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Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

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1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir zwei Assays zur Messung von Komplement-Aktivierung durch Antikörper gegen rote Blutzellen induziert. Der große Vorteil gegenüber den aktuellen Untersuchungen ist die quantitative und einfach zu interpretieren Natur.

Abstract

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Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Erythrozyten) kann dazu führen, Aktivierung, was zu einer beschleunigten Genehmigungs über Komplement-Rezeptoren in der Leber (extravaskulären Hämolyse) oder die zu intravaskulären Lyse von Erythrozyten zu ergänzen. Alloantikörper (zB ABO) oder Autoantikörper gegen RBC-Antigene (wie in der Autoimmun-hämolytische Anämie, AIHA zu sehen), die zur Aktivierung ergänzen sind potenziell schädlich und kann - vor allem, wenn die zu intravaskulären Lyse - tödlichen ein. Derzeit Komplement-Aktivierung durch (auto)-Antikörpern auf Erythrozyten in vitro mit Hilfe der Coombs-Test reflektierende Ergänzung Abscheidung auf RBC oder durch eine nicht-quantitative Assay hämolytische reflektieren RBC Lyse 1-4 bewertet. Um jedoch die Wirksamkeit von Inhibitoren Ergänzung zu bewerten, ist es zwingend erforderlich, um quantitative Techniken haben. Hier beschreiben wir zwei solche Techniken. Zuerst wird ein Test zur C3 und C4 Abscheidung auf rote Blutzellen, die von Antikörpern in Patientenserum induziert wird erkennen vorgepräsentierte. Hierzu ist die FACS-Analyse mit Fluoreszenz-markierten anti-C3-oder Anti-C4 Antikörper verwendet. Als nächstes wird eine quantitative hämolytischen Assay beschrieben. In diesem Assay Komplement-vermittelte Hämolyse von Patientenserum induziert ist die Nutzung der spektrophotometrischen Nachweis des freigesetzten Hämoglobins gemessen. Diese beiden Tests sind sehr reproduzierbare und quantitative erleichtert Untersuchungen der Antikörper-induzierten Komplementaktivierung.

Introduction

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Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Erythrozyten) durch Transfusion von roten Blutkörperchen, die ein Antigen, das nicht auf Empfänger RBCs vorhanden ist exprimieren, induziert werden. Diese Allo-Antikörper können schwere akute hämolytische Transfusionsreaktionen aufgrund der Aktivierung auf die nach der Transfusion 5 ergänzen verursachen. In Auto-Immun-hämolytische Anämie (AIHA) haben die Patienten Auto-Antikörper gegen ihre eigenen roten Blutkörperchen. Dies führt zu einer beschleunigten Clearance der Zellen durch die Interaktion von IgG mit Fc &ggr; RBC-Rezeptoren auf Phagocyten in der Milz und / oder im Falle von Autoantikörpern in der Lage, mittels ....

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Protocol

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1. Herstellung von Bromelain-behandelten roten Blutzellen

  1. Waschen 0 typisierte roten Blutkörperchen 3x mit 1x PBS (Zentrifugation bei 664 g für 2-5 min).
  2. Inkubieren 1 Volumen Erythrozytenkonzentrat mit zwei Volumina einer 0,5% Bromelain Lösung für 10 min bei 37 ° C.
  3. Waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS.
  4. Die Zellen können als eine 3% ige Lösung bei 4 ° C in 1 × PBS für mindestens eine Woche gelagert werden.

2. C3 und C4 Deposition Analyse auf RBCs durch FACS

  1. Wärme-Inaktivierung die erforderliche Menge an Patientenserum (oder andere anti-RBC Antikörper Quelle) durch Erhitzen der Prob....

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Results

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2A zeigt eine repräsentative Streudiagramm für Erythrozyten. FSC-A-Grundstück (P1) - Geeignet für Einzel Gating Erythrozyten in de FSC-W zu sehen. In der Regel rund 95% der roten Blutkörperchen, gehören zu dieser P1-Gate (Einzelzellen), aber wenn ein hoher Prozentsatz der Patientenserum verwendet wird, kann diese auf 70-80% sinken, vor allem, wenn anti-RBC IgM im Serum des Patienten vorhanden ist.

Repräsentative Ergebnisse für die Wirkung von Patientenserum auf AIHA C4 Absch.......

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Discussion

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Die obigen Tests sind reproduzierbar und stabil. Sie sind einfach durchzuführen und es ist möglich, sie mit vielen Proben gleichzeitig (in einer 96-well-Platte) durchzuführen. Daher würde dieser Ansatz auch für ein vollautomatisches System, z. B. eine ELISA-Robotersystem. Im Gegensatz zu den gegenwärtig verwendeten Techniken sind diese Assays quantitativ und dies wird in der Studie über die Wirkung von Komplement-Inhibitoren helfen zB. Außerdem ist die objektive Interpretation, welche eine Verbesserung.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ und DW erhalten eine zweckgebundene Zuwendung von Viropharma.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
BarbitalFagron0261Diese Chemikalie unterliegt der Arzneimittelregulierung.
Natrium BarbitalFagron0263Diese Chemikalie unterliegt der Arzneimittelregulierung.
GelatineMerck1.0470.0500 
NatriumchloridMerck1.06404.1000 
MagnesiumchloridMerck1.05833.0250 
CalciumchloridMerck1.0238.0500 
Dylight 488 Amin-ReaktivfarbstoffPierce46402 
Dylight 650 Amin-ReaktivfarbstoffPierce62265 
α C5 (Eculizumab)Alexion Pharmazeutika 
FACS (Canto)BDEs kann jedes FACS verwendet werden, das über die entsprechenden Laser verfügt.
Spektralphotometer (z.B. Multiskan-Spektrum) Thermo Labsystems1500-193Jedes Spektralphotometer mit dem richtigen Wellenlängenbereich kann verwendet werden
BD FACSDiva Software v 6.1.2BD643629Jede kompatible FACS-Analysesoftware kann verwendet werden
Bromelain SanquinK1121 

References

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  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

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Complement ActivationAntibody DepositionFlow CytometryHemolytic AssayRed Blood CellsC3 C4 DetectionQuantitative AnalysisSpectrophotometric DetectionPatient SerumAnti C5 Antibody

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