Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während C. elegans Embryogenese

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Bildteilenden Zellen in den Entwicklungs Caenorhabditis elegans Embryonen. Insbesondere konzentriert sich dieses Protokoll auf, wie man Bild Division Neuroblasten, die unterhalb der epidermalen Zellen zu finden sind und kann wichtig für den epidermalen Morphogenese sein. Gewebebildung ist entscheidend für die Entwicklung Metazoen und setzt auf externe Signale von benachbarten Geweben. C elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus zur Morphogenese in vivo aufgrund seiner Transparenz und einfache Organisation zu studieren, was seine Gewebe einfach über Mikroskopie zu untersuchen. Ventralen Gehäuse ist der Prozess, wo die ventrale Oberfläche des Embryos durch eine einzige Schicht von Epithelzellen bedeckt. Dieses Ereignis wird angenommen, durch die zugrunde liegenden Neuroblasten, die chemische Führungssignale bereitzustellen, um die Migration der darüberliegenden Epithelzellen vermitteln erleichtert werden. Jedoch sind die Neuroblasten hochproliferative und kann auch handelnals mechanischer Träger für die ventrale Epidermiszellen. Studien mit diesen experimentellen Protokoll könnte die Bedeutung der interzellulären Kommunikation bei der Gewebebildung zu enthüllen, und könnte verwendet werden, um die Rollen von Genen in die Zellteilung in sich entwickelnden Geweben beteiligt zu offenbaren.

Einleitung

Zwar gibt es Protokolle, die beschreiben, wie Bild der Zellteilung in der frühen C elegans Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Gewebe während der Embryogenese Mitte. Eine der großen Herausforderungen bei der Abbildung Organismen während der Entwicklung ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität. Allerdings hat erhöhte Zugänglichkeit zu drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopen oder Wischfeld-Mikroskopen weiter verbreitet Imaging-Anwendungen erlaubt. Beide Systeme verwenden Festkörperlaser und gestreuten Lichts, die Begrenzung der Pegel von UV, das die Organismen ausgesetzt sind. Allerdings kann Weitfeld steht immer noch für die Bildgebung in vivo verwendet werden, insbesondere, wenn sie mit Kameras mit hoher Empfindlichkeit (z. B. EMCCD), Blendensteuerung und Lichtsteuerung (zB LEDs oder verstellbare Quecksilberbirnen) ausgestattet. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie entweder auf der Basis eines konfokalen System oder ein Weitfeld-System, um Bild die Zellteilung in den Entwicklungs C verwenden elegans </ Em> Embryos. Als wir beispielsweise, wie man Bild Neuroblast Zellteilung zu beschreiben. Neuroblasten kann epidermalen Morphogenese durch chemische oder mechanische Signale zu den darüberliegenden Epidermiszellen zu erleichtern, und liefern ein ausgezeichnetes Beispiel für die Bedeutung der interzellulären Kommunikation bei der Bildung von Geweben.

Caenorhabditis elegans ist ein idealer Modellorganismus für die Mikroskopie basierte Studien aufgrund seiner Transparenz und einfache Gewebeorganisation ^ein. Außerdem C. elegans zugänglich ist genetischen Methoden und RNAi, und da viele der Gene humanen Homologen, kann es verwendet werden, um konservierte Mechanismen zur Gewebebildung ^2-5 identifizieren. In C. elegans, die Bildung der Epidermis tritt in der Zwischenembryogenese, wenn der Embryo> 300 Zellen. Epidermalen Morphogenese besteht aus mehreren Hauptphasen, in denen der Embryo wird in eine Schicht aus epidermalen Zellen, eingeschlossen verengen und zu erweitern, um die Transformation embryo aus eiförmigen Form in die längliche Form eines Schnecken ^6. Ventrale Gehäuse beschreibt eine der morphogenetischen Ereignisse, als die ventralen epidermalen Zellen wandern in Richtung der ventralen Mittellinie, um die Bauchseite des Embryos (Abbildung 1) zu decken. Zuerst werden zwei Paare von vorderen Führungskante liegt Zellen wandern in Richtung der ventralen Mittellinie, wo sie anhaften und Sicherung mit ihren Nachbarn kontralateralen ^6. Dies wird durch die Migration der hinteren Tasche befindet sich Zellen, die keilartige Formen Schaffung einer Bauchtasche ^6-7 bilden gefolgt. Der Mechanismus, der die Tasche geschlossen ist nicht gut verstanden. Eine Möglichkeit ist, dass eine supra Aktin-Myosin kontraktile Struktur bindet die Tasche Zellen zusammen in einer Tabaksbeutel wie Mode, ähnlich wie Wundheilungs ^8. Interessanterweise wird die Migration einiger der Tasche Zellen durch spezifische Teilmengen von Basisneuroblasten ⁹ (neuronale Vorläufer, die unter der epidermi gefunden werden vermitteltens, Fig. 1B).

Frühere Studien zeigten, dass die Neuroblasten regulieren ventralen epidermalen Zellmigration und ventralen Gehäuse. VAB-1 (Ephrin-Rezeptor) und VAB-2 (Ephrin-Liganden) sind hoch in der Neuroblasten ausgedrückt und voneinander erleichtert das Sortieren der vorderen und hinteren Neuroblasten und Mutationen in vab-1-oder-2 vab Ursache ventralen Gehäuse Phänotypen ^10-13. Jedoch Promotor Rettungsexperimente zeigten, daß VAB-1 wird auch in der darüberliegenden Bauch epidermalen Zellen und Rezeptoren für andere Führungssignale von den Neuroblasten sezerniert erforderlich sind in den ventralen Hautzellen ⁹ ausgedrückt. Obwohl Mutationen in einem dieser Rezeptoren verursachen Bauch Gehäuse Phänotypen, ist es nicht klar, ob Defekte entstehen durch Probleme in der Neuroblast Positionierung oder durch Ausfall der ventralen epidermalen Zellen zu reagieren Führung ¹⁴ Queues. Ändern der Teilung der Neuroblasten wiThout die ihre Fähigkeit, Führungssignale absondern könnte Licht auf die Rolle der Neuroblasten und ihre Fähigkeit, mechanische Eingangs während epidermalen Morphogenese bieten zu vergießen. Kürzlich wurde festgestellt, daß eine Zellteilung Gen ani-1 (Anillin) ist hoch in Neuroblasten (2A) ausgedrückt und seine Erschöpfung verursacht Neuroblasten Teilungsfehler. Interessant ist, dass diese Embryonen anzuzeigen ventralen Gehäuse Phänotypen (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen).

Anillin ist für die Zellteilung erforderlich ist, und insbesondere für die Cytokinese, die das Verfahren, bei dem eine Mutterzelle physikalisch unterteilt in zwei Tochterzellen beschreibt. Zytokinese wird durch die Bildung eines Aktomyosin Kontraktionsring, der fest in Raum und Zeit gesteuert werden, um sicherzustellen, dass er richtig mit Schwester-Chromatid-Trennung gekoppelt werden muss angetrieben. Die Master-Regulator der Zellteilung ist metazoan RhoA (RHO-1 in C. elegans), eine kleine GTPase, die eine istctive in seiner GTP-gebundenen Form. Die GEF Ect2/ECT-2 RhoA aktiviert, nach der RhoA-GTP interagiert mit Effektoren, die die Kontraktionsring zu bilden und zu vermitteln seine Eindringen ^15. Anillin ist ein Multidomänen-Protein, das RhoA über seinen C-Terminus und an Actin und Myosin über seinen N-Terminus bindet. Anillin erforderlich ist, um die Position des kontraktilen Ring in Säugetier-oder Drosophila S2 Zellen ¹⁶ zu stabilisieren. Anillin Erschöpfung verursacht Kontraktionsringe, um seitliche Schwingungen zu unterziehen, und Zytokinese schließlich ausfällt Bildung kernigen Zellen ^17-19. Interessant, wenn auch C. elegans ani-1-Koordinaten Aktomyosin Kontraktilität im Embryo, ist es nicht wesentlich für die Cytokinese. Jedoch, wie oben beschrieben, ani-1 ist für Neuroblast Zytokinese in der Zwischenembryogenese (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen) erforderlich. Cytokinesis Scheitern würde die Anzahl und Position der Neuroblasten verändern und könnte die Lok beeinflussenation von chemischen Führungssignale, oder es könnte die mechanischen Eigenschaften des Gewebes verändern. Beide Modelle unterstreichen die Rolle der nichtautonomen für Neuroblasten ventralen Gehäuse, und die Bedeutung der Gewebe-Gewebe-Kommunikation während der embryonalen Entwicklung.

Das Versuchsprotokoll beschreibt, wie Bild Zellteilung während C. elegans Mitte Embryogenese unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Mehrzahl der Experimente, die die Mechanismen der Zellteilung in Einzelzellen in Kulturschalen (zB. HeLa-Zellen oder S2) oder in frühen Embryonen mit einer begrenzten Anzahl von Zellen (z. B. C. elegans ein Embryo, Xenopus oder stachelhäuter durch Embryonen). Jedoch ist es wichtig, auch die Zellteilung im Gewebe zu untersuchen, wie es externe Signale, die den Zeitpunkt und die Platzierung der Teilungsebene beeinflussen können. Weiterhin können Zellen, chemische oder mechanische Signale bereitzustellen, um die Entwicklung der benachbarten Gewebe beeinflussens, und es ist wichtig zu verstehen, wie die interzelluläre Kommunikation hilft Geweben während der Entwicklung zu bilden.

Protokoll

1. Herstellung von Platten für die Pflege Worm Stämme und Darstellende RNAi

1. Nematode Wachstumsmedien Platten
   1. Platten
      1. Bereiten Nematode Growth Medien (NGM) Platten Wurm Stämme zu erhalten und genetische Kreuzungen durchzuführen. Kombinieren Sie 3 g NaCl, 17 g Agar und 2,5 g Bactopepton mit 1 l destilliertem Wasser in einem 2-l-Kolben und fügen Sie einen Metall Rührstab.
      2. Autoklavieren den Kolben auf den Agar zu lösen und die Medien zu sterilisieren. Dann wird der Kolben auf einer Rührplatte und lassen Sie die Medien unter Rühren abkühlen.
      3. Sobald die Medien abgekühlt und ist immer noch etwas warm an (45-50 ° C), 1 ml 1 M CaCl _2, 1 ml 1 M MgSO _4, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin-Lösung und 25 ml 1 M Kaliumphosphat Puffer (PPB; Rezept in der Tabelle von Reagenzien / Materialien, Filter sterilisieren Lager-Lösungen) und gießen Sie sofort die Medien in kleine Petrischalen (60 mm x 15 mm, füllen die Teller ~ 3/4 an die Spitze oder 13 ml / Platte using eines automatischen Spender). Anmerkung: Für Langzeitwartung von einigen Stämmen Tetracyclin mit den Platten (12,5 &mgr; g / ml) zugegeben werden, um Tn10 Transposon Inaktivierung der bakteriellen RNase III-Gens ermöglichen.
      4. Lassen Sie die Medien erstarren über Nacht bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Platten sollten in einer biologischen Haube oder in einem Bereich der Labor die weniger anfällig für Verschmutzung ist gehalten werden. Entfernen Sie außerdem keine Kondensation, die bis auf den Deckeln (z. B. Rein mit Seidenpapier), um Pilzbefall zu begrenzen gebaut wurde. Wenn Tetracycline wird auch auf die Platten gegeben, dann decken Sie sie mit Aluminiumfolie als dieses Antibiotikum ist lichtempfindlich.
      5. Am nächsten Tag, die trockenen Samen NGM-Platten mit einer Suspension von E. coli (OP50-Stamm, siehe Abschnitt 1.1.2), die sanft geschüttelt wurde. Um Platten für die Paarung zu machen, fügen ~ 50 ul OP50 auf die Mitte jeder Platte (um einen kleinen Kreis zu bilden). Um Platten für die Aufrechterhaltung der Wurm Stämme machen, Saatgut jedes NGM-Platte mit ~ 100-200 ul OP50 (bisdass es umfasst eine größere Fläche der Platte).
      6. Lassen Sie die Platten ausgesät trockenen O / N bei Raumtemperatur.
      7. Am nächsten Tag, schalten Sie die getrockneten NGM-Platten auf den Kopf und stapeln sie in Kunststofflagerbehälter bei 4 ° C Hinweis: Die Platten sind bis ~ 3-4 Wochen verwendbar. Platten, die Tetracyclin im Dunkeln gehalten werden.
   2. Lebensmittel
      1. Verwenden Sie E. coli OP50 [vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] als Nahrungsquelle für C. . elegans Hinweis: OP50 als Glycerinstammkulturen bei -80 ° C (1:1 in 50% v / v Glycerol) gespeichert werden.
      2. Um OP50 für die NGM-Platten zu machen, stellen einen Streifen Platte mit einem kleinen Aliquot der Glycerin-Stamm (<10 ul; eine sterile Pipettenspitze). Verbreiten Sie die Bakterien auf einer LB-Agar-Platte (Rezept in der Tabelle von Reagenzien / Materialien) und lassen Sie ihn bei 37 ° C für ca. 16 Stunden. Hinweis: Wenn es Probleme mit Verschmutzung, kann Streptomycin resistent OP50 verwendet werden, einend Streptomycin an die LB-Agar-Platten (50 &mgr; g / ml) zugegeben werden.
      3. Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen 100 ml flüssigem LB-Medium (Rezept in der Tabelle von Reagenzien / Materialien) in einem 500 ml-Kolben.
      4. Lasst die Kultur wachsen O / N bei 37 ° C mit Schütteln.
      5. Am nächsten Tag, verwenden Sie die Bakteriensuspension für die Aussaat NGM-Platten. Hinweis: OP50 in 50 ml konischen Röhrchen aliquotiert und bei 4 ° C für ca. 4-6 Wochen gelagert werden.
2. RNAi
   Fütterung ist eine der wichtigsten Möglichkeiten, um RNA-Interferenz vermittelte durchführen (RNAi, um eine bestimmte Gen-Produkt Knockdown) in C. elegans. C elegans Hermaphroditen kann E. zugeführt werden coli-Stamm HT115 mit einem Vektor, der Fütterung dsRNA nach Induktion exprimiert umgewandelt. Diese dsRNA (oder deren Fragmente) in den Gonaden übertragen, in der Regel zu einer erheblichen Zuschlags des spezifischen Zielgens.
   1. RNAi-Platten
      1. Vorbereitung NGM-Platten, wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 1.1.1), aber auch 1 ml 1 M IPTG (Isopropylthio-beta-D-Galactosid, um die Expression der dsRNA herbei) und 500 ul 50 mg / ml Ampicillin (Amp; den Vektoren dsRNA Amp fest) zum warmen Medien (45-50 ° C).
      2. Nachdem die Platten getrocknet sind, entkernen mit ~ 50-100 ul E. coli HT115 (siehe Abschnitt 1.2.2). Hinweis: ungesetzte Platten können bei 4 ° C für ca. 4-5 Wochen gelagert werden.
      3. Lassen Sie die Platten ausgesät trocknen über Nacht bei Raumtemperatur.
      4. Am nächsten Tag, schalten Sie die getrockneten RNAi-Platten auf den Kopf und speichern sie in einem Kunststoff-Lagerbehälter bei 15-20 ° C Hinweis: Gesetzte Platten behalten RNAi-Effizienz für bis zu ~ 2-3 Wochen.
   2. RNAi Essen
      1. Verwenden Sie E. coli HT115 (aus dem CGC, siehe Abschnitt 1.1.2) mit der Fütterung Vektor-L4440, L4440 oder die cDNA zu einem Gen von Interesse umgewandelt. Hinweis: Füttern Bibliotheken, die die Mehrheit der offene Leserahmen im Genom gezieltwurden bereits hergestellt und sind (Klone in L4440 in HT115 verwandelt, z. B. mit einem Fragment aus Y49E10.19 für ani -1 ^20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / Seiten / rnai.html). Hinweis: HT115 als Glycerinstammkulturen bei -80 ° C (1:1 in 50% v / v Glycerol) aufzubewahren.
      2. Um eine neue Targeting-Konstrukt ein Gen von Interesse zu erzeugen, sehen Sie die L4440 Vektorkarte und cDNA-Klon zwischen den flankierenden T7-Promotoren, die durch IPTG induzierbaren sind.
      3. Trans HT115 mit der L4440 Konstrukt mit einem Standard-Protokoll für die Transformation (zB chemisch kompetente Bakterien machen und durchzuführen, Hitzeschock-Transformation).
      4. Wie für OP50 beschrieben (siehe Abschnitt 1.1.2), sollte Serie Bakterien aus dem Glycerin Lager auf einer LB-Agar-Platte, aber die Platte auch enthalten 50 ug / ml Ampicillin. Hinweis: Wenn Sie eine Pre bestehenden L4440 Konstrukt, Abschnitte überspringen 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen 5 mlLB-Medium, das 5 ul Ampicillin aus einer 50 mg / ml Stamm (LB Amp), und legen Sie es auf 37 ° C unter Schütteln.
      6. Nach ca. 16 Stunden, impfen 5 ml frischem LB-Amp-Medium mit 50 ul der O / N-Kultur wachsen und die Kultur für 7-8 h bei bei 37 ° C schüttelnd
      7. Zentrifugieren Sie die Bakterien für 1 min bei 4.000-8.000 g, den Überstand verwerfen und das Pellet in 500 ml frisches LB-Amp-Medien.
      8. Verwenden Sie diese Bakterienlösung, um die RNAi-Platten Saatgut, wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 1.2.1). Hinweis: HT115 sollte sofort verwendet werden und sollte nicht gespeichert werden.

2. Der Anbau Worm Stämme

Pflegen C. elegans Stämme aus der CGC nach Standard-Protokoll ¹ bestellt am NGM-Platten. Stämme für dieses Protokoll verwendet werden, umfassen: C. elegans var. Bristol, Wildtyp (Stamm-ID bei CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [Schinken-1 TY1 :: :: :: EGFP 3xFLAG + unc-119 (+)] (Stamm-ID bei CGC OP102); unc-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pie-1P-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (Stamm-ID bei CGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (Stamm-ID bei CGC SU159); unc-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: hmr-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (Stamm-ID bei CGC FT250).

1. Wähle ~ 3 jungen Erwachsenen Hermaphroditen, die die richtige Phänotyp zu einem frischen NGM Platte anzuzeigen. Hinweis: N2 (var. Bristol; Wildtyp) zwischen 15-25 ° C gehalten werden, aber sie werden Dichte bei höheren Temperaturen schneller zu erreichen. Neue Bestände sollte vorgenommen werden, wenn die Schneckendichte ist hoch.
2. Bewahren fluoreszierende Stämme (z. B. GFP und / oder mCherry exprimierenden Würmer) bei 20-25 ° C für eine optimale Expression von fluoreszierenden Proteinen. Neue Bestände sollte vorgenommen werden, wenn die Schneckendichte ist hoch und Lebensmittel sei.
3. Um Würmer holen, verwenden Sie einAbholung mit einem Platindraht am Ende gezogen (~ 3-5 cm Länge) fusioniert aus einer Glaspipette gezogen werden. Glätten Sie das Kabel mit einem glatten Rand. Verwenden Sie die Pick zu "Schaufel" bis Hermaphroditen und übertragen Sie sie auf neue Platten. Flamme den Draht in zwischen der Verwendung, um Kreuzkontamination von Stämmen zu vermeiden.

3. RNAi

1. Darstellende RNAi
   1. Zunächst Ort ~ 8 L4 Hermaphroditen auf einer ungesetzte NGM Platte für ~ 30-60 Minuten, um die OP50 Bakterien aus der Würmer zu entfernen.
   2. Dann legen Sie die 8 Hermaphroditen auf eine NGM Amp IPTG-Platte mit HT115 ausgesät, die die L4440 Plasmid, dsRNA zu einem Gen von Interesse führt (z. B. ani-1;. Siehe 1.2) für ~ 24 Stunden. Hinweis: Je nach dem Gen von Interesse, oder die gewünschten Phänotypen (die auf die Stärke der Zuschlags abhängen kann), können Würmer auf den RNAi-Platten für kürzere oder längere Zeit verlassen werden (nach 24 h, legen Sie die Hermaphroditen auf frischen RNAi Platten).
   3. Für eine neg.tive Kontrolle, Ort Würmer auf einem RNAi-Platte ausgesät mit HT115 Durchführung der leeren L4440 Vektor. Hinweis: Diese Embryonen sollten keine Phänotypen haben.
   4. Für eine positive Kontrolle, legen Würmer auf einem RNAi Platte dsRNA exprimieren, die ein Gen mit gut charakterisierten Phänotypen abzielt. Hinweis: rho-1 (Y51H4A.3), sind zu 100% tödlich Embryonen nach 24 h und Hermaphroditen sind steril nach 48 Stunden.
2. RNAi Wirksamkeit
   Die Niveaus der Zuschlags durch RNAi sollte getestet werden, zumal einige Gewebe kann widerstandsfähiger als andere. Während der frühen Embryogenese Mitte, die meisten Gewebe sind RNAi-empfindlich, aber in den späten Embryo oder Larve, sind Neuronen RNAi fest. Verschiedene Stämme können verwendet werden, um RNAi-Empfindlichkeit (z. B. RRF-3) zu verbessern oder gewebespezifische RNAi (zB SID-1 in Kombination mit einem Transgen von dem neuronalen Promotor unc-119 exprimiert) zu erzeugen.
   1. Western-Blotting
      Immunoblotting mit C. elegans Proteine ​​könnenausgeführt nach dem Standardprotokoll ^22.
      1. Nach der Durchführung von RNAi, sammeln ~ 10 trächtige (gefüllt mit Embryonen) Hermaphroditen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 20-30 ul 1x SDS-PAGE-Probenpuffer und Lyse durch Kochen für ~ 2 min. Ebenso sammeln N2 Würmer in einem separaten Röhrchen für die Kontrollprobe. Anmerkung: Die Anzahl der Hermaphroditen je nach der Empfindlichkeit der Primärantikörper variieren.
      2. Neues Verdünnungen der Kontrollstichprobe (zB 3-100%) in Probenpuffer. Laden Sie die Steuer-und RNAi-Proben und durch SDS-PAGE nach Standardprotokoll (die%-Gel wird in Abhängigkeit von der Größe des Proteins von Interesse variieren).
      3. Übertragen Sie das Gel auf eine Membran und führen Immunoblotting nach Standard-Protokoll. Hinweis: Verwenden Sie verschiedene primäre und sekundäre Antikörperverdünnungen wie für jeden Antikörper empfohlen.
      4. Entwickeln Sie (z. B. bei Verwendung von Chemilumineszenz) oder scannen (z. B. bei Verwendung von Fluoreszenz) den Immunoblot und vergleichen thE Dichte von Bands in den Gassen N2 gegen den RNAi Spur und bestimmen den Grad der Zuschlags (z. B. die Dichte des RNAi-Spur entspricht der 12%-Kontrollspur legt dies nahe, dass das Protein um 88% reduziert). Hinweis: Um die Effizienz der ANI-1-Knockdown, finden Maddox et al ^23.
   2. Immunfärbung
      Immunfärbung in C. elegans kann nach Standardprotokoll ²² durchgeführt werden.
      1. Nach der Durchführung von RNAi, sammeln schwangeren Hermaphroditen und Ernte Embryonen mit einer der beiden Methoden. Für eine der Methoden, Ort Hermaphroditen in M9-Puffer (Rezept in der Tabelle von Reagenzien / Materialien) in 1,5 ml durch Zentrifugation (1000-4000 xg) silikonisiert Mikrozentrifugenröhrchen und Pellets. Hinweis: Ebenso sammeln N2 schwangeren Hermaphroditen.
      2. Entfernen Sie die M9-Lösung.
      3. Auszustoßen Embryonen durch Zugabe von 1 ml Bleichlösung (1 M NaOH, 5% Bleichmittel) zu dem Mikrozentrifugenröhrchen für 3 min. Ebenso Bleich N2 errmaphrodites zu Kontrollobjektträger zu machen.
      4. Vortex sanft, dann Pellet sofort die Embryonen durch Zentrifugation (4.000-8.000 xg) und entfernen Sie die Bleichlösung. Hinweis: Die Gesamtzeit, die die Würmer mit Bleichmittel inkubiert sollte 5 Minuten nicht überschreiten.
      5. Wasche die Embryonen 3x mit Tris-gepufferter Saline (TBS, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) und Transfer-Embryonen unter Verwendung einer Glaspasteurpipette auf eine Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger. Hinweis: Zur Beschichtung eines Glasobjektträger mit Poly-L-Lysin, wischen Sie die erste Rutsche, dann einen Tropfen (~ 20-30 ul) von Poly-L-Lysin und verteilt es gleichmäßig über die Oberfläche und trocknen lassen. Für optimale Ergebnisse Mantel den Folien zwei weitere Male. Eine alternative Methode, um Embryonen (§ § 3.2.2.1-3.2.2.5) sammeln, um einen Tropfen M9 auf eine Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger platzieren und holen ~ 10 graviden Hermaphroditen in den Tropfen.
      6. Fügen Sie ein Deckglas auf jedes Mikroskop-Objektträger (auf den Bereich, der die meisten Embryonen enthält) und Ortdie Objektträger in flüssigem Stickstoff. Hinweis: Für die Zwitter direkt in die Tropfen gelegt, durch Druck auf das Deckglas aufbrechen die Hermaphroditen und vertreiben die Embryonen.
      7. Gefrier knacken die Embryonen durch Schwenken von den Deckgläsern sofort nach dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
      8. Objektträger in eiskaltem Methanol für 20 min, um die Embryonen zu beheben. Hinweis: Bei einigen Antigenen kann ein Vernetzungs Fixiermittel wie Paraformaldehyd bevorzugt ist. Siehe das Protokoll von ²² Duerr.
      9. Rehydrieren und Permeabilisierung der Embryonen durch Waschen der Objektträger 4x mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) für jeweils 10 min.
      10. Trocknen Sie jede Folie rund um den Bereich, der die meisten Embryonen enthält, und ziehen Sie einen Kreis um die Embryonen mit Hilfe eines flüssigen Sperrstift (z. B. PAP-Stift).
      11. In ~ 100 ul TBST mit 5% normalem Esel-Serum (NDS; Block) zu jeder Folie (eingekreist Bereich) und Inkubation für20 min bei RT. Hinweis: Legen Sie die Folien in einer "feuchten Kammer" (z. B. eine Schüssel mit Deckel enthält nasse Papiertücher).
      12. Entfernen Sie den Block, fügen ~ 50-100 ul Primärantikörper (in TBST verdünnt) zu jeder Folie (eingekreist Bereich) und Inkubation für 2 Stunden bei RT. Hinweis: Je nach der Antikörper kann die Verdünnung und Inkubationszeit variieren. Um GFP erkennen, verwenden wir eine Anti-Maus-Anti-GFP primären Antikörper in einer 1/200 Verdünnung. Um ANI-1 erkennt, verwenden wir eine Anti-Kaninchen-Anti-ANI-1 primären Antikörper in einer 1/1600 Verdünnung (freundlicherweise von Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill zur Verfügung gestellt). Für längere Inkubationszeiten, die Objektträger bei 4 ° C.
      13. Entfernen Primärantikörper (wenn möglich, halten Sie für zukünftige Verwendung) und waschen Folien 3x mit TBS für jeweils 5 min.
      14. Entfernen Sie die letzten Wasch und fügen ~ 50-100 ul Sekundärantikörper (in TBST verdünnt) zu jeder Folie (eingekreist Bereich) und Inkubation für 2 Stunden bei RT. Hinweis: Je nach dem Antikörper kann eine Verdünnung variieren. Um GFP erkennen, verwenden wir ein anti-Maus-Alexa Fluor 488 Sekundärantikörpers in einer 1/250 Verdünnung. Um ANI-1 erkennt, verwenden wir eine Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 568 Sekundärantikörpers in einer 1/250 Verdünnung.
      15. Sekundärantikörper entfernen und waschen Folien 3x mit TBS für jeweils 5 min. Hinweis: Um Fleck DNA, fügen ~ 50-100 ul DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindol, 1 mg / ml) bei 1/500 Verdünnung in TBST für 5 min.
      16. DAPI entfernen und waschen Dias 2x mit TBS für jeweils 5 min. Hinweis: Wenn DAPI-Färbung nicht durchgeführt wird, überspringen Sie diesen zusätzlichen Waschschritt.
      17. Führen Sie eine schnelle Wäsche mit 0,1 M Tris (pH 9), zu entfernen und ~ 15 ul Montage Medien vorgewärmt auf 37 ° C (4% n-Propyl-trihydroxybenzoat 3.4.5 (Propylgallat), 50 mM Tris, pH 9 in 50% Glycerin) zu jeder Folie (eingekreist Bereich).
      18. Fügen Sie ein Deckglas zu jeder Folie (auf der Oberseite der Montage Medien in der eingekreisten Bereich), Wick Sie die überschüssige Flüssigkeit und versiegeln die Dias mit Nagellack. Hinweis: Folien können bei -20 ° C gelagert werden
      19. Beachten Sie die Embryonen aufdie Objektträger mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop oder konfokaler Laser-Scanning-Mikroskop. Wichtig ist, passen Sie die Einstellungen, um Bilder der optimale Pixelintensität sammeln mit Steuer (N2 oder nicht-RNAi) Embryonen. Dann sammeln Bilder von RNAi Embryonen mit denselben Einstellungen. Beispiele für Bilder für Steuer vs gesammelt ani-1 RNAi Embryonen sind in Fig. 2B gezeigt.

4. Herstellung von Folien für Live-Imaging und Ernten Embryonen

1. Herstellung von Agarose-Pads für die Live-Darstellung
   1. Setzen Sie eine saubere, vorgewärmt Mikroskop-Objektträger zwischen zwei anderen Folien, die jeweils mit 1-2 Streifen Klebeband auf sie.
   2. Mit einer Glaspasteurpipette einen Tropfen von 2% w / v Agarose (in beheizten destilliertem Wasser gelöst) auf den Objektträger.
   3. Stellen Sie schnell einen zweiten, sauberen Objektträger auf der ersten Folie in einer senkrechten Weise, um die Agarose Tropfen zu glätten. Hinweis: Das Klebeband auf der Nachbar geschobenes stellt die Dicke der Unterlage.
   4. Lassen Sie die Agarose-Pad trocken für ein 1-2 Minuten vor dem Entfernen der oberen Folie. Ziehen Sie den Oberschlitten vorsichtig, damit brechen die Agarose-Pad darunter. Hinweis: Manchmal ist die Unterlage ist an dem oberen Objektträger übertragen und noch verwendbar ist, solange sie intakt bleibt.
   5. Transfer der Embryonen auf das Agarose-Pad innerhalb weniger Minuten nach der Herstellung, wie unten beschrieben (siehe Schritt 4.2). Hinweis: Das Pad sollte ein opakes Aussehen haben, sobald klar ist, zu trocken zu bedienen ist.
2. Ernten Embryonen
   1. Verwenden Sie das folgende Protokoll für das Sammeln von Embryonen für die Live-Aufnahmen, die von Sulston et al. Abgeleitet ist ²⁴
   2. Wählen ca. 4-6 schwangeren Erwachsenen (nicht verhungert) von NGM oder RNAi-Platten und legen Sie sie in 20-30 ul M9-Puffer in einem gut auf einer Depression Rutsche.
   3. Verwenden Sie einen sterilisierten Skalpell, um die Würmer auf beiden Seiten des Spermatheka zu schneiden (oder alternativ in der Nähe der Vulva)frei Embryonen in der Lösung.
   4. Verwenden Sie einen Gummischlauch mit einem Mundstück zu einem Glas Kapillare / Pipette verbunden gezogen, um eine kleine Bohrung haben und saugen die Embryonen durch Pipettieren mit dem Mund. Alternativ sammeln Embryonen mit einer Kapillare Glasröhre, die mit einer Pasteur-Pipette Gummiball befestigt ist.
   5. Übertragen Sie die abgesaugt Embryonen zu einem zweiten und auch M9-Puffer mit, zu helfen, trennen sie von der Schnecke Schutt.
   6. Dann Saug die Embryonen auf eine frisch zubereitete Agarose-Pad (siehe Schritt 4.1).
   7. Büschel Embryonen zusammen mit der Wimper (bis zu einem Zahnstocher geklebt), die Anzahl der Embryonen, die in einem x, y-Ebene gedreht werden kann erhöhen. Hinweis: Um Sauerstoffmangel zu vermeiden, mehr als 10 Embryonen, die nicht verklumpen nicht.
   8. Dann bedecken Sie die Objektträger mit einem Deckglas und teilweise verschließen Sie diese mit bereits erwärmten Flüssigkeit VALAP (Vaseline, Lanolin und Paraffin, geschmolzen und kombiniert 01.01.01) um Austrocknung der Embryonen während der Bildgebung zu verhindern. Hinweis: Zusätzliche M9 Puffer ca.n dem Pad zugegeben werden, um sicherzustellen, dass Embryonen ausreichend Flüssigkeit für die Bildgebung. An die Stelle der VALAP kann Vaseline verwendet werden, um teilweise Deckgläschen verschließen, aber es ist weniger starr wodurch die Deckgläser zu rutschen und konnte auf die Mikroskopobjektive zu bekommen.

5. Live-Imaging

1. Um Neuroblasten sichtbar zu machen, erhalten einen Wurm Belastung, die eine Neuroblast-spezifische Protein mit einem fluoreszierenden Protein gebunden drückt (zB HAM-1: GFP, Stamm-ID bei CGC OP102). Um die Zellmembranen zu erkennen, verwenden Sie ein Wurmstamm, die auch ein Proteindomäne, die Lipide auf eine andere Fluoreszenzprotein gebunden erkennt (zB mCherry:. PH, Dehnung ID bei CGC OD70).
2. Ernte-Embryonen aus fluoreszierenden Zwitter hielt auf Steuer-oder ani-1-RNAi-Platten (siehe Protokolle 3 und 4), und bereiten Folien, wie oben beschrieben (siehe Protokoll Nr. 4).
3. Bild Embryonen in 4D (x, y, z und Zeitraffer) durch Epifluoreszenzmikroskopie. Verwenden Sie entweder eine widefield System [automatisierten Fluoreszenzmikroskop mit Filtern für GFP und TexasRed, Ziele bis zu 60X oder 100X, einer hochauflösenden CCD (Charge Coupled Device)-Kamera, hoch motorisierte Stufe (z. B.. Piezo Z) und spezialisierte Erfassungssoftware] oder ein Livescan-Wischfeld konfokalen Mikroskop [automatisierten Fluoreszenz-Scanning-Mikroskop mit 488 nm und 561 nm Laser, Ziele bis zu 100X, einer EMCCD (Elektronenvervielfachungs CCD)-Kamera, hoch motorisierte Stufe (zB Piezo-Z) und spezialisierte Erfassungssoftware]. Hinweis: Für die Weitfeld-System, mit LEDs und einem EMCCD Kamera Phototoxizität zu begrenzen. Auch kann eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop anstelle des Wischfeld-System verwendet werden.
4. Um das Bild zu Neuroblast Zellteilung auf beiden Systemen zu finden x, y Rahmen von Embryonen mit Hilfe der 10X oder 20X Ziele, und wählen Sie eine optimale x-, y-Frame, in dem die Embryonen unterziehen Rücken Einlagerung (Schritt vor dem ventralen Gehäuse, 1A) oder in frühen Stadiender ventralen Gehäuse (~ 350 min nach der ersten Zellteilung, 1A).
5. Am Wischfeld-Mikroskop, verwenden Sie die 488 nm und 561 nm 100 mW-Laser bei 40% Leistung mit einem Schlitz von 50 Jahren. Auf der Weitfeldsystem verwenden Sie die GFP und TexasRed-Filter mit niedriger bis mittlerer Lichtintensität (wenn steuerbar). Hinweis: Für die Weitfeldsystem haben LEDs geringe Phototoxizität und vorzuziehen.
6. Auf beiden System verwenden Sie die 60X oder 100X-Ölimmersionsobjektiven und sammeln Sie 20 Z-Stapel von 0,2 um alle 2 min für insgesamt 10 min. Hinweis: Obwohl der HAM-1: GFP und mCherry: PH-Sonden Ausdruck auf relativ hohem Niveau, werden die Belichtungszeiten für jeden Fühler müssen für verschiedene Mikroskope optimiert werden. Hinweis: Für die Weitfeldsystem werden weniger Z-Stapel empfohlen, Phototoxizität zu begrenzen und für die Bildgebung über längere Zeit verwenden Sie weniger Zeitpunkten.
7. Um Phototoxizität durch die Belichtung von Embryonen mit UV-Licht auf der Weitfeldsystem zu minimieren (bei Verwendung eines SöldnersUry Glühbirne), schließen Sie die Blende auf 30% und eine Verringerung der Lichtintensität (unter Verwendung eines einstellbaren Beleuchtungssystem). Anmerkung: Obwohl Verstärkung nicht entweder mit System erforderlich, können andere Mikroskope Lichtquellen mit niedriger Intensität oder Ziele mit unterschiedlichen numerischen Aperturen, welche die Verwendung von Verstärkungs erfordern könnte, um Bilder von optimalen Pixelintensität zu erhalten. Testen der Bedingungen unter Verwendung eines Kontrollembryo, um sicherzustellen, daß alle beobachteten Phänotypen aufgrund artifactual Phototoxizität.

6. Analyse von Mikroskopie Daten

1. Um die Bilder-, Export-Dateien als TIFF-Dateien zu analysieren und öffnen Sie die TIFF-Dateien als Stapel mit spezieller Software wie beispielsweise eine Java-basierte Bildverarbeitungsprogramm (zB ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Hinweis: Je nach Erfassungssoftware verwendet, um die Bilder zu sammeln, können die Dateien in ihrer ursprünglichen Form erhalten und in ImageJ geöffnet werden. Dies ist bevorzugt, da die Metadaten mit den Dateien gehalten.
2. Trennen Sie den Stapelin die "Bilder" und wählen Sie den Zeitpunkten und Z-Ebenen wie gewünscht. Anmerkung: Obwohl ein Stapel von 20 Z-Ebenen genommen, viele der Neuroblasten <1 &mgr; m dick in der Zwischen späten Embryogenese und nur wenige Z-Ebenen benötigt werden.
3. Stapeln Sie die ausgewählten Z-Ebenen für jeden Zeitpunkt und machen separaten Z-Stapel-Projektionen. Dann stapeln sich die Vorsprünge für jeden Zeitpunkt zusammen, um eine zeitliche Abfolge zu machen.
4. Nehmen Sie die Einstellung der Helligkeit und / oder Kontrast für jeden Kanal.
5. Dann wählen Sie einen Bereich von Interesse, Ernte (und drehen, wenn nötig) in die Region.
6. Neues fusionierten Bildern mit der Funktion "zusammengeführt Kanäle" und wählen Sie eine andere Farbe für jeden Kanal. Konvertieren fusionierten Bilder in RGB.
7. Kehren Sie Graustufenbilder für jeden Kanal aus den Schritten 6.3 oder 6.4 (Nutzung "Invert"-Funktion unter "Bearbeiten"), um Bilder deutlicher zu visualisieren.
8. Speichern Sie alle fertigen Bilder als 8-Bit-TIFFs, um Zahlen in Vektor-basierte Softw machensind Programme oder als Quicktime-Dateien, um Filme zu machen.
9. Wenn Messungen der Pixelgröße benötigt werden (zB um eine Maßstabsleiste mit den Bildern auch), verwenden Sie ImageJ oder andere Bildbearbeitungssoftware, um die Größe des Embryos zu messen. Hinweis: Bilder gesammelt mit verschiedenen Ziele werden verschiedene Pixel-Größen haben.

Ergebnisse

Das Versuchsprotokoll beschreibt, wie Bild der Zellteilung in C. elegans Embryonen während der Embryogenese Mitte. Insbesondere beschreibt sie, wie man Bild Neuroblasten, die epidermalen Morphogenese erleichtern können. Epidermalen Morphogenese tritt aufgrund einer Kombination von epidermalen Zellformänderungen, Migration und Adhäsion, sondern stützt sich auf chemische oder mechanische Signale aus den zugrundeliegenden Neuroblasten (Abbildung 1B). Die Neuroblasten sezerFührungsSignale, die durc...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von verschiedenen Arten von Bildmikroskopie Zellteilungen in der Zwischenembryogenese. Insbesondere stellt dieses Protokoll, wie Bild die Aufteilung der Neuroblasten, epidermalen Zellen, die Morphogenese erleichtern können. Zell-Zell-Kommunikation wichtig für die Gewebebildung während metazoan Entwicklung und C. elegans ist ein ausgezeichnetes Modell zur Gewebebildung in vivo zu studieren. Ein Ereignis, das schön schildert das Zusammenspiel von epidermalen Gew...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	BioShop Kanada Inc.	#AGR001.1	Zur Herstellung von C. elegans NGM- und RNAi-Platten
Agar	Bio Basic Inc.	#9002-18-0	Zur Herstellung von LB-Agarplatten für Bakterien
Agarose	BioShop Canada Inc.	#AGA001.500
Anti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 488	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11029
Anti-Maus-Anti-GFP-Antikörper	Roche Applied Science	#11814460001
Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 Antikörper	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11011
Ampicillin	BioShop Canada Inc.	#AMP201.5	Pulver bei 4 Grad lagern; C und gelöstes Ampicillin bei -20 &°; C
Bactopeton  (Pepton-A)	Bio Basic Inc.
CaCl2 (Calciumchlorid)	BioShop Canada Inc.	#C302.1
Cholesterin	BioShop Deutschland Inc.	#CHL380.25	In Ethanol
DAPI lösen	Sigma-Aldrich	#D9542	Zur Färbung von Nukleinsäuren (DNA)
Glycerol	BioShop Canada Inc.	#GLY001.1
IPTG (Isopropylthio-β-Galactosid)	Bio Basic Inc.	#367-93-1	Pulver und gelöstes IPTG bei -20 Grad lagern; C
KH2PO4 (Kaliumphosphat, einbasisch)	BioShop Canada Inc.	#PPM666.1
K2HPO4 (Kaliumphosphat, zweibasisch)	BioShop Canada Inc.	#PPD303.1
L4440  (Fütterungsvektor)	Addgene	#1654	Als Glycerin-Vorrat bei -80 ° halten; C
MgSO4    (Magnesiumsulfat)	BioShop Canada Inc.	#MAG511.500
NaCl (Natriumchlorid)	Bio Basic Inc.	#7647-14-5
Na2HPO4 (Natriumphosphat, zweibasisch)	Bio Basic Inc.	#7558-79-4
Normales Eselserum (NDS)	Wisent Bioproducts	#035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoat (Propylgallat)	Alfa Aesar	#A10877
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	#P8920	Für optimale Ergebnisse beschichten Sie Objektträger dreimal
Streptomycin	BioShop Canada Inc.	#STP101.50	Pulver bei 4 Grad lagern; C und gelöstes Streptomycin bei -20 ° C
Tetracyclin	BioShop Canada Inc.	#TET701.10	Pulver bei 4 Grad lagern; C und gelöstes Tetracyclin bei -20 &°; C
Tween-20	Bio Basic Inc.	CAS#9005-64-5
Trypton	BioShop Canada Inc.	#TRP402.500
Hefeextrakt	Bio Basic Inc.	#8013-01-2