplantat und der NPC BBB (oder BCSFB) von bestimmten Satz von NPC Oberfläche Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) geregelt und durch die Expression von großen Mengen von CAM Gegenliganden auf aktivierten Endothelzellen / Ependymzellen 12-14 erleichtert. Beispiele für diese Nocken umfassen, die den Rezeptor für Hyaluronat, CD44, und die interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 Ligand sehr späten Antigens (VLA) -4 5,15,16 (dh, in Leukozyten, sind verantwortlich für die Interaktion mit aktivierten Ependymzellen und Endothelzellen), und zu einem viel geringeren Ausmaß Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen (LFA) -1 und P-Selektin-Glykoprotein-Liganden (PSGL) -1. NPCs eine breite Palette von Chemokin-Rezeptoren, einschließlich CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 und CXCR4 Ausdruck auch (aber nicht ausdrücken, CCR3 und CCR7), die funktionell aktiv sind, sowohl in vitro als auch in vivo 5,16. So SYSTEMICALLY injiziert NSC verwenden diese Nocken, zusammen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), die auf Ebene des entzündeten ZNS ansammeln. Umgekehrt injiziert NPCs systemisch in gesunden Mäusen nicht in das ZNS über vaskuläre oder Zerebrospinalflüssigkeit Platz zwei Routen. CNS-Entzündung, oder Endothelzellen / ependymalen Zellaktivierung nach einer systemischen Cytokin oder lypopolisaccharide (LPS) Injektion als Modell für chemisch induzierte Enzephalitis, ist daher für die Akkumulation von systemisch injiziert NSC in das Gehirn und das Rückenmark 2 erforderlich. So erfolgreich Targeting des ZNS mit systemischen Therapien NPC abhängig von der Identifikation eines krankheitsspezifischen Zeitfenster (woo) in das Gehirn und das Rückenmark Umwelt sind förderlich für die Akkumulation und die transendotheliale Migration von NSC. Solche Bedingungen entstehen in der Regel im Rahmen der akuten und subakuten Entzündungs ​​17. Sobald er die CNS eingegeben, transplantierten undifferenzierten NPCsEs ist gezeigt worden, um die klinisch-pathologischen Merkmale von Mäusen als auch größere, nicht-menschlichen Primaten, die mit EAE verbessern. Dies wurde beschrieben abhängig von minimalen Zellenwechsel 2 und bemerkenswerte Sekretion von immunregulatorische und neuroprotektive parakrine Faktoren innerhalb perivaskuläre CNS 2,5,6,18 vs nicht-entzündeten Bereichen ZNS 19,20 (zB Lymphknoten) in Reaktion auf das zu sein, Entzündungszellsignalisierung durch Infiltration Immunzellen 5 ausgelöst.

Hier beschreiben wir die wichtigsten methodischen Aspekte der systemischen Injektion von somatischen NPCs in einem Mausmodell der chronischen EAE. Genauer gesagt, definieren wir die Protokolle, die wir haben, um (i) gegründet ableiten, erweitern und die Vorbereitungen für die Transplantation somatischer NPCs aus dem Subventrikularzone (SVZ) der erwachsenen C57BL / 6 Mäusen; (Ii) induziert chronische EAE in solchen Mäusen und (iii) durchzuführen therapeutisch wirksame systemische (iv oder ICV) NPC Transplantation into EAE Mäusen.

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Protokoll

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Alle Verfahren, die Tiere werden nach den Prinzipien der Labortierhaltung von der britischen Home Office unter den Tieren (wissenschaftlichen Verfahren) zugelassen geführt Act 1986 (PPL Nr. 80/2457 zur SP).

1. Ableitung von Somatic Neural Stem / Progenitor Cells (NPCs) aus dem Subventrikularzone (SVZ) der Gehirn erwachsener Mäuse

  1. Vorbereitung der Präparation Instrumente und Medien
    Hinweis: Diese beiden Lösungen müssen bereit sein 1-2 Std. vor Dissektionen Instrumente sind bereit und bei 37 º C mindestens 20-30 min vorgewärmt vor der Verwendung (es hilft, Papain verdünnen und optimiert die Enzymaktivität).
    1. Autoklav einer geraden scharfen Schere, eine kleine chirurgische Schere und zwei kleinen gebogenen Pinzette gezackt.
    2. "Verdauung"-Lösung: Bereiten Sie zwei separate 50-ml-Röhrchen mit:
      Lösung 1: 25 ml Balanced Salt Solution (EBSS) + 10 mg Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) + 10 mg L-Cystein Earles;und
      Lösung 2: 25 ml EBSS + 50 mg Papain.
    3. Vorzubereiten, Complete Growth Medium "(CGM): alle Maus-Basalmedium mit Maus-Proliferationsergänzungen, Heparin 0,002%, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 10 ng / ml), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 20 ng / ml) und Antibiotika (Pen / Strep).
  2. Gehirn-Dissektion
    NB: Die Entfernung der Schläfenbeine können leicht wegen ihrer Schärfe schädigen das Gewebe. Um dies zu vermeiden, sichern die Knochen fest mit der Zange und ziehen Sie, bis der gesamte Knochen entfernt wurde.
    1. Für jede Zubereitung von NPCs, filtern durch Genickbruch n = 5-7, 4-8 Wochen alte C57BL / 6 Mäusen.
    2. Reinigen mit 70% Ethanol (in Wasser) die Haare der Mäuse getötet und hinter den Ohren mit der geraden scharfen Schere geschnitten, um den Kopf zu entfernen;
    3. Machen Sie einen Mittelschnitt mit einem kleinen chirurgischen Scheren, die Haut über den Schädel zu schneiden. Mit den Zangen, falten Sie die beiden Flecken auf der Haut zu Ausstellungene die Schädel.
    4. Mit dem kleinen chirurgischen Schere führen zwei kleine Schnitte an der Basis des Schädels und entfernen Sie die Knochen unter der Pons / Medulla (ventral Schädel). Gehen Sie durch Ziehen des zeitlichen Knochen. Mit der gleichen Schere führen einen Schnitt entlang der Schädel, ausgehend von der Basis, um die Lampen, ohne Beschädigung der Oberfläche des Gehirns. Auch, führen Sie einen Schnitt zwischen den frontalen Knochen und die Augen, um die Entfernung der Scheitelbeine erleichtern. Mit zwei Zangen beginnen Entfernen des Schädels, indem jeder der Scheitelbeine nach außen. Während Sie, achten Sie auf die Hirnhäute, die das Gehirn schädigen können, wenn die Knochen werden entfernt.
    5. Sobald der Schädel entfernt wurde, gleitet die Zange zwischen dem Gehirn und dem Schädel vollständig lösen die Meningen gelassen. Vorsichtig heben das Gehirn aus dem Schädel. Schneiden die optischen Nerven, das Gehirn zu lösen und schließlich sammeln das Gehirn in einer Röhre mit kalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
    6. Halten Sie das Röhrchen auf Eis eind die gleiche Prozedur für alle Mäuse wiederholen.
  3. Dissektion der SVZ, Neurosphärenbildung und-erhaltung Assays
    Anzahl der Zellen x Verdünnungsfaktor x 10 4

    Wobei 10 4 für die Umwandlung des Gesamtvolumens der Zählkammer Kammer (Gesamtvolumen = 0,1 mm 3 -> 10-4 cm 3 -> 10.4 ml). Bei der Betrachtung der Verdünnungsfaktor, sowohl derjenige mit CGM geführt und mit dem Vitalfarbstoff müssen berücksichtigt werden. Als ein Beispiel, wenn 160-Zellen wurden in den 4 Ecken Quadrate gezählt wurde, wurde die endgültige Dichte (Zellen / ml) der Zellsuspension werden:

    160/4 x 5 (Verdünnung mit CGM) x 2 (Verdünnung mit Vitalfarbstoff) x 10 4
    1. Schalten Sie eine Dissektion Kapuze mit einem Binokular ausgestattet.
    2. Reinigen aller Oberflächen mit 70% Ethanol (in Wasser), und Spray mit einem Anti Mycoplasma-Lösung, um das Kontaminationsrisiko zu senken.
    3. Abdeckungder Boden eines Becherglas mit steriler Gaze (geschärft Instrumente erhalten) und füllen Sie es mit 70% Ethanol (in Wasser). Tauchen Sie ein in das Becherglas zwei Paar Zangen, ein Paar Mikro Schere und einem Skalpell.
    4. Legen Sie das ganze Gehirn auf das Gehirn-Schneidemaschine Matrix.
    5. Mit zwei Rasierklingen führen eine koronale Schnitt 2 mm von der vorderen Pol des Gehirns, ohne den optischen Bahnen und 3 mm hinter dem vorherigen Schnitt; und legen Sie das Gewebe auf eine saubere Petrischale.
    6. Unter dem Binokular isolieren SVZ Gewebe und in 1 mm 3 Stück mit Iridektomie Schere geschnitten. Wiederholen Sie für alle Gehirne.
      1. Gut mischen die beiden Lösungen (Abschnitt 1.1.2) über und durch ein 0,22 um Filter unmittelbar nach der Gehirne seziert und die SVZs sind bereit, verdaut werden.
    7. Übertragen Sie die Abschnitte, in 30 ml 'Verdauung' Lösung vorsichtig resuspendieren mit A10 ml Pipette und Inkubation 30 min bei 37 ° C in 5% CO 2. Alle 15 min schütteln das Rohr 2-3x.
    8. Zentrifugieren bei 300 g für 10 min.
    9. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 200 ul CGM durch Pipettieren mit einer ersten P1000 und dann mit einem P200-Pipette (10-20x jeweils), bis eine Einzelzellsuspension.
    10. Nehmen Sie die Suspension bis zu 5 ml mit CGM und Transfer zu einem T25 cm 2-Kolben.
    11. Nach 5-7 Tagen in vitro (DIV) werden Neurosphären zu bilden. Sammeln Sie die Suspension in ein 15 ml-Zentrifugenrohr und 10 min bei 150 x g.
    12. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 200 ul der CGM.
      Distanzieren die Neurosphären mechanisch durch Passagieren des Zellen 100-150x mit einem P200 Pipette, bis eine Einzelzellsuspension, und nehmen Sie bis zu 1 ml mit CGM.
    13. Verdünnte Zellsuspension, beispielsweise 10 &mgr; l Zellsuspension in 40 ul CGM um eine 1:5-Verdünnung zu erhalten, und gut mischen. Mischungs 10 ul der DILUTe Zellsuspension mit 10 ul einer Vitalfarbstoff und gut mischen.
    14. Füllen Sie eine Zählkammer Zählkammer mit 10 ul einer 1:1-Zellsuspension: Vitalfarbstoff-Lösung. Separat zählen die Anzahl der Live-(weiß) und Toten (blau)-Zellen in den 4 Ecken Quadrate. Um die Anzahl der Zellen / ml zu bestimmen, gelten die folgende Berechnung:
    15. Resuspendieren 2 x 10 5 Zellen in 5 ml CGM und in einen T25-cm 2-Kolben;
    16. Wiederholen Abschnitte 1.3.11-1.3.12 alle 4-5 DIV. Ab dem zweiten Durchgang der Expansion ab, beurteilen die zelluläre Lebensfähigkeit von Vitalfarbstoff Ausgrenzung und beginnen den Aufbau einer kontinuierlichen Wachstumskurve durch Plattierung NPCs in klonalen Dichte (8.000 Zellen/cm2), wie beschrieben 21. Halten Sie die Zellzahlen und wiederholen Sie den Vorgang alle 4-5 DIV. Um einen kontinuierlichen Wachstumskurve zu erzeugen, gehen Sie wie folgt vor:
      NB: Um eine gute Zellpräparation, nach 4-5 DIV Kugeln sollten einen Durchmesser von 150 bis 200 um erreicht zu haben. Um eine gute Schätzung von t habener Zelldichte, ist es wichtig, eine optimale Verdünnungsfaktor, um gut verteilt, nicht überlappenden Zellen im ganzen Zählkammer haben zu finden. Idealerweise sollte zwischen 50-200 Gesamtzellen sein. Beim Zählen, haben nur die Zellen auf dem Platz zusammen ohne Berührung der Grenzen berücksichtigt werden. Auch ist die Lebensfähigkeit der Zellen ein entscheidender Faktor, um eine gesunde Zubereitung haben. Wichtig ist, dass sie größer 90% sein. Eine lineare Wachstumskurve ist ein weiterer Indikator für eine gesunde Zellpräparation.
      1. Zähle die Anzahl der lebenden und toten Zellen (zB 1,3 x 10 6).
      2. Definieren der Wachstumsrate, indem die Anzahl von lebenden Zellen durch die Anzahl der plattierten Zellen (z. B. 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6,5).
      3. Berechnen der Gesamtzahl der Zellen, die durch Multiplizieren der Wachstumsrate der Gesamtzahl der Zellen in dem vorhergehenden Zeitpunkt (Beginn = 2 x 10 5) vorhanden ist.
      4. Die Durchschnitts melden7; Standardabweichung, um eine lineare Trendlinie zu bauen.
    17. Ausgehend von Kanal 6 wird die mechanische Dissoziation durch enzymatische Dissoziation ersetzt. Nach Zentrifugation bei 150 × g für 10 min, der Überstand entfernt, das Pellet in 200 &mgr; l Zellaggregat Dissoziationslösung resuspendieren 7-8x mit P200 und Inkubation 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
    18. Resuspendieren 7-8x mit einem P200, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und fügen Sie 800 ul der CGM. Zählen Sie die Zellen (sowohl lebenden und toten) und stellen ihre Lebensfähigkeit. Resuspendieren 2 x 10 5 Zellen in 5 ml CGM und in einen T25-cm 2-Kolben.
  4. Virale Transduktion von NPCs für in vivo-Zellverfolgung
    Hinweis: Um die Effizienz der Virusübertragung zu überprüfen, den Aufbau eines parallelen Wachstumskurve mit transduzierten und nicht-transduzierten NPCs. Darüber hinaus ist die klonale Effizienz, ist, dass die absolute Anzahl von Neurosphären bildenden Zellen innerhalb einer Zellzubereitungen vorliegention oder ein Zellzyklus-Analyse von DNA-Gehalt (mit Propidiumiodid, PI), können als weitere Hinweise auf die Zellstatus verwendet werden. Wenn der Prozentsatz der infizierten Zellen nicht gut ist, kann das Protokoll der viralen Transduktion ein zweites Mal mit der gleichen Population von Zellen wiederholt werden. Sobald das Niveau der Infektion ist zufriedenstellend und die Wachstumskurve ist ähnlich wie mit dem Wildtyp-Zellen erhalten, können transduzierten NPCs erweitert und / oder transplantiert werden.
    1. Ernten Sie die Neurosphären und erhalten eine Einzelzellsuspension. Platte der Zellen bei hoher Dichte (1,5 x 10 6 Zellen in einer T75 cm 2-Kolben) in 10 ml CGM.
    2. Nach 12 Stunden hinzufügen 3 x 10 6 TU / ml einer dritten Generation Lentivirusvektor pRRLsin. PPT-hCMV mit dem E. entwickelt coli-abgeleitete β-Galactosidase (lacZ) oder grün fluoreszierendes Protein (GFP).
    3. 48 Stunden später, ernten die Zellen, Zentrifuge bei 300 g für 10 min und Ausstrich die Zellen im Verhältnis 1:1.
    4. Nach3 Passagen in vitro Überprüfung der Effizienz der Infektion. Durchflusszytometrie wird häufig verwendet, um Infektionen Wirksamkeit testen und die zufriedenstellenden Niveau der Infektion wird häufig angenommen, um im Bereich von 75-95% der positiven Zellen sein. Überprüfen Sie nochmals die Effizienz der Infektion nach drei weiteren Passagen der Erweiterung auf die Wartung der Markerexpression zu überprüfen.
  5. Neurosphäre Einfrieren
    1. Ernten Sie die Neurosphären aus einer T25 cm 2-Kolben-Zentrifuge bei 300 g für 10 min und den Überstand verwerfen.
    2. Das Pellet mit 1 ml Gefriermedium (CGM mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
    3. Platzieren Sie die Kryoröhrchen bei -80 ° C innerhalb eines Gefrierbehälters.
    4. Nach mindestens 24 Stunden bewegen die Zellen zu einem Kryoboxen und bei -80 ° C über Monate, oder bringen in flüssigen Stickstoff (N 2) für eine längere Lagerung.
  6. Neurosphäre Auftauen
    NB: Um die toxischen Wirkungen von längeren Kontakt vermeiden of NSC mit DMSO, muss der Auftauvorgang so schnell wie möglich sein.
    1. Entfernen Sie die Kryoröhrchen aus dem -80 ° C / N 2 und halten Sie sie auf Trockeneis.
    2. Tauen schnell das Fläschchen auf dem Wasserbad, bis fast alle die Zellsuspension aufgetaut und nur ein kleines Stück vereist Suspension bleibt.
    3. Resuspendieren der Zellsuspension mit 5 ml vorgewärmte Frisch CGM.
    4. Zentrifugieren bei 300 g für 10 min.
    5. Entfernen Sie den Überstand resuspendieren vorsichtig mit 5 ml frischem CGM und Platte die Zellsuspension in einer sauberen, unbehandelten T25 cm 2-Kolben.
  7. 1.7) NPC Charakterisierung
    NB: Die letzte Wasch PBS mit 0,05% Natriumazid-PBS ausgetauscht werden, um Pilzwachstum oder Verschmutzungen zu vermeiden, und coverslides werden bei 4 ° C für 2-3 Wochen gelagert.

    NB: Um für die intrazelluläre Marker Fleck fügen Sie ein Permeabilisierungsmittel zu PBS in der Blockierungslösung. Wenn die Quelle des primären Antikörpers Ziege, Rinderserum Albumin (BSA) oder Serum von anderen als Ziegen verwendet werden soll.

    NB: Um Fleck für die intrazelluläre Marker verwenden eine Permeabilisierungsmittel in der primären Antikörperlösung.
    1. Legen Sie eine 13 mm Glasdeckglas auf dem Boden einer 24-Well-Platte. Mit 150 ul Beschichtungslösung auf die Oberseite jedes Deckglas auf einen kleinen Tropfen zu erzeugen. Inkubation für mindestens 30 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
    2. Ernte der Neurosphären und dissoziieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
    3. Graf lebenden Zellen und verdünnt auf 80.000 Zellen/35 ul erhalten. Entfernen Sie den Überschuss der Beschichtungslösung von der Deckglas durch leichtes Ansaugen und die Platte 35 ul der Zellsuspension.
    4. Inkubieren 25 min bei 37 ° C, 5% CO 2. Schnelle Prüfung im Gegensatz Phase Mikroskop, wenn die Zellen begonnen haben, haften.
    5. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium durch Mischen basalen Maus Medium mit den entsprechenden Ergänzungsmittel (siehe Tabelle 1) und Antibiotika (Pen / Strep).
    6. Hinzufügen von 400 &mgr; l Differenzierungsmedium und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2.
    7. Nach 3 DIV, ändern die Hälfte des Mediums mit frischem Differenzierungsmedium.
    8. Nach 6 DIV, entfernen Sie das Medium und einmal mit PBS waschen. Unter einer chemischen Abzugshaube entfernen Sie das PBS und 300 ul vorgewärmt 4% Paraformaldehyd (PFA) 4% Saccharose. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie die PFA und waschen 3x mit PBS.
    9. Um mit Immunzytochemie gehen, entfernen Sie das PBS und PBS blockieren mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) (Blockierlösung) und Inkubation 1 h bei RT.
    10. Blocking-Lösung und fügen Sie die gewünschten Primärantikörpers mit PBS 1% NGS verdünnt. Inkubieren bei 4 ° CO / N oder alternativ 120 min bei RT.
    11. Nach der Inkubation, Waschen 2x mit PBS. Inkubation mit dem entsprechenden sekundären Antikörper mit PBS 1% NGS verdünnt. Inkubieren 60 min bei RT.
    12. Wash 2x mit PBS und Gegen färben die Kerne mit 4 ',6-Diamino-2-Phenylindol (DAPI) verdünnt 1:20.000 mit PBS Permeabilisierungsmittel für 3 min bei RT im Dunkeln. Zweimal waschen mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser.
    13. Einen Tropfen Eindeckmedium auf einer Glasgewebe Rutsche und mit einer Zange montieren Sie die Deckglas mit den Zellen vor der Montage Medium. Drücken Sie das Deckglas zu drücken Sie das überschüssige Eindeckmedium. Lassen Sie das Deckglas in der Dunkelheit bei RT, bis die Montagemedium wird getrocknet und bei 4 ° C

2. Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG)-induzierten Experimentelle Autoimmunität in C57BL / 6 Mäuse

  1. Herstellung der Emulsion
    1. Auf einem Glasbecher eine Emulsion herzustellen unvollständigem Freund-Adjuvans, das 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis zusammen [ansonsten wie komplettem Freund-Adjuvans (CFA) definiert sind] und 200 ug MOG (Peptid 35-55), wenn man bedenkt, dass die Gesamtmenge der Emulsion pro Maus werden 300 ul sein.
      NB: Ermächtigungente Kontrollen von MOG-immunisierten Mäusen in CFA sind Mäuse nur mit CFA immunisiert. Die erwartete Varianz der Ausbruch der Krankheit in MOG-immunisierten Mäusen beträgt 11,3 (± 1,8) DPI.

      NB: Bei der Berechnung des Gesamtvolumens der Emulsion benötigt wird, sollten doppelt so viel Volumen wie die Anzahl der Mäuse zu immunisieren. Die Gläser sind bevorzugt, Kunststoffprodukte, um den Abfall der Teil der Emulsion zu minimieren.
      1. Mit einer Glasspritze hält eine 19 G-Nadel-Mischung für etwa 30 min, immer hält die Emulsion auf Eis.
      2. Um zu überprüfen, ob die Emulsion fertig ist, fallen eine kleine Menge der Emulsion auf dem Wasser. Die Emulsion ist bereit, eingespritzt werden, wenn der Tropfen bleibt, wie es ist und nicht zerstreuen.
      3. Impfen der Kontrollgruppe von Mäusen mit nur CFA. Gönnen Versuchsmäusen (MOG immunisiert) mit MOG in CFA. Die erwartete Varianz der Ausbruch der Krankheit in MOG immunisierten Mäusen beträgt 11,3 (± 1,8) DPI.
    2. Übertragung der 19 G-Nadel in eine 1 ml-Kunststoffspritze einnd absaugen Emulsion. Vermeiden Sie Luftblasen, ändern Sie die Nadel mit einer 25 G und lassen Sie die Spritze auf Eis. Spritzen mit der Emulsion gefüllt sind bereit, verwendet werden und sollten auf Eis für ein paar Stunden gehalten werden.
  2. Immunisierung
    1. Legen Sie die Mäuse (6-8 Wochen alt, weiblich) in einen Wärmeschrank und warten Sie etwa 10 Minuten, damit die Schwanzvenen zu erweitern.
    2. Bringen Sie eine Maus aus der Erwärmung Box an eine Maus Rainer. Schließen Sie den Restrainer, jede Bewegung der Maus zu vermeiden.
    3. Füllen Sie eine 1 ml Insulinspritze mit 100 ul von Pertussis-Toxin (5 pg / ml), die Luftblasen zu vermeiden. Langsam spritzen die Lösung in die Schwanzvene. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie für einige Sekunden mit einem Stück Papier, um die Blutung zu stecken.
    4. Platzieren Sie die Maus wieder in den Käfig und wiederholen Sie den Vorgang für alle Mäuse.
    5. Betäuben eine Maus mit Isofluran-Inhalations kontinuierliche (1-2%, 2 l / min) und 100 &mgr; l Injektion der Emulsion subkutan in Höheder beiden Flanken und der Basis des Schwanzes (300 &mgr; l Emulsion / Maus). Langsam die Spritze entfernen, die Vermeidung der Leckage von der Emulsion.
    6. Markieren Sie die Maus mit einem Ohr Puncher, legen die Mäuse im Käfig und Check bis zur vollständigen Genesung. Wiederholung für alle Mäuse.
    7. Nach 48 Stunden (2 Tage nach der Immunisierung, dpi) Wiederholung Abschnitt 2.2.3.
  3. Verhaltensanalyse von EAE-Mäusen
    1. Ausgehend von 5 dpi, wiegen die Mäuse täglich und ihre Bewegungs Leistungen zu überwachen, indem Sie die in Tabelle 1 beschrieben Skala Scoring-System.

3. Injektion von Neural Stem / Progenitor Cells in die Schwanzvene (iv)

  1. Zellpräparation
    1. Ernteneurosphären durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min.
    2. Entfernen Sie den Überstand und 200 ul Zellaggregat Dissoziationslösung. Inkubieren 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
    3. Vorsichtig resuspendieren 10-12x (avoiding Blasen) mit P200 bis eine Einzelzellsuspension und 800 ul mit Basalmedium nehmen, ohne Ca 2 + und Mg 2 +.
    4. Zähle die Zellen mit einem Vitalfarbstoff zur Zelllebensfähigkeit zu testen und verdünnt die Suspension mit Grundmedium ohne Ca 2 + und Mg 2 +, um eine endgültige Dichte von 10 6 Zellen/150 &mgr; l zu erhalten. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis bis zum Gebrauch.
  2. NPC iv Injektion
    NB: Die ideale Dissoziation in Einzelzellsuspension und die Abwesenheit von Luftblasen sind zwei wichtige Aspekte zu beachten, um das Risiko von entweder Klumpen / Aggregate vs Embolien Formation, die in Venenverschluss und damit zum Tod führen könnte, zu verringern.
    1. Auf dem Höhepunkt der Erkrankung (16-18 dpi), wiegen und zählen die Mäuse. Verteilen Sie die Mäuse nach ihrer Punktzahl, um homogene Gruppen zu haben.
    2. Legen Sie die Mäuse in einen Wärmeschrank und warten Sie etwa 10 Minuten, damit die Schwanzvenen zu erweitern.
    3. Bringen Sie eine Maus aus der Erwärmung Box an eine Maus Rainer. Schließen Sie den Restrainer, jede Bewegung der Maus zu vermeiden.
    4. Füllen Sie eine 1 ml Insulinspritze mit 150 ul Zellsuspension und stellen Sie sicher, alle Luftblasen zu entfernen. Injizieren Sie langsam die Lösung in die Schwanzvenen. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie für einige Sekunden mit einem Stück Papier, um das Plug-Blutungen (6A und 6B).
    5. Platzieren Sie die Maus in den Käfig und überprüfen bis zur Genesung. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Mäuse.

4. Injektion von Neural Stem / Progenitor Cells in die Cisterna Magna (ICV)

  1. Zellpräparation
    1. Ernte NPCs durch Zentrifugation bei 300 g für 10 min.
    2. Entfernen Sie den Überstand und 200 ul Zellaggregat Dissoziationslösung. Inkubieren 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
    3. Vorsichtig resuspendieren 10-12x mit einem P200 bis eine Einzel cell Federung und zu ergreifen, um 800 ul mit Grundmedium ohne Ca 2 + und Mg 2 +.
    4. Zählen Sie die Zellen und Verdünnen der Suspension mit Grundmedium ohne Ca 2 + und Mg 2 +, um die gewünschte Zelldichte zu erhalten. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis bis zum Gebrauch.
  2. 4.2) NPC icv Injektion
    1. Auf dem Höhepunkt der Erkrankung (16-18 dpi), wiegen und zählen die Mäuse. Verteilen Sie die Mäuse nach ihrer Punktzahl, um homogene Gruppen zu haben.
    2. Platzieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Apparat unter Isofluran kontinuierliche Inhalation (1-2%, 2 L / min). Sichern Sie den Kopf der Maus mit den Ohr-Bars. Dann passen die Mund und Nase Stück. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus ist eben und befestigt.
    3. Wischen Sie den Kopf der Maus mit Povidon-Iod (PVP-I) und einen Einschnitt in die Haut in den hinteren Teil des Kopfes abgeschnitten, um den Schädel freizulegen.
    4. Mit einem Mikromanipulator, legen Sie die Spitze einer Mikroliteriter Spritze in den Spalt zwischen dem Hinterhauptbein und dem Atlas Wirbel durch den intakten Muskeln und Bänder in der Mittellinie auf der Rückseite des Halses. Der gebogene Teil der Nadel ist in engem Kontakt mit der Innenfläche der Hinterhauptbein über die gesamte Länge gehalten wird, wie beschrieben 22.
    5. Sie die Nadel langsam und warten Sie ein paar Sekunden. Der Betreiber soll lernen, das Gefühl wobei die Nadel "süchtig" auf die Maus Schädel, vor der Inbetriebnahme Injektion der Zellpräparation zu erkennen. Spritzen Sie das Volumen der Zellen (ca. 3-5 min). Lassen Sie die Nadel in Platz für zusätzliche einige Sekunden nach der Injektion langsam und entfernen Sie die Spritze.
    6. Nähen Sie die Haut und legen Sie die Maus in einen Käfig Erholung bis zur vollständigen Genesung.

5. Gewebeverarbeitung

  1. Tief anästhesiert der Mäuse mit einem Gemisch aus 0,5 ml Ketamin (100 mg / ml), 0,25 ml Xylazin (23.32 mg / ml) und 4,25 ml sterilem Wasser und transcardically Perfusion, wVeraschung mit Kochsalzlösung-EDTA und Fixierung mit 4% PFA. Entfernen Sie sowohl die Wirbelsäulen-und Gehirn-und Postfix in 4% PFA für 12 h bei 4 ° C Waschen Sie das Gewebe in PBS, entfernen Sie die Rückenmark aus den Knochen und lassen Sie das Gewebe mindestens 48 h in 30% Saccharose (in PBS) bei 4 ° C Betten Sie das Gewebe in eine optimale Schneidtemperatur (OCT)-Verbindung und Snap Einfrieren mit flüssigem Stickstoff, wie beschrieben 2.
  2. Verwenden Sie ein Mikrotom, um das Gewebe in 10 bis 12 um dicke Scheiben schneiden.
  3. Alternativ einbetten frischem Gewebe in Agarose und schneiden Gewebe mit ein Vibratom 50-80 um dicke Scheiben schneiden.
  4. In beiden Fällen inkubieren O / N bei 37 ° C in 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal)-Lösung, um β-Galactosidase-Aktivität Kern erfassen.
  5. Nachgeschnitten Abschnitte enthält β-Gal +-Zellen in 5 &mgr; m Schnitte und Doppelfärbung mit antiglial fibrilläres saures Protein (GFAP) für Astrozyten (50 ug / ml), antineuronaler nukleäres Antigen (NeuN) für Neuronen (1 &# 956, g / ml) und für antiNestin undifferenzierten neuronalen Zellen (10 &mgr; g / ml).
  6. Gehen Sie wie in den Abschnitten 1.7.11 und 1.7.12 beschrieben. Für mehrere Färbungen stellen Sie sicher, Sekundärantikörper mit unterschiedlichen Fluorophore konjugiert zu verwenden.
  7. Für Geweben mit GFP-markierten Zellen vor, wie in Schritten von 5,1 bis 5,3 erläutert und fahren Sie mit den Mehrfachfärbungen.
  8. Fügen Sie einige Tropfen Eindeckmedium auf die Objektträger geben und mit einem Deckgewebe.
  9. Für Abschnitte mit Bunt Biotin konjugierte Antikörper herzustellen, eine Lösung von Avidin Biotin-Komplex (ABC-Lösung, siehe Tabelle 2) und lassen in Bewegung für 45 min.
  10. Inkubieren der Scheiben 5 min mit 1% H 2 O 2, um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu blockieren.
  11. Zweimal mit PBS waschen.
  12. Inkubieren mit ABC-Lösung für 1 h bei RT.
  13. Zweimal mit PBS waschen.
  14. Inkubieren mit 3,3 '-Diaminobenzidin-Lösung und 0,3% H 2 O 2. Überwachen Sie die Reaktion unDer ein Mikroskop und waschen mit PBS, sobald die Scheibe anfangen, braun (in der Regel etwa 5-10 min).
  15. Zweimal mit PBS waschen und gehen Sie wie in Schritt 5.7 beschrieben.

Umfassende Liste der Materialien und Reagenzien sind in Tabelle 2 gezeigt.

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Ergebnisse

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NPC Ableitung und Charakterisierung
SVZ Dissektionen an Pools von 6-8 Wochen alte C57BL / 6 Mäuse durch mechanische und enzymatische Spaltung (Fig. 1A) (n = 5-7 Mäuse / Pool). Nach ein paar Tagen der Kultivierung in CGM, beginnen frei schwebenden Neurosphären bilden (1A und 1B). Primäre Kugeln werden gesammelt und mechanisch agiert alle 4-5 DIV. Nach der Passage werden Zahlen von lebenden und toten Zellen ermittelt und kumulative Zellzahlen aufgetragen, um eine Wac...

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Diskussion

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Somatische Stammzelltherapien sind als einer der vielversprechendsten Strategien zur Behandlung von chronisch-entzündlichen ZNS-Erkrankungen wie MS2 11 entstehen. Während die Mechanismen Erhaltung ihrer therapeutischen Wirkungen vollständig aufgeklärt werden müssen, noch hat die wesentlichen Auswirkungen der NPC-Transplantation in verschiedenen experimentellen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen Anlass zu der etwas provokanten Überzeugung, dass Zellen können bald in Studien am Menschen angewendet werden ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Jayden Smith für die kritische Prüfung und der Nachweis der Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit Unterstützung von der National Multiple Sclerosis Society (NMSS, Teilstipendien RG-4001-A1) erhalten hat, die Italienische Multiple Sklerose Vereinigung (AISM gewähren 2010/R/31), dem italienischen Gesundheitsministerium (GR08-7), Wings for Life, die Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), des European Research Council (ERC) im Rahmen des ERC-2010-StG Finanzhilfevereinbarung Nr. 260511-SEM_SEM und die Europäische Gemeinschaft (EG) 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter Grant Agreement n * deg; 280772 - Ione.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cell culture
EBSSSigmaE2888
L-CysteinSigma AldrichC7352
PapainWorthington30H11965
EDTAFisher ScientificD/0700/50
Maus NeuroCult BasalmediumStammzelltechnologien05700
NeuroCult ProliferationsergänzungsmittelStammzelltechnologien05701
HeparinSigmaH3393
Basischer Fibroblasten-WachstumsfaktorPeprotech100-18B-1000
Epidermaler WachstumsfaktorPeprotechAF-100-15-1000
Pen/StrepInvitrogen1514012
Matrigel (Beschichtungslösung)BD Biosciences354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Maus)Stammzelltechnologien05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) ohne Ca und MgPAA LaboratoriesH15-011
Myco-SpurPAA LaboratoriesQ052-020
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD2650<
stark> Immunfluoreszenz
Normales ZiegenserumPAA LaboratoriesB11-035
Polyethylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyletherSigma AldrichT8787
Maus anti NestinAbcamab11306
Kaninchen anti GFAPDAKO203344
Maus anti Histon H3 (phospho S10) Abcamab14955
Kaninchen anti MAP-2Abcamab32454
Ratte anti MBPAbD SEROTECMCA409S
Anti-O4 Antikörper, Klon 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
EindecklösungDAKOS3023
EAEFreund's
Adjuvans unvollständigSigma AldrichF5506
Mycobacterium tuberculosisDIFCOH37Ra
MOG(35– 55) Espikem
Pertussistoxin Liste Biologische Laboratorien181
Gewebeverarbeitung
Iris Schere geradeFine Sciences Tools14060-09
Stumpfe/gebogene PinzetteFine Sciences Tools11080-02
Schneidemaschine für das GehirnZivic InstrumentsBSMAS005-1
Chirurgische KlingenSwann-Morton324
P200, P1000 Pipetten
Ketamin (Vetalar)Boehringer Ingelheim01LC0030
Xylazin (Rompun)Bayer32371
Stereotaktischer RahmenKOPFModell 900
HamiltonSpritze Hamilton7762-04
Paraformaldehyd (PFA)Sigma158127
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6100

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
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  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
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