Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, intakte bakterielle Zellwände (Sacculi) zu isolieren und das Peptidoglycan (PG) so zu verdauen, dass Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) verwendet werden kann, um Informationen wie die Identität der Muropeptidkomponenten und ihre Konzentrationen, die durchschnittliche Länge der Glykan-Stränge und den Anteil des Materials, das an Querverbindungen zwischen Strängen beteiligt ist, bereitzustellen. Für eine detaillierte Diskussion der PG Biochemie und Mutropptinatsarten, gibt es mehrere ausgezeichnete Bewertungen, die PG-Struktur und seine Rolle bei Infektion, Resistenz, Morphogenese und Wachstum^{beschreiben 1-6}. Die High Performance Liquid Chromatography (HPLC) für die PG-Analyse wurde ursprünglich von Glauner und Schwarz in den 1980er Jahren entwickelt und in jüngerer Zeit in den Laboren von Miguel de Pedro und Waldemar Vollmer umfassend aufgetragen. Frühere Methoden verwendeten Aminosäureanalyse oder Papierchromatographie, zeitaufwändige und mühsame Techniken, die keine genaue oder vollständige Bewertung von Zellwandkomponenten liefern.

Die UPLC-Analyse kann einfach in jedem Basisforschungslabor implementiert werden, das Zugriff auf eine Ultrazentrifuge und UPLC hat. Die UPLC-Methode, die wir unten vorstellen, isoliert vollständige Sacculi und liefert so umfassende, quantitative Informationen über alle darin enthaltenen chemischen Arten. Diese Methode liefert eine präzise Quantifizierung aller Muropeptide über eine Bakterienpopulation, alle innerhalb eines 20-min-UPLC-Laufs. Die Umsetzung dieser Methode beinhaltet nur grundlegende Laborfertigkeiten, ohne nennenswerte finanzielle Investitionen in Materialien. Um die Schritte in dieser Methode auszuführen, müssen die Forscher nur in pipettieren, Puffer und Enzyme vorbereiten und den pH-Wert anpassen, um es für eine Breite von wissenschaftlichen Disziplinen zugänglich zu machen. Die Wahl der in diesem Protokoll verwendeten Enzyme hängt von der analysierten Bakterienart ab; das hier beschriebene Protokoll ist nützlich für Escherichia coliund hat sich im Allgemeinen als ausreichend für die Isolierung von Sacculi von anderen Gram-negativen Organismen erwiesen. Die Konsultation der Literatur wird empfohlen, wenn diese Methode auf Gram-positive Bakterien angewendet wird; bei diesen Arten ist die Sacculus-Reinigung traditionell schwieriger. Insbesondere kann diese Methode in Bezug auf Enzymwahl und Länge der Verdauungszeiten geändert werden müssen, um die dickeren Wände und Zubehörpolymere wie Teichosäuren von Gram-positiven Bakterien unterzubringen. Das erste Enzym in diesem Protokoll spaltet die an der Peptidoglykan-Anlage des Peptidoglykans angebrachte Anhaftung des äußeren Membranlipoproteins (wie Brauns Lipoprotein oder Lpp) und löst damit bis auf das C-terminale Di- (oder Tri-) Peptid des Lpp von der Zellwand. Dieser Schritt ist notwendig bei der Untersuchung enterobacteria, aber viele andere Gram-negative Bakterien haben keine Lpp-Äquivalente, und daher kann dieser Schritt übersprungen werden. Ein zweites Enzym spaltet speziell nach der Muramicsäurekomponente des Peptidoglykans und llüflisiert die Disaccharid-Untereinheit, die die Muropeptid-Arten bildet. Um eine genaue Bewertung der Architektur des PG zu liefern, sollte bei der Verdauung der Sacculi darauf geachtet werden, eine Spaltung der Querbrücken oder eines anderen Teils des Peptidstamms zu verhindern.

Obwohl die chemischen Zusammensetzungen von Peptidoglycan aus über 100 Stämmen von 40 Bakterienarten mit HPLC analysiert wurden, wurden keine Analysen mit UPLC-Technologie durchgeführt. Darüber hinaus hat die vorherige Arbeit Peptidoglycan nur von einem kleinen Bruchteil der bakteriellen Domäne charakterisiert, teilweise durch den Durchsatz von HPLC begrenzt. Daher wird die Verbreitung dieser Methode an so viele Forscher wie möglich und die Implementierung auf UPLC-Plattformen entscheidend für die Förderung physiologischer Studien des großen Anteils von Bakterienarten sein, deren Peptidoglycan noch kategorisiert werden muss.

1. Wachsen Sie bakterielle Kulturen in 2,5 ml Medien über Nacht

Rückverdünnungskulturen 1:100 in 250 ml Frischmedien und wachsen auf OD₆₀₀ von 0,7-0,8 an. Bereiten Sie eine Lösung von 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) in Wasser vor.

VORSICHT: SDS Pulver ist gefährlich - vermeiden SDS Pulver einatmen; eine Maske über Nase und Mund tragen.

2. Tag 1 - Lysing Bakterielle Kulturen wird im Laufe eines Tages und über Nacht durchgeführt

1. Während verdünnte Kulturen wachsen, stellen Sie ein kochendes Wasserbad auf einer Kochplatte in einem 1 L Becher auf. Sobald das Wasser kocht, aliquot 6 ml 6% SDS in 50 ml Polypropylen-Röhren, fügen Sie einen kleinen Rührstab zu jedem Rohr, sichern Rohrdeckel fingerdicht, legen Sie Rohre in Wasserbad, und schalten Sie das Rühren auf 500 U/min auf der Kochplatte.
2. Die 250 ml-Kulturen bei 5.000 × g 10 min bei Raumtemperatur ernten und Pellets in 3 ml Medien oder 1x phosphatgepufferter Saline wieder aufhängen. Langsam Pipette Zell Suspensionen in 50 ml Tuben mit 6% kochenden SDS, um die Zellen zu lyse (Endkonzentration 4% SDS), während die Rohre in das kochende Wasserbad getaucht werden, und schließen Sie die Deckel wieder zu Fingerfest. Zellsuspensionen müssen nach der Resuspendierten schnell in kochende SDS übertragen werden. Abrupte Umweltveränderungen sollten vermieden werden, da dies zu einer fehlerhaften Veränderung der Zellwandstruktur führenkönnte.
3. Deckel kochendes Wasserbad und lassen Sie Zellen für 3 Stunden kochen, überprüfen Sie den Wasserstand regelmäßig und das Wasserbad nachfüllen, wenn nötig. Nach 3 Stunden das Heizelement der Kochplatte ausschalten und über Nacht bei 500 Umdrehungen umrühren.

3. Tag 2 - Enzymatische Verdauungen werden im Laufe eines Tages durchgeführt

1. Wenn SDS in den 50 ml Tuben über Nacht gefällt hat, stellen Sie das Wasserbad für weitere 1-2 Stunden zum Kochen. Schalten Sie einen Wärmeblock auf 60 °C ein. Bereiten Sie einen 1 mg/ml Vorrat an Pronase E in 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl vor und aktivieren Sie Pronase E bei 60 °C für mindestens 30 min.
2. Verwenden Sie ein Ultrazentrifugenset auf 400.000 × g, um Proben für 20 min bei Raumtemperatur zu spinnen, um die großen PG-Polymere zu pellet und damit von anderen zellulären Komponenten zu reinigen. Überstand vorsichtig entfernen und dann jedes Pellet in Raumtemperatur Reinstwasser wieder aufhängen. ANMERKUNG: Das Resuspensionsvolumen hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenrohre ab; verwenden Sie ein Volumen, das die Rohre mindestens auf halbem Weg füllt, aber das maximale Volumen der Rohre nicht überschreitet. Zentrifugieren/Waschen wiederholen, bis das Wasser während der Resuspension keine Blasen bildet, was darauf hinweist, dass die SDS vollständig entfernt wurde (in der Regel drei Waschungen). Hören Sie auf, das Pellet zu waschen, wenn sich ein weißer Niederschlag bildet, da dies darauf hindeutet, dass die Sacculi zusammenklumpen. Klumpen sind nicht katastrophal, aber Klumpen binden sehr stark an Kunststoff und Glaswaren, was zu einem großen Probenverlust führt. Fahren Sie in diesem Fall mit dem Protokoll unter Verwendung der verklumpten Sacculi-Probe fort.
3. Setzen Sie die Proben beim letzten Zentrifugations-/Waschschritt in 900 l von 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06 % w/v NaCl wieder auf und übertragen Sie sie in 2 ml-Röhrchen, die zuvor mit Löchern in den Oberteilen mit einer kleinen Nadel gestochen wurden. Zu jeder Probe 100 l von 1 mg/ml aktivierter Pronase E (100 g/ml Endkonzentration) geben und bei 60 °C für 2 Stunden inkubieren. Stellen Sie einen anderen Wärmeblock auf 100 °C ein.
4. Stoppen Sie die Pronase E-Verdauung, indem Sie jeder Probe 200 l 6% SDS hinzufügen und die Proben im 100 °C-Wärmeblock 30 min kochen. Stellen Sie einen anderen Wärmeblock auf 37 °C ein und machen Sie einen 1 mg/ml-Vorrat an Muramidase (Mutanolysin) in 50 mM Phosphatpuffer (pH 4.9).
5. Verwenden Sie wie in Schritt 3.2 ein Ultrazentrifugenset auf 400.000 × g, um Proben für 20 min bei Raumtemperatur zu spinnen und mit Raumtemperatur Ultrareinstwasser zu waschen, bis SDS vollständig entfernt ist (in der Regel drei Waschungen). Das Resuspensionsvolumen hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenrohre ab; verwenden Sie ein Volumen, das die Rohre mindestens auf halbem Weg füllt, aber das maximale Volumen der Rohre nicht überschreitet.
6. Beim letzten Zentrifugations-/Waschschritt Proben in 200 l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 4.9) wieder aufsetzen. Dieses Volumen kann entsprechend der Menge an Peptidoglycan in der Probe angepasst werden und kann artenabhängig sein. Wenn es zuvor veröffentlichte Berichte über HPLC-Analysen für die Arten von Interesse gibt, kann dieser Band auf der Grundlage dieser Quantifizierungen geschätzt werden (eine Zusammenstellung von HPLC PG-Studien finden Sie in den ergänzenden Informationen der Referenz⁷). Für andere Arten kann die Sacculus-Vorbereitung bis zu diesem Schritt ausgeführt werden, und dann können verschiedene Mengen von Resuspension-Volumes hinzugefügt werden, um Proben zu replizieren, um das minimale Volumen zu bestimmen, das es dem PG ermöglicht, in lösungsweise zu bleiben (siehe Diskussion für weitere Schätzungen). Wenn die Probe mehr Peptidoglycan enthält, erhöhen Sie das Resuspensionsvolumen; Wenn die Probe wenig Peptidoglycan hat, reduzieren Sie das Resuspensionsvolumen auf mindestens 50 l.
7. Die Proben in 1,5 ml Tuben geben und 1 mg/ml Muramidase hinzufügen, um eine Endkonzentration von 40 g/ml zu ergeben. 6-8 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren.

4. Tag 3 - Die Vorbereitung der Proben für UPLC wird am letzten Tag durchgeführt

1. Schalten Sie einen Wärmeblock auf 100 °C ein. Kochen Sie die Proben ohne SDS für 5 min, um die Muramidase-Verdauung zu stoppen. Zentrifugenproben für 10 min bei 16.000 × g bei Raumtemperatur, dann den Überstand (Muropeptiden sind jetzt löslich) auf 13 mm x 100 mm Glasrohre übertragen. Versuchen Sie, so viel Überstand wie möglich zu erholen, immer sehr nah an das Pellet, ohne es zu stören.
2. Stellen Sie den pH-Wert ein, indem Sie der Probe 500 mM Boratpuffer (pH 9) für eine Endkonzentration von 100 mM Boratpuffer hinzufügen. Boratpuffer ist kompatibel mit dem Reduktionsmittel Natriumborohydrid. Fügen Sie 1-2 Körner Natriumborohydrid hinzu, um jede Probe zu reduzieren und die Reaktion mindestens 30 min bei Raumtemperatur laufen zu lassen. VORSICHT: Natriumborohydrid ist hochreaktiv und gefährlich zu handhaben - vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut (Handschuhe tragen) und vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen (Schutzbrille).
3. Passen Sie die Proben auf pH 3-4 (der isoelektrische Muropeptidpunkt beträgt 3,5) mit 50 % v/v Orthophosphorsäure mit 20-l-Schritten bis pH 6, gemessen mit pH-Indikatorpapier, und dann mit 2-l-Schritten. VORSICHT: Orthophosphorsäure ist korrosiv und gefährlich zu handhaben - vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut (Handschuhe tragen) und vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen (Schutzbrille). Die Probe sollte als Reaktion auf die Zugabe von Orthophosphorsäure sprudeln; Wenn die Probe nicht mehr sprudelt, weist dies in der Regel darauf hin, dass ein pH-Wert von 6 erreicht wurde. Wenn in der Probe kein Blasen auftritt, kann dies darauf hindeuten, dass die Menge an Natriumborohydrid zugesetzt wurde, die zu klein war. In diesem Fall, stoppen Sie die Senkung des pH-Werts, fügen Sie vorsichtig ein oder zwei Körner Natriumborohydrid hinzu, lassen Sie 5-10 min reagieren, dann setzen Sie die pH-Einstellung fort.
4. Filtern Sie die Probe durch einen 0,22 m Spritzenfilter direkt in eine UPLC-Durchstechflasche. Wenn sich ein Niederschlag gebildet hat, erhitzen Sie das Rohr mit mehreren Bahnen durch eine Flamme, bevor Sie filtern. Wenn die Probe nicht innerhalb des Tages in das UPLC-Instrument injiziert wird, frieren Sie über Nacht bei -20 °C ein. Proben können bis zu einem Jahr bei -80 °C gelagert werden. Die Probe kann aufgetaut werden, indem sie mehrmals durch eine Flamme geht.
5. Injizieren Sie 10 l jeder Probe auf ein UPLC-Instrument, das mit einer C18 1,7-m-Umkehrphasensäule und einem Absorptionsdetektor ausgestattet ist, um 202-208 nm zu überwachen. Proben werden sequenziell injiziert, aber Autosampler-Funktionen ermöglichen die Verarbeitung von bis zu 96 Samples im Batch. Verwenden Sie 50 mM Natriumphosphat (pH 4,35) + 0,4 % v/v Natriumazid für Lösungsmittel A und 75 mM Natriumphosphat (pH 4,95) + 15 % v/v Methanol für Lösungsmittel B. HINWEIS: Natriumazid wird hinzugefügt, um die 205 nm Absorption von Methanol auszugleichen, um eine Basisdrift zu vermeiden. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,25 ml/min ein und verwenden Sie einen linearen Gradienten über 25 min, um 100% Lösungsmittel B und sequentielle Elution von Muropeptiden innerhalb von 30 min zu erreichen. Wenn die Massenspektrometrie verwendet wird, um Muropeptide nach UPLC zu charakterisieren, sammeln Sie Bruchteile des Spitzenwerts eines Anteilssammlers und trocknen Sie die Fraktionen mit einem Zentrifugalverdampfer.

Nach dem in Abbildung 1beschriebenen Verfahren sollte die endige Probe aus mindestens 200 l klarer Lösung bestehen, die direkt in eine UPLC-Durchstechflasche gefiltert wurde (Schritt 4.4). Die UPLC-Trennung der verschiedenen Muropeptide in einer bakteriellen Probe beruht auf ihrer relativen Löslichkeit zwischen der flüssigen mobilen Phase und der stationären Phase der Säule. Reversed-Phase C18 Säulen bieten eine stark hydrophobe Matrix, um die Muropeptid-Arten basierend auf Hydrophobie und Größe8zu trennen; polare, niedermolekulare Monomere elute zuerst, und apolare, höhermolekulare Oligomere nach (Abbildung 2). Ein typisches UPLC-Ergebnis ist in Abbildung 2dargestellt, mit der Detektion über UV-Absorption bei 202-208 nm als Funktion der Zeit, die die Retentionszeit eines bestimmten Mutropptids festlegt. Dieses repräsentative Ergebnis zeigt eine klare Auflösung zwischen den meisten Muropeptid-Arten und eine starke Signalstärke im gesamten Spektrum, die die Analyseiz und die durchschnittliche Glyklyanstranglänge ermöglicht.

Der letzte Schritt in Abbildung 1 besteht darin, den pH-Wert anzupassen und alle Feinpartikel zu filtern, die die kleinen Abmessungen der in UPLC verwendeten Schläuche verstopfen können. Wenn eine Probe superkonzentriert ist, z. B. durch Wiederaussetzung in 100 l Natriumphosphatpuffer in Schritt 3,5 statt 200 l, kann die Probe trüb werden, was darauf hindeutet, dass eine kritische Konzentration erreicht wurde und die Muropeptiden ausgefällt sind. Dieser Verlust der Löslichkeit führt zu einer Verstopfung des in Schritt 4.4 verwendeten Spritzenfilters, wodurch die Ablagerung von Muropeptiden in die UPLC-Durchstechflasche und/oder Verstopfung der UPLC-Maschinenschläuche und -säulen verhindert wird, die kostspielige Gegenstände zu ersetzen sind. Ein Beispiel für ein Chromatogramm, das diese abnorme Probenverarbeitung widerspiegelt, ist in Abbildung 3dargestellt. keine Spitzen eluiert, was dazu führt, dass keine Daten über die PG-Zusammensetzung vorhanden sind. Eine falsche Anpassung des pH-Wertes auf deutlich unter dem isoelektrischen Punkt der Muropeptiden(z.B. auf einen pH-Wert von 2) kann auch zur Ausfällung von Muropeptiden und damit zum Fehlen erkennbarer Spitzen aus der UPLC-Analyse führen.

Abbildung 1. Schematic der Sacculi Vorbereitung. Diese Methode beruht auf iterativen Runden der Ultrazentrifugation, um SDS weg von den pelleted sacculi zu reinigen.

Abbildung 2. Beispiel UPLC-Chromatogramm von PG aus Sacculi, die aus E. coli MG1655-Zellen verdaut wurden. Beachten Sie, dass eine vergleichbare Auflösung aller Muropeptide in 10% der Zeit eines typischen HPLC-Laufs erreicht wird. Muropeptid-Etiketten - M = Monomer, D = Dimer, T = Trimer; (2,3,4,5) die Anzahl der Aminosäurestammpeptide angeben; Modifikationen - G = Glycin ersetzen L-Alanin, L = zwei zusätzliche Aminosäuren aus Pronase E Spaltung, D = 3,3-Diaminopimelsäure (DAP)-DAP Querbrücke, N = Ende anhydro-muropeptid. Zum Beispiel ist D33DL ein Dimer mit 3-aa-Stammpeptiden, verbunden durch eine DAP-DAP-Querbrücke, die zwei zusätzliche Aminosäuren aus Pronase E-Spaltung enthält.

Abbildung 3. Erfolglose UPLC-Analyse von Sacculi, die aus E. coli MG1655-Zellen verdaut wurden. Das Fehlen von Spitzen, die darauf hindeuten, dass in der Probe keine Muropeptide vorhanden waren, ist darauf zurückzuführen, dass Muropeptide vor der Extraktion in eine UPLC-Durchstechflasche aus der Lösung stürzten (Schritt 4.4). Dieser Niederschlag kann darauf zurückzuführen sein, dass die Muropeptiden überkonzentriert sind oder der pH-Wert zu niedrig ist.

Die Produktionskosten für diesen Artikel wurden von der Waters Corporation gesponsert.