Methodenartikel

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

DOI:

10.3791/51196

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18. Januar 2014

 ,  ,  , 
1Department of General Microbiology, Georg-August University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Zusammenfassung

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Viele Mikroorganismen wie Bakterien vermehren sich extrem schnell und die Populationen können hohe Zelldichten erreichen. Kleine Zellfraktionen in einer Population haben immer angesammelte Mutationen, die entweder schädlich oder vorteilhaft für die Zelle sind. Wenn der Fitnesseffekt einer Mutation der Subpopulation einen starken selektiven Wachstumsvorteil verschafft, können die Individuen dieser Subpopulation schnell überwettbewerben und sogar ihre unmittelbaren Mitmenschen vollständig eliminieren. So können kleine genetische Veränderungen und selektionsgesteuerte Anhäufung von Zellen, die vorteilhafte Mutationen erworben haben, zu einer vollständigen Verschiebung des Genotyps einer Zellpopulation führen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Überwachung der schnellen klonalen Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit durch Kokultivierung von fluoreszierend markierten Individuen des Gram-positiven Modellbakteriums Bacillus subtilisvor. Die Methode ist einfach durchzuführen und sehr anschaulich, um intraartenWettbewerb unter den Individuen in einer bakteriellen Zellpopulation zu zeigen.

Einleitung

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Bodenbakterien sind in der Regel mit flexiblen regulatorischen Netzwerken und breiten stoffwechselnden Kapazitäten ausgestattet. Beide Eigenschaften ermöglichen es den Zellen, ihre katabolen und anabolen Bahnen anzupassen, um mit ihren Gefährten und anderen Mikroorganismen um die Nährstoffe zu konkurrieren, die in einer bestimmten ökologischen Nische verfügbar sind1. Wenn die Bakterien jedoch nicht in der Lage sind, sich an ihre Umgebung anzupassen, können andere Mechanismen für das Überleben einer Art verantwortlich sein. In der Tat, da viele Bakterien schnell vermehren und die Populationen hohe Zelldichten Subpopulationen erreichen können spontan angesamm....

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Protokoll

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1. Herstellung von Agar-Platten, Kulturmedien, Kryostocks und Vorkulturen

  1. Bereiten Sie Wachstumsmedien und erforderliche Reagenzien vor (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien).
  2. Streifen Sie die B. subtilis Stämme (z.B. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) und BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) aus, die ein bzw. zwei aktive GDHs ausdrücken)2, die im Wettbewerbsexperiment auf SP-Medium-Agarplatten verwendet werden, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.

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Ergebnisse

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Die hier beschriebene Methode wurde erfolgreich angewandt, um den Wettbewerb innerhalb von Arten in einer Zellpopulation zu visualisieren, die aus B. subtilis-Stämmen besteht, die mit den cfp- und yfp-Genen gekennzeichnet wurden, die die Fluorophore CFP bzw. YFP kodieren. Wie in Abbildung 3dargestellt, kann die Methode verwendet werden, um den Wettbewerb innerhalb der Spezies sehr anschaulich zu visualisieren. Durch das Aufspüren der Proben auf kleinen Flächen wurde die klonale.......

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Diskussion

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Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Wettbewerbstauglichkeit von Bakterien zu analysieren16. In vielen Fällen wurden die Bakterien mit verschiedenen Antibiotika-Resistenzkassetten17gekennzeichnet. Ähnlich unserem Ansatz ermöglicht die Kennzeichnung der Zellen mit Antibiotikaresistenzkassetten die Beurteilung der Wettbewerbstauglichkeit der Bakterien während der Kokultivierung unter definierten Wachstumsbedingungen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Wettbewerbstauglichk.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Die Arbeit im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), dem Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) und dem Göttinger Zentrum für Molekularbiologie (GZMB). Die Autoren würdigen Jörg Stülke für hilfreiche Kommentare und die kritische Lektüre des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(NH4)2SO4 Roth, Deutschland3746
AgarDifco, USA214010
Ammonium-Eisencitrat (CAF)Sigma-Aldrich, Deutschland9714
CaCl2  Roth, Deutschland5239
GlucoseApplichem, DeutschlandA3617
GlycerolRoth, Deutschland4043
K2HPO4• 3H2ORoth, Deutschland6878
KClApplichem, DeutschlandA3582
KH2PO4Roth, Deutschland3904
KOHRoth, Deutschland6751
MgSO4• 7H2O Roth, DeutschlandP027
MnCl2 Roth, DeutschlandT881
MnSO4• 4H2OMerck Millipore, Deutschland102786
NaClRoth, Deutschland9265
NährstoffbrüheRoth, DeutschlandX929
KaliumglutamatApplichem, DeutschlandA3712
TryptonRoth, Deutschland8952
TryptophanApplichem, DeutschlandA3445
HefeextraktRoth, Deutschland2363
1,5 ml ReaktionsgefäßeSarstedt, Deutschland72.690.001
2,0 ml ReaktionsgefäßeSarstedt, Deutschland72.691
15 ml Kunststoffgefäße mit SchraubverschlussSarstedt, Deutschland62.554.001
PetrischalenSarstedt, Deutschland82.1473
1,5 ml Küvetten aus PolystyrolSarstedt, Deutschland67.742
15 ml Kulturgefäße aus Glas Marke, Deutschland7790 22
100 ml Schüttelkolben mit AluminiumkappenMarke, Deutschland928 24
Sterile 10 ml GlaspipettenMarke, Deutschland278 23
Inkubator (28 und 37 > C)New BrunswickM1282-0012
Standard-Pipettenset (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1.000 μ l)Eppendorf, Deutschland4910 000.034, 4910 000.042,
Tischzentrifuge für 1,5 und 2 ml ReaktionsgefäßeThermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Deutschland75002425
Tischzentrifuge für 15 ml KunststoffröhrchenHeraeus Biofuge Primo R, Deutschland75005440
Standard-SpektralphotometerAmersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Deutschland80-2112-21
Stereofluoreszenzmikroskop Zeiss SteREO Lumar V12, Deutschland495008-0009-000
Gefrierschrank (-20 und -80 ° C)--
Kühlschrank (4 Grad; C)--
AutoklavZirbus, LTA 2x3x4,Deutschland-pH-Messgerät
pH-Meter 766, Calimatic, Knick, Deutschland766
VortexVortex 3, IKA, Deutschland3340000
BalanceCP2202S, Sartorius, Deutschlandersetzt durch
Schwarzer Stift (Permanentmarker)Staedler, Deutschland317-9
Powerpoint-ProgrammMicrosoft, USA-OfficeExcel-Programm
Microsoft, USA-Programmzur Datenverarbeitung
Adobe Photoshop CS5Adobe, USAersetzt durch CS6, DownloadComputerprogramm zur Bildbearbeitung
Computer-PCoderMac-ZEN
pro 2011 Software für das StereofluoreszenzmikroskopZeiss, Deutschland410135 1002 110AxioCam MRc Rev. Gewonnen durch Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nährstoffbrühe
0,25 mg MgSO4• 7H2O
1 g KCl
15 g Agar für festes SP-Mediumbei Bedarf
1 L mit H2OAutoklav für 20 min bei 121 & Grad; C
1 ml CaCl2 (0,5 M), sterilisiert durch Filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilisiert durch Filtration
2 ml Ammonium-Eisencitrat (CAF, 2,2 mg/ml), sterilisiert durch Filtration
LB Medium
10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
15 g Agar für festes LB>Mediumbei Bedarf
1 L mit H2für 20 min bei 121 μg zugeben; C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C-Salze
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilisiert durch Filtration
10 ml Ammonium-Eisencitrat (CAF, 2,2 mg/ml), sterilisiert durch Filtration
10 ml III'-Salze
25 ml Glukose (20%)20 min bei 121 °C autoklaviert;
C 1 L mit sterilem H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C Salze
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilisiert durch Filtration
10 ml Ammonium(IIItricitrat) (CAF, 2,2 mg/ml), sterilisiert durch Filtration
10 ml III’ Salze
20 ml Glutamat (40%)
25 ml Glukose (20%), autoklaviert für 20 min bei 121 &de; C
1 L mit sterilen H2O
5 x C Salzen zugeben 
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
add 1 L mit sterilem H2OAutoklav für 20 min bei 121 &/deg; C
III'-Salze
0,232 g MnSO4• 4H2O
12,3 g MgSO4• 7H2O
1 L mit sterilem H2O zugeben, 20 min bei 121 μm autoklavieren; C
40% Glutamatlösung
200 g L-Glutaminsäure
stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein, indem Sie ca. 80 g KOH
hinzufügen, fügen Sie 0,5 l mit sterilem H2OAutoklaven für 20 min bei 121 & Grad hinzu; C
0,9%ige Kochsalzlösung (NaCl)-Lösung
Zugabe 1 L mit sterilem H2O-Autoklavenfür 20 min bei 121 α; C
50% Glycerinlösung
295 ml Glycerin (87%)
0,5 l mit sterilem H2OAutoklaven für 20 min bei 121 & Grad; C
Bakterien (Alle Stämme basieren auf dem Bacillus subtilis Stamm 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp) von Laborstämmen
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp) 
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)
, , , , , , Sammlung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
  2. Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M.

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Schlagwörter

berwachung der intraspezifischen KonkurrenzKokultivationsmethodeStereofluoreszenzmikroskopieKoloniez hlanalyseBacillus subtilis St mmeFluoreszenzfiltersetsMessung der optischen DichteAgarkultivierung

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