Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Zusammenfassung

Zeitraffer-Bildgebung ist eine Technik, die für die direkte Beobachtung des Prozesses der Morphogenese ermöglicht, oder die Erzeugung der Form. Durch ihre optische Klarheit und Zugänglichkeit für genetische Manipulation hat der Zebrafisch-Embryos zu einem beliebten Modellorganismus, mit der Zeitraffer-Analyse der Morphogenese in lebenden Embryonen durchzuführen. Konfokale Bildgebung eines lebenden Zebrafischembryo erfordert, dass ein Gewebe von Interesse ist, die dauerhaft mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist, wie einem Transgen oder Farbstoff injiziert. Der Prozess verlangt, dass der Embryo wird betäubt und an Ort und Stelle in einer Weise, dass eine gesunde Entwicklung normal verläuft statt. Parameter für die Bildgebung muss auf für dreidimensionale Wachstum Rechnung zu tragen und die Anforderungen der einzelnen Zellen zu lösen, während sich schnelle Schnappschüsse der Entwicklung auszugleichen. Unsere Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, langfristige In-vivo-Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zebrafisch-Embryonen durchzuführen und abwechslungsreiches Gewebe Verhaltensweisen erkennendie Schädel Neuralleiste, die kraniofaziale Anomalien verursachen. Entwicklungsverzögerungen, die durch Anästhesie und Montage verursacht werden, sind minimal, und Embryonen sind unversehrt durch den Prozess. Time-lapse abgebildet Embryonen zu flüssigen Medium bei später Punkte in der Entwicklung zurückgebracht werden und anschließend abgebildet oder fixiert. Mit einer zunehmenden Fülle von transgenen Zebrafischlinien und gut charakterisierten Schicksal Mapping-und Transplantationstechniken, Imaging ist eine beliebige Gewebe möglich. Als solche Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung kombiniert kraftvoll mit Zebrafisch-genetischer Methoden, einschließlich der Analyse von Mutanten und mikroinjizierten Embryonen.

Einleitung

Kraniofazialen Morphogenese ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die koordinierte Wechselwirkungen zwischen mehreren Zelltypen erfordert. Die Mehrheit der kraniofazialen Skelett aus Neuralleistenzellen stammen, müssen von denen viele aus dem dorsalen Neuralrohr in transienten Strukturen genannt Pharyngealbögen ¹ migrieren. Wie bei vielen Geweben ist Morphogenese des kraniofazialen Skeletts komplizierter, als durch statische Bilder von Embryonen in bestimmten Entwicklungszeitpunkten zu verstehen. Obwohl es zeitaufwendig durchzuführen, stellt in vivo Zeitraffermikroskopie einen kontinuierlichen Blick auf Zellen und Gewebe eines sich entwickelnd....

Protokoll

1. Tierhaltung und Mutant Allele

1. Heben und Zebrafisch zu züchten, wie beschrieben ^21.
2. Zebrafisch-Mutante Allele in dieser Studie verwendet wurden, waren ¹⁶ PDGFRA ^{B1059, B1100} Smad5 ²² und ²³ smo ^B577. Quellen für diese Zebrafisch-Stämme schließen ZIRC.

2. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge

Hinweis: Alle Lösungen und Geräte können im Voraus und für eine spätere Verwendung gespeichert werden.

1. Machen Embryo Medien (EM), wie zuvor beschrieben ^21.
2. Machen Sie 4 g / L MS-222 (Tricaine). Lö....

Ergebnisse

In Wildtyp-Embryonen nach Neuralleiste Bevölkerung, länglichen die Schlundbögen entlang der anterior / posterior und dorsal / ventral Achsen während der Bewegung in einer Richtung rostral (Film 1). Bei 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ist die vordere / hintere Länge des ersten Schlundbogen zwischen 1,8 bis 1,9-fache seiner dorsalen / ventralen Höhe. Rücken / Bauchdehnung schreitet stetig schneller als vorderen / hinteren Verlängerung bis 36,5 hpf. Von hier aus dorsal / ventrale Höhenplateaus rund 1.......

Diskussion

Zeitraffer-konfokale Mikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug für die Analyse der Entwicklung. Hier zeigen wir, Nützlichkeit der Methode bei der Untersuchung Pharyngealbogen Morphogenese in Zebrafisch-Mutante, die für wichtige Signalwege, die mit einem transgenen Neuralleistenzellen Etiketten sind. Neben Gewebe-Ebene analysiert, Zeitraffer Analysen sind auch auf zellulärer Ebene zu einem ^28-Analysen. Viele verbreitete Zebrafisch Verfahren können auch in Zeitraffer-Mikroskopie Experimente, einschließlich Mikroin.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6 lb Test monofile Schnur	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argonlaser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C8106
Kapillarschlauch, 100 mm, 0,9 mm ID	FHC	30-31-0
Nelkenöl	Hilltech Kanada, Inc.	HB-102
Hochvakuumfett	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp Trockenbad-Inkubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser-Scanning-Mikroskop	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesiumsulfat-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	230391
Mikroskop-Deckglas, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Mikroskop-Deckglas, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	M-11321
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	P3786
Natriumchlorid	Fisher Scientific	M-11624
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.