Methodenartikel

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

DOI:

10.3791/51189

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17. März 2014

 , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll Details eine Methode, um die Fähigkeit der gereinigten hämatopoetischen Vorläuferzellen zu plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) in Darm-Peyer-Plaques (PP) zu erzeugen, zu analysieren. Gemeinsame dendritischen Zellvorläuferzellen (CDPs, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) wurden aus dem Knochenmark der C57BL/6-Mäuse durch FACS gereinigt und Empfängermäuse, die einen wesentlichen pDC Bevölkerung PP fehlt übertragen, in diesem Fall, IFNAR - / - Mäuse wurden als die Transferempfänger verwendet. In einigen Mäusen wurde die Überexpression der dendritischen Zellwachstumsfaktor Flt3-Ligand (Flt3L) vor der Übertragung von CDPs Adoptivdurchgesetzt, mit hydrodynamischen Gentransfer (HGT) von Flt3L-kodierenden Plasmid. Flt3L Überexpression erweitert DC-Populationen aus übertragen (oder endogenen) hämatopoetischen Vorläuferzellen stammen. Bei 7-10 Tage nach der Vorläufer Transfer wurden pDCs, die von den adoptiv übertragen entstehen aus Vorläuferzellen auf die Empfängerzellen unterschiedenGrundlage der Marker CD45 Expression mit pDCs aus übertragen CDPs als CD45.1 + und CD45.2 + als Empfänger. Die Fähigkeit der CDPs übertragen, um die Bevölkerung in pDC PP zu fördern und an Flt3L reagieren wurde mittels Durchflusszytometrie von PP-Einzelzellsuspensionen aus Empfängermäusen ausgewertet. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zu testen, ob andere Vorläuferpopulationen der Lage ist, PP pDCs. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz verwendet, um die Rolle von Faktoren, die voraussichtlich pDC Entwicklung PP beeinflussen, indem Vorläuferuntermengen mit einem geeigneten Zuschlags, KO oder Überexpression des mutmaßlichen Entwicklungsfaktor und / oder durch Manipulation einer zirkulierenden Cytokine über HGT untersuchen . Dieses Verfahren kann auch die eine Analyse der, wie PP pDCs beeinflussen die Frequenz oder die Funktion anderer Immunteilmengen in PPs. Ein einzigartiges Merkmal dieser Methode ist die Verwendung von IFNAR - / - Mäusen, die stark dezimiert pDCs PP im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, so allowi zeigenng Rekonstitution von PP pDCs in Abwesenheit von Störfaktoren Effekte aus tödlichen Bestrahlung.

Einleitung

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Hier zeigen wir ein Protokoll zu prüfen, ob gemeinsame dendritischen Vorläuferzellen (CDP) sind in der Lage, aus der die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) Bevölkerung in Peyer-Plaques (PP). Das übergeordnete Ziel der Verwendung dieser Methode war es, die Entwicklungsregulation von pDCs in Peyer-Plaques (PP pDCs) zu bewerten. Der Grund, warum dies wichtig ist, dass PP pDCs unterscheiden sich von pDCs in anderen Geweben, wie Knochenmark, Blut und Milz gefunden, und daher ist es unklar, ob PP pDCs pDC und andere Populationen sind entwicklungspolitisch und / oder funktionell verwandten. Insbesondere werden häufig für pDCs wobei der Haupt Typ I Interferon (IFN) Pr....

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Protokoll

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Institutionelle Genehmigung ist im Voraus für alle hier beschriebenen experimentelle Manipulationen an Mäusen gewonnen werden. Diese umfassen die Verwendung von C57BL/6-Mäuse zur Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen, IFNAR - / - Mäusen als Empfänger für die adoptive Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und der Verwendung von CGT für Zytokin-Überexpression in vivo. Entsprechende Gehäuse und Pflege der Tiere muss auch von dem Prüfer oder Institution gestellt werden. Darüber hinaus können institutionelle Zulassung für die in hydrodynamischen Gentransfer (dh rekombinante DNA-Zulassung) verwendeten Plasmide erforderl....

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Ergebnisse

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Unsere Ergebnisse zeigen die Gating-Strategie zur Isolierung von CDPs aus Mausknochenmarkszellen (Abbildung 1), in den Protokollen 2 und 3 beschrieben. CDPs enthalten etwa 0,1% des gesamten Knochenmarkzellen und etwa 4-6 x 10 4 CDPs kann von einer Maus isoliert werden. Bei Adoptivtransfer, unterscheiden CDPs in pDCs und cDCs 10.

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Diskussion

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Die beschriebene Adoptivtransfertechnik hier beurteilt den Beitrag der CDP auf die PP pDC Bevölkerung in Empfängermäuse, die einen Mangel an PP pDCs sind (zB IFNAR - / - Mäuse). In zukünftigen Experimenten wird es wichtig sein, das Potenzial der anderen Vorläuferuntermengen bei der Erzeugung von PP pDCs bewerten, insbesondere darüber, ob PP pDCs von Flt3 + CLP abzuleiten. Diese Frage ist von Bedeutung, da es unklar bleibt, warum PP pDCs sind eindeutig empfindlich auf IFNAR-STAT1 Signale fü.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

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Wir danken Drs.. Alex Gelbard und Willem Overwijk für Beratung in hydrodynamischen Gentransfer. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH (AI098099, SSW), dem MD Anderson Cancer Center for Epigenetik, dem MD Anderson Center for Entzündung und Krebs (SSW) und der RE Bob Smith Education Fund (HSL) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6JJAX664
B6. SJLJAX2014
RPMIInvitrogen11875-093
15 ml Konische RöhrchenBD Biosciences352095
50 ml Konische RöhrchenBD Biosciences352070
Sterile chirurgische Pinzette
Sterile kleine Schere
Sterile große Schere
40 μ m cell SiebBD Biosciences352340
35 μ m cell Siebkappe RöhrchenBD Biosciences352235
RBC Lysing PufferSigmaR7757
FACS PufferPBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, Filter sterilisiert
PercollGE Healthcare17089102
10x HBSSSigmaH4641
Kollagenase IVWorthingtonLS004188
Ziegen-Anti-Ratten-IgG-MikrokügelchenMilteyni Biotec130-048-501
LD-SäuleMilteyni Biotec130-042-901
Ratte Anti-D3BD Biosciences555273
Ratte Anti-CD19BD Biosciences553783
Ratte Anti-CD11bBD Biosciences553308
Ratte Anti-CD11cBD Biosciences
Ratte Anti-Ter119BD Biosciences553671
Anti-CD3 (PerCP)eBiosciences45-0031
Anti-CD19 (PerCP)eBiosciences45-0193
Anti-CD11b (PerCP)eBiosciences45-0112
Anti-CD11c (PerCP)eBiosciences45-0114
Anti-F4/80 ( PerCP)eBiosciences45-4801
Anti-Ter119 (PerCP)eBiosciences45-5921
Anti-Sca-1 (PE. Cy7)eBiosciences25-5981
Anti-CD115 (APC)eBiosciences17-1152
Anti-C-Kit (APC. Cy7) eBiosciences47-1171
Anti-IL-7R (Pacific Blue)eBiosciences48-1271
Anti-FLT3 (PE)eBiosciences12-1351
Anti-CD45.1 (APC. Cy7)BD Biosciences560579
Anti-CD45.2 (PE. Cy7)Biolegend109830
Anti-CD11c (Pacific Blue)eBiosciences48-0114
Anti-B220 (APC)eBiosciences25-0452
Anti-Siglec-H (PE)eBiosciences12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)eBiosciencesNov-72
ZellsortiererBD Biosciencesz.B. BD Fortessa
Wärmelampe
Maus Rückhalteapparat
1 ml SpritzenBecton Dickinson309602
frac12; G-Nadeln (steril)Becton Dickinson305109
553799 27&

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
  2. Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-prod....

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Schlagwörter

Durchflusszytometriehydrodynamischer GentransferFlt3 LigandIfnar Knockout M usegemeinsame dendritische Vorl uferzellenCD45 Markerexpression

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