Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Professionelle Phagozyten, einschließlich Makrophagen, spielen im Immunsystem eine kritische. Zusätzlich dazu, dass die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems, sie spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des adaptiven Immunität durch ihre Signal-und Antigen-präsentierenden Rolle ^03.01. Während die Funktion von professionellen Phagozyten ist vielfältig ist Phagosomenreifung die kritische Rückgrat der bakteriziden und Antigen-Verarbeitungsfunktion der professionellen Phagozyten ^4,5. Bei der Rezeptor-vermittelten Phagozytose und die Aufnahme einer Phagozyten Ziel, wie Bakterien, geht die entstehenden Phagosom über ein komplexes und gut organisierten Ablauf der Interaktion und Austausch mit Fächern des endozytischen Netzwerk und mehreren anderen Zellorganellen ^6. Die Art der Verbindungen ausgetauscht mit dieser zellulären Unternehmen als auch die Regulierung und der Zeitpunkt der Fusionsereignisse bestimmt die Lumen phagosomalen Milieu und die phagosomal Membranzusammensetzung und damit ^7, das Schicksal der Reifung phagosome ^8.

Die physiologische Relevanz der Phagosomenreifung wird durch die durch verschiedene intrazelluläre Erreger eingesetzt zu entkommen, zu verhaften oder zu untergraben Phagosomenreifung ⁹ verschiedenen Strategien veranschaulicht. Die meisten dieser Strategien, die direkt oder indirekt verhindern, dass die letzte und entscheidende Phase der Phagosomenreifung Prozess: die Verschmelzung von Phagosom mit spät endosomale / lysosomale Kompartimente, die sie mit dem Großteil der hydrolytischen Enzymen und antibakteriellen Faktoren einer reifen phagosome ⁷ verleiht ^{, 8,10.} Die Analyse dieser letzte und entscheidende Schritt daher können Sie uns starke Indikatoren über den Zustand der Reifung der Phagosomen bieten und wenn sein wird das natürliche physiologische Zustand positiv oder negativ unter den jeweiligen experimentellen Einstellungen, die genutzt sind betroffen.

Die späte endosomale / lysosomale Kompartiments werden im Allgemeinen betrachtet, um die Klemmenräume der endocytischen, definieren und von den frühen endozytotischen Kompartimente durch die Anwesenheit von verschiedenen, spezifischen Stadium, Markermoleküle sein. Zum Beispiel hydrolytische Enzyme oder Membrankomponenten wie lysosomale Membranproteinen assoziiert (Lampen) unter anderem ^11. Das Terminal endozytischen-Fächer fortan einfach als Lysosomen-auch als Hauptstandort für die letzten Stadien der Verdauung am Ende der phagozytären / endocytischen ¹² dienen bezeichnet. Auf diese Weise können unverdauliche Sonden durch Endozytose und Makropinozytose aus dem extrazellulären Milieu geladen und durch den endocytischen zu den Lysosomen, wo es sich ansammelt ^13,14 nach nach einem bestimmten Zyklus der Aufnahme und Chase transportiert werden. Fluorophor-konjugierten Sonden zur Fluoreszenzmikroskopie wie organischen unverdaulichen Polymer Dextran werden üblicherweise als endocyticprobes ^15-17.

14,18.

Nach der Beschreibung unserer Methode können analoge Versuche mit geänderten Einstellungen und Faktoren, deren Einfluss auf Phagosomenreifung untersuchen gestaltet werden; praktisch jede otihr Typ von adhärenten primären oder Zelllinie Fresszellen, genetische Funktionsverlust Experimente mit Gen-Knock-out und Knock-down, Mutanten oder Expression von Fusionsproteinen, phagocytic-Ziele, Mikrokügelchen Beschichtungsmassen, endosomalen / lysosomalen Sonden und Faktoren wie eine Zytokine, chemische Inhibitoren oder siRNA unter anderem alle Variablen, die auf den grundlegenden Ansatz dieser Methode angewendet werden kann.

Wir definieren das Ziel und die grundlegenden Anforderungen dieser Methode wie folgt:

• Ziel der Methode: direkte, quantitative und qualitative Beobachtung und Analyse der Phagosomenreifung mit hoher zeitlicher Auflösung in lebenden Fresszellen zu aktivieren.
• Phagozytische Ladung: Ein entsprechend beschichteten Mikropartikel oder biologische Ziel. Hier verwenden wir IgG-beschichteten 3 um sphärische Polystyrol-Mikropartikel, die leicht über den Fc-γ-Rezeptor-vermittelten Phagozytose internalisiert werden. Alternativ jeder Mikroorganismus oder beschichtet microparticle für die eine phagozytische Rezeptor vorhanden ist an den Zellen verwendet werden.
• Phagozyten: Adherent phagozytierenden Zellen, die die entsprechenden Rezeptoren phagocytic. Hier verwenden wir primären Maus BMM, die reichlich die Fc-γ-Rezeptoren exprimieren. Alternativ können dendritische Zellen (DC), Monozyten oder phagozytischen Epithelzellen oder ihre genetische Mutanten oder Knock-out-Varianten verwendet werden.
• Lysosomal Ladung: Ein fluoreszenzmarkierte Sonde lysosomalen. Hier wird Texas Red-konjugiert 70.000 Kilodalton Dextran (Dex70kD) als Lumen Ladung von den Lysosomen verwendet. Alternativ kann jede Fluoreszenz nachweisbare Marker ein zelluläres Kompartiment oder Organelle oder einer geeigneten Sonde für phagosomalen Eigenschaften wie Säure-oder Abbauleistung, verwendet werden, um das Fortschreiten der Phagosomenreifung untersuchen.
• Einflussfaktoren: Zum Beispiel, Signalmoleküle, chemische Verbindungen, Gen-knock-down oder transiente Expression des mutierten Proteine ​​konnte. Hier haben wir Förgein die Nutzung eines solchen Faktor für die der Einfachheit halber, aber für ein aktuelles Beispiel mit mutierten Proteinexpression und knock-down Einflussfaktoren finden Sie in ¹⁸ Kasmapour et al. Jeder Faktor, der Phagozytose oder die Umstände und die Mobilität von Phagosomen beeinflussen können und / oder die Fächer, die mit reif Phagosomen interagieren könnten verwendet werden.

Tierbetreuung und alle Verfahren in diesem Protokoll folgen die institutionellen und nationalen Richtlinien.

Bereiten Sie die Vorbereitungen, die von "Π-" vorab angedeutet sind.

1. Vorbereitung der BMM

1. Führen Sie die Keulung der Mäuse durch Genickbruch.
2. Entfernen Femur und Tibia Knochen, Knochen frei von Gewebe und schneiden Sie beide Enden für die Zugänglichkeit des Knochenmarks.
3. Halten Knochen in eiskaltem PBS oder eiskaltem DMEM-Medium (mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, auf Eis ergänzt, bis der nächste Schritt.
   Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte zu einer Klasse II Biosicherheitswerkbank, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren.
4. Spülen Sie die Markhöhle mit kaltem PBS + Penicillin / Streptomycin unter Verwendung einer 26 g (0,45 mm) Nadel in eine 1 ml Spritze angebracht.
5. Pellet-Zellen durch vorsichtiges Zentrifugieren bei 350 × g für 10 min, das Pellet in BMM med.ium und Platte in sterilen Mikrobiologie unbeschichteten Petrischalen.
   1. Vorbereitung des BMM Medium
      • Dulbecco modifiziertem Eagles Medium DMEM
      • 10% inaktiviertes FCS
      • 20% Maus-Fibroblasten-Zelllinie L929 Kulturüberstand (Quelle Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor, M-CSF)
      • 5% Pferdeserum
      • 2 mM Glutamin
   2. Herstellung der Zelllinie L929 Kulturmedium;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium
      • 10% inaktiviertes FCS
      • 2 mM Glutamin
   3. Herstellung von Maus-Fibroblasten-Zelllinie L929 Kulturüberstand;
      • L929-Zellen konfluent wurden 1:4 aufgeteilt, in 175 cm ^2-Kolben kultiviert für 2 Tage unter Verwendung von 20 ml Medium L929 und der Kulturüberstand nach 48 h gesammelt, filtriert und zu der BMM-Medium
6. Die Zellen gespült inkubierender Oberschenkelknochen in einem Inkubator bei 37 ° C in 5% CO _{2-Atmosphäre.}
7. Nach jedem 48 Stunden (maximal 72 Stunden) Inkubation absaugen und ersetzen das Medium durch frisches Medium BMM, für bis zu 10 Tage. Mehr als 95% der Zellen waren positiv für CD14, wie durch Durchflusszytometrie getestet. CD14 ist ein Mustererkennungs Rezeptor hauptsächlich durch Makrophagen exprimiert. Durch Bestimmen des Prozentsatzes der Zellen, die positiv für diesen Rezeptor wurde eine Reinkultur von anhaftenden BMM erzeugt.

Hinweis: Vorbereitung und Kultur die Zellen entsprechend, wenn andere Zelltypen verwendet werden.

2. Beschichtung von Mikroperlen als Phagozytische Fracht

1. Für die Herstellung von 1 ml Partikelsuspension, verwenden Sie 400 ul von 2,5% 3 um carboxylierten Polystyrol-Mikropartikel, oder alternative Mikropartikeln.
2. Übertragen Sie die Partikelsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, waschen 3x mit PBS und 100 ul von 500 mM 2 - (N-Morpholino) Ethanendisulfonsäure Natriumsalz, MES-Puffer bei pH 6,7 mit dem Wulst Pellets.
3. Lösen Sie 50 ug Maus-IgG (IgG polyklonalen Antikörper) in 50 ul sterilem _ddH2O und zu der Bead-Suspension.
4. Füllen Sie die Suspension bis zu 1 ml mit sterilem _ddH2O (450 ul).
5. Inkubieren der Lösung für 15 min auf einem rotierenden Rad bei RT.
6. Vorbereitung EDAC Vernetzer, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid in einer Konzentration von 10 mg / ml und füge 14 ul auf die Partikelsuspension.
   Hinweis: EDAC Vernetzungen Aminogruppen des IgG mit den Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Kügelchen und erleichtert die Fixierung des IgG auf der Perlenoberfläche. Dies ist entscheidend für die Bead-Uptake und daher sollte die Lösung frisch hergestellt werden.
7. Inkubieren der Suspension auf einem rotierenden Rad für 1 h bei RT.
8. Hinzufügen von 14 ul EDAC Vernetzer und Inkubation der Suspension auf einem rotierenden Rad für 1 h bei RT.
9. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 10.000 g für 2 min in einer Mikrozentrifuge.
10. Waschen der Kügelchen 3x in Stop-Puffer (1% Triton X-100 in 10 mM Tris, pH 9,4), um die Vernetzungsreaktion zu stoppen, durch Resuspendieren des Pellets in Anschlagpuffer und Spinnen der Lösung bei 10.000 g für 2 min.
11. Waschen Sie Perlen 3x in PBS und das Pellet in 1 ml PBS.
    Optional: Bereiten Sie arbeitet Teilmengen von 30-50 ul.
12. Speichern die IgG-beschichteten Perlen-Suspension bei 4 º C nicht länger als 4 Wochen und niemals zulassen, die Suspension eingefroren werden.

Hinweis: Ein Konservierungsmittel, wie Natriumazid in einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) kann der Suspension zugesetzt werden, um bakterielles Wachstum und eine Kontamination zu verhindern. In diesem Fall Waschen der Kügelchen vor ihrer Verwendung durchgeführt werden muss, um zytotoxische Wirkung des Konservierungsmittels zu vermeiden. Zentrifugieren Sie einen aliquoten Teil der Suspension bei 10.000 g für 2 Minuten und waschen Sie die Perlen durch WiederSuspendieren des Pellets in PBS. Wiederholen 3x Waschen.

3. Vorbereitung der Probe Dextran-Stammlösung

1. Lösen Sie den Texas Red Dextran 70.000 Kilodalton (Dex70kD) in PBS bei 20 mg / ml und bei -20 ° C, entsprechend der Anleitung des Herstellers.
   Hinweis: Halten Sie Aktien bei -20 ° C bis zu mehreren Monaten, oder bei 4 ° C für einige Wochen finden Sie in der Herstellerdokumentation.
2. Vorbereitung der Dextran-Lösung für das Experiment aus dem Vorrat von in komplettem DMEM Zellkulturmedium verdünnt (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-Glutamin) auf etwa 1 mg / ml (mehrfach konzentrierten Lösung, die das verdünnte werden endgültige Arbeitskonzentration von 20 ug / ml vor der Zugabe zu den Zellen).
3. Verwenden Sie einen Ultraschall Wasserbad, um die Dextran Aliquot für 5 min beschallen, um die Lösung zu homogenisieren und lösen Aggregate, die später während der Bilderzeugung Artefakt führen könnte.
4. Zentrifuge bei maximaler gfür 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge, um alle ungelösten Klumpen oder Verunreinigungen aus der Lösung zu entfernen.
5. Den Überstand vorsichtig zu bewegen, um ein frisches Röhrchen unter Vermeidung der Pellet am Boden des Röhrchens und verdünnt die Lösung auf die endgültige Arbeitskonzentration von 20 ug / ml in vollständigem DMEM-Zellkulturmedium.
6. Filter-sterile die Lösung unter Verwendung eines 0,2 um-Spritzenfilter montiert.

4. Dextran Vorspannung

1. Seed-Zellen in einer Live-Cell-Imaging Glasbodenschale und Inkubation für mindestens 12 Stunden (bei ​​37 ° C in 5% CO _{2-Atmosphäre),} um die Befestigung und Akklimatisierung zu gewährleisten.
   Hinweis: Es gibt segmentierten Glasboden Gerichten zur Verfügung, die die Durchführung mehrerer Experimente (bis zu vier Fächer) pro Gericht zu ermöglichen.
2. Bereiten Sie das Dextran in DMEM-Lösung in Protokoll 3 beschrieben. Wärmen Sie das vorbereitet Dextran in DMEM-Lösung, mit einem Wasserbad bei 37 ° C
3. Saugen Sie ein Mediumnd hinzuzufügen Dextran-Lösung zu den Zellen vorsichtig und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO _{2-Atmosphäre} für 2-8 h für die Aufnahme.
   Hinweis: Plan und das Protokoll auf der Basis der Sonde und Zelltyp, der verwendet wird und genau auf diese Laufzeit zu halten, wenn sich wiederholenden Versuche zu optimieren. Dies ist für das Profil des Dextran-Akkumulation im Endozytosewegs und damit die Reproduzierbarkeit der Experimente notwendig.
4. 3x Waschen der Zellen mit vorgewärmtem DMEM Komplettmedium, Medium absaugen und spülen Sie sorgfältig Zellen mit frischem Medium.
5. Inkubieren Zellen mit vollständigem DMEM-Medium für 4-12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO _{2-Atmosphäre.}
6. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten komplette gefiltert Phenolrot-freiem DMEM Medium.
7. Für eine optimale Bildergebnisse, Änderung vorgewärmtem komplette gefilterte Phenolrot-freiem DMEM Medium mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung. Phenolrot kann Abschrecken von Fluoreszenzsignalen führen, wodurch Hintergrundgeräusche undreduzieren somit den Bildkontrast und Klarheit.

Hinweis: das Mikroskop und die Abbildungseinstellungen im Voraus nach den vorgeplanten und optimierte Protokoll auf Basis des Sondentyp und Zellen, die verwendet werden erwartet.

5. Hinzufügen von IgG-beschichteten Beads

1. Ins Gleichgewicht einen aliquoten Teil vorgefertigte 1% Bead-Suspension auf RT und beschallen in einem Ultraschall-Wasserbad für 2-3 min.
2. In 1-6 ul der 1%-Bead-Suspension zur vollständigen gefiltert Phenolrot-freiem DMEM-Medium unter einer Klasse II Biosicherheitswerkbank, um das Risiko der Kontamination (ein guter Ausgangskonzentration 1 ul / ² cm 2 Geschirroberfläche) zu minimieren.
   Hinweis: Hier BMM wurden bei 25.000 Zellen / Well ausgesät und ein 6 ul 1% stock Bead-Suspension wurde in die Schüssel zu dem Medium gegeben. Dies entspricht in etwa einer Perle / Zellverhältnis von 15:1. Das Verhältnis zu der Art der Zellen, die verwendet wird, und an dem Wulst Materials eingestellt werden; i.E. Latexkügelchen haben eine geringe Dichte und nicht auf den Boden schnell sinken, während Polystyrolkugeln versenken und kommen in Kontakt mit den anhaftenden Zellen viel schneller und somit in größeren Zahlen.
   Hinweis: Je nach Experiment kann es von Vorteil sein, den Bereich, der vorher beobachtet wird, auszuwählen. Partikelsuspension kann dann nur auf dieses spezielle Gebiet der Glasbodenschale gegeben werden und erhöht somit die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung günstige Aufnahme Ereignisse.
3. Die dichte Wolke aus Perlen können durch sanftes Pipettieren der Suspension im Glasbodenschale diffundieren.
4. Warten Sie, bis Perlen sinken auf den Boden der Glasbodenschale und sind ungefähr in der gleichen Ebene mit den anhaftenden Fresszellen.
5. Konzentrieren Sie sich auf die Region of Interest (ROI) und starten Sie die Zeitraffer-Bildgebung.

Hinweis: Es kann notwendig sein, die Feinabstimmung der Fokus während Bildgebung im Gange ist, in Abhängigkeit von der Abbildungssystem, das verwendet wird, seine stakeit und die Beweglichkeit der Zellen beobachtet. Beachten Sie jedoch, dass dies unmöglich machen, die richtige Analyse der Phagosomen, die stark von der Fokusebene abweichen infolge der Neuausrichtung.

6. Imaging

Befolgen Sie die allgemeinen Richtlinien unten für eine optimale Bildqualität;

1. Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems, wie eines Laser-Scanning-oder Rotationsscheibensystem.
   Hinweis: Eine Leica TCS SP5 AOBS Laser-Scanning-Konfokalmikroskop von Leica LAS AF Software gesteuert und mit einem Umweltsteuerkammer ausgestattet war für Zeitraffer-Video-Imaging verwendet.
2. Optimieren Sie die Bildeinstellungen wie Scangeschwindigkeit, Vergrößerung, Auflösung, usw. in einer Weise, um eine Rate von einem Rahmen in jedem 7-20 sec, je nach System verwendet werden, erlauben.
   Hinweis: Hier wird ein 200 Hz Scangeschwindigkeit, 2x Zoom-Scanner und eine Linie Mittelung von 2-3x bei einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln resuin einer Aufnahmezeit zwischen 3-5 sec / rame LTED. Eine Rate von einem Rahmen in jeder 10 Sekunden wurde verwendet, um Zeitraffer-Filme mit einer Laufzeit von mindestens 120 Minuten aufzeichnen.
3. Geeignete Anregung / Emission Einstellungen auf der Grundlage der verwendeten Abbildungssystems und der Sonde (n).
   1. Optimieren Sie die Einstellungen, um übermäßige Fotobleichen zu verhindern.
      Anmerkung: Hier wurde der Texas Red Dextran 70kD angeregt mit einem DPSS-(561 nm) Laser-und Emissionslicht wurde mit einem Leica Hybriddetektor (HYD) bei 600-650 nm mit dem Emissionsmaximum bei 610 nm detektiert. Laserintensität hat, um die Signalstärke angepasst und gehalten so gering wie möglich zu Photobleichung des Fluorophors (en) und Fototoxizität Wirkung des Laserlichts auf den Zellen zu minimieren. Generell ist es wichtig, die Scangeschwindigkeit, Durchschnittslinie, Scan-Auflösung, Bildintervall und Dauer der Bildgebung auszugleichen, um eine ordnungsgemäße und stabile Signalintensität erhalten und erfassen die gesamte Dauer der Aufnahme und Wulst Phagosomenreifung proProzess.
4. Fügen Sie eine Hellfeld (BF)-Kanal für die Beobachtung der Perlen, wenn sie nicht mit einem Fluorophor konjugiert.
   Hinweis: Neben der Texas Red Kanal wurde BF Kanal verwendet, um die Perlen zu visualisieren, wurde die gleiche DPSS-Laser als die Lichtquelle und das Signal wurde mit einem Photomultiplier (PMT)-Detektor detektiert verwendet.
   Hinweis: Achten Sie auf identische Aufnahmeeinstellungen gelten beim Erwerb von Daten, die zusammengetragen werden soll. Die wichtigsten Parameter sind: Anregung Laserintensitäten, Detektor-Einstellung, Erwerb Einstellungen, Vergrößerung und Bildintervalle. Nicht mit identischen Rahmenintervallen wird eine Kurve-Mittelungsschritt erfordern als die Beobachtungsdaten Punkte nicht überschneiden (z. B. um eine Beobachtung mit Rahmen in jedem 7 Sek. mit einem anderen Satz mit Rahmen an jedem 12 Sek. erworben sammeln). Dies würde die zur Auswertung der Daten notwendigen Schritte zu erhöhen und erfordern zusätzliche Software mit Kurvenmittelungsfunktion, wie OriginLab 's Origin Pro-Statistik-Software ( http://www.originlab.com/ ).
5. Vorzugsweise, speichern Sie die Zeitraffer-Videos im nativen Dateiformat der verwendeten Abbildungssystem und vermeiden Export in komprimierten Formaten.

Anmerkung: (. LIF) Hier wurden Zeitraffer-Filme in der nativen Leica LAS AF-Format-Dateien, die dann direkt importiert wurden auf den Fidschi-Inseln zu öffnen gespeichert. Fidschi ist in der Lage, die native Dateiformate von den meisten Mikroskophersteller mit der enthaltenen Bio-Formate Importeur Plug-in zu lesen. Exportieren der Zeitraffer-Film-Datei in einer Bildserie mit JPG-oder TIFF-oder als Videodatei im AVI-Container-Format ist nicht notwendig oder empfohlen. Neben der Erhaltung der bestmöglichen Bildqualität von der ursprünglichen Beobachtung durch die Vermeidung von verlustbehafteten Kompressionsalgorithmen (zB JPEG), mit dem nativen Dateiformat Mikroskop stellt sicher, dass Meta-Daten der Datei (Zeitmarken, Vergrößerung, Laser-und Akquisitions Intensitäten, Detektoreinstellungen etc.) erhalten und zur Verfügung Fidschi. Allerdings, wenn aus irgendeinem Grund müssen Zeitraffer-Video-Dateien in ein anderes Format für Analyse exportiert werden, stellen Sie sicher, um unkomprimierte Dateiformate wie TIFF-Bildserien und getrennte RGB-Farbe (rot, grün, blau) bereits Kanäle dieses verwenden Schritt, wie Fidschi oft nicht erfolgreich trennen die BF-Kanal von anderen Farbkanäle in exportierten Dateien. Also, stellen Sie sicher, dass Sie die Original-Mikroskop-Dateien als Referenz zu bewahren.

7. Die Analyse der Zeitraffer-Filme

1. Verwenden Sie ImageJ, Fidschi oder andere Software, die eine Signal-Analoga Assoziationsanalyse Fähigkeit bietet.
   Hinweis: Hier wurde Fidschi für die Analyse von Zeitraffer-Filmen verwendet wird. Fidschi ist ein ImageJ Verteilung enthält ein Bildverarbeitungspaket mit Werkzeug reorganisiert Menüs und zusätzliche nativen Plug-Ins zum kostenlosen Download verfügbar unter http://fiji.sc . Die in dieser Sekte beschriebenen VerfahrenIonen ist in Fig. 2 dargestellt.
2. Öffnen Sie die Datei in Fidschi, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" und wählen Sie die Datei oder per Drag & Drop die Datei auf Fidschi.
3. Wählen Sie die folgenden Optionen;
   1. Stapeln Betrachtungs: Blick Stack mit Hyperstack,
   2. Farboptionen: Farbmodus Colorized,
   3. Split-Kanäle in separaten Fenstern: Split-Kanäle (für jeden RGB-Farbkanal, die aufgezeichnet wurde ein separates Fenster wird geöffnet).
4. Bei einer Bildserie zu verwenden, laden Sie die Serie nach Fidschi, indem Sie auf "Datei", "Import", "Bildsequenz", und wählen Sie eine beliebige Bilddatei in den Ordner, der das Zielbild Serie enthält.
   1. Set Filter und Bedingungen für Lade ausgewählten Bilder in der Serie, zum Beispiel;
      1. Anzahl der Bilder: wie viele Bilder geladen werden sollen.
      2. Ab Bild: welches Bild der Ausgangsrahmen in der Serie ist.
      3. Schritt: die Schrittweite zwischenFrames (jeden Rahmen, jeden zweiten Rahmen, etc.) geladen werden.
      4. Dateiname enthält: Filter für bestimmte Kanal mit den Dateinamen (beispielsweise durch Einstellung von "c001", die, wie in der Regel die Bilder von "Kanal 1" nach der Farbtrennung eines Mehrkanal-Zeitraffer-Video markiert ist).
5. Skalierung entfernen, indem Sie auf "Analyze", "Set Maßstab ...", das Kontrollkästchen "Global" und auf "Klicken Sie hier um Zunder zu entfernen".
   Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht pixelbasierten Analyse der Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen für die unterschiedlichen Versuchssätze, die ausgewertet werden sollen, verwendet. Wenn die Vergrößerungseinstellungen haben immer konstant gehalten wurden und der nativen Datei-Mikroskop wurde direkt nach Fidschi importiert, kann dieser Schritt übersprungen werden, da Fidschi können die Vergrößerung und Maßstab Daten aus den Metadaten des Mikroskop-Datei zu verstehen und zu nutzen.
6. Bis Messparameter einstellens, indem Sie auf "Analysieren", "Set Messungen" und überprüfen Sie die folgenden Felder ein: "Area", "Standardabweichung", "Integrierte Dichte", "Display Label" und "Mittlerer Grauwert".
7. Weiterleitung zu den Farbkanal, der das Signal von der Sonde, die gemessen und bestätigen Sie mit "OK" werden soll enthält.
8. Gehen Sie auf die Rahmen, in dem die Messungen gestartet und wählen Sie den BF Kanalfenster, indem Sie auf den oberen Rand des Fensters.
9. Verwenden Sie die "oval-Auswahl-Werkzeug", um eine Region of Interest (ROI) zu wählen, also eine kreisförmige ROI auf der verinnerlichten Perle. Sicherzustellen, dass die Auswahl dicht mit dem äußeren Rand der Sicke in der BF-Kanal sichtbar angebracht.
   Hinweis: Bei Verwendung eines PC, halten Sie die Shift-Taste, während Sie das Auswahl-Werkzeug, um eine kreisförmige ROI zu gewährleisten.
10. Starten Sie die Messung optimal ein paar Frames vor der allseitigen der Wulst abgeschlossen ist, und beachten Sie dieRahmen, in dem ein vollständig gebildet entstehenden Kügelchen phagosome gebildet wird und die phagozytische Becher verschlossen ist. Dies sollte relativ klar in der BF-Kanal erkennbar sein.
11. Gehen Sie auf "Analyze" und klicken Sie auf "Messen", um die Messung auszuführen, das Ergebnis wird in einem separaten Fenster mit dem Titel "Ergebnisse" angezeigt werden.
12. Gehen Sie zum nächsten Bild, passen Sie die Position der ROI bei der Wulst bewegt hat, und wiederholen Sie die Messung. Das Ergebnis wird in die Liste im Ergebnisfenster hinzugefügt werden, jede analysiert Rahmen kann auf der Grundlage der Wert in der Spalte "Label" identifiziert werden.
    Hinweis: Verwenden von Tastenkombinationen (zB "M" für Maßnahme) kann erheblich beschleunigen den Bewertungsprozess, siehe die Liste der Tastenkombinationen, und weisen diejenigen Kostüm unter dem Menü "Plugins".
13. Nach Abschluss der Messung aller relevanten Rahmen, können die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulation wie MS Excel kopiert werden. Die Spalte "IntDen" zeigt die intensities des ausgewählten Bereichs in den Kanal, daß die Messung weitergeleitet.

8. Bleaching-Korrektur

Abhängig von der verwendeten Sonde und Bildeinstellungen können Fotobleichen auftreten. Je nach ihrer Ausdehnung, könnte dies stark auf das Ergebnis der Auswertung. Jedoch kann dieser Effekt teilweise durch Anlegen eines entgegengesetzt gleich der Änderungsrate auf die gemessenen Werte korrigiert werden. Falls vorhanden, kann die Photobleichkoeffizient durch Messung der zeitabhängigen Signalintensität Abnahme der gesamte Rahmen oder speziell zugeschnittene Bereich des Rahmens, während der Zeitspanne relevante Analyse jedes phagosome berechnet. Dieser Prozess ist in den Fig. 3 und 4 dargestellt.

1. Unter dem Menüpunkt "Plugins" von Fidschi, verwenden Sie den "Time Series Analyzer"-Plug-in, um die allgemeine Abnahme der Ganzrahmen oder ROI-spezifischen Sonde Signalintensität über die Zeit (Abbildung 3 bestimmen).
   Hinweis: Time Series Analyzer-Plug-in ist um zum Download zur Verfügung http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , falls nicht schon im Plugins-Menü vor.
2. Zeichnen Sie die Messung gegen die Zeit (in Sekunden) in MS Excel, nur für den Rahmen, die den Rahmen einer analysierten phagosome entsprechen.
3. Tragen Sie eine lineare Trendlinie (4A) auf dem Grundstück, ein negativer Steigung für die abnehmende Signal zeigt die Anwesenheit von Photobleaching-Effekt.
4. Wenden Sie das umgekehrt Steigung, um Werte aus einer analysierten Phagosom (4B und 4C): Korrigierte Signalintensität (SI) = raw SI + (Zeit in Sekunden * Reverse Steigung)

Hinweis: Jede einzelne analysiert Phagosom wird eine bestimmte Zeitspanne (ab vollständige Aufnahme Bild) während einer aufgezeichneten Zeitraffer-Film haben, das Foto-bleacHing muss für diese bestimmte Zeitspanne neu berechnet werden und wird nur für die Korrektur der Messwerte aus diesem spezifischen phagosome gültig sein.

9. Datenauswertung

1. Sortieren Sie die Daten und berechnen Sie den Durchschnitt und die statistischen Fehler der Bleich-korrigierten Werte in entsprechende Software.
2. Zeichnen Sie die ausgewerteten Daten in geeigneter Form.

Hinweis: Hier werden die wissenschaftlichen Statistiken und Plotten Software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) verwendet. Prisma Software ist in der Lage, so lange wie alle Daten die gleiche Bildrate (dh alle wurden mit den gleichen Abständen, wie beispielsweise einem Rahmen alle 10 Sekunden erfasst) erzeugen und zeichnen eine mittlere Kurve mit den entsprechenden Fehlerindikatoren.

Hinweis: Große Unterschiede der absoluten Werte in SI-Wiederholungen des gleichen experiment-Set wird sehr große statistische Fehler vor und machen die Daten unbrauchbar. Dies kann der Fall sein, wenn das Protokoll, z. B. Bildeinstellungen sind nicht zwischen den verschiedenen Experiment wiederholt, die zusammengetragen werden, sind völlig identisch gehalten.

Die richtige Vorbereitung der Zellen und die Perlen für die Bildgebung ist kritisch. Abbildung 1 zeigt den Umriss der Aussaat, Sonde-loading und erste Schritte in diese bildgebenden Verfahren auf der Grundlage unserer optimiertes Protokoll für BMM. Es ist daher wichtig, dass die Protokollparameter getestet und optimiert werden, je nach der Art der Zellen und Sonden, die verwendet werden sollen.

Nach Zugabe der IgG-beschichteten Kügelchen an die vorgespannte Zellen ist es wichtig, dass das Sichtfeld in einer Weise, die größte Anzahl von möglichen Ereignissen in der Aufnahme der größten Anzahl von Zellen zu bieten gewählt, während auf den vorgegebenen Vergrößerungseinstellung des Protokolls. Wie in Abbildung 2 dargestellt, kann dieser Ansatz für eine größere Anzahl von auswertbaren Phagosomen in jedem Zeitraffer-Video bieten. Zusätzlich zur Erhöhung der Datenpunkte pro Video Ausbeute von jedem Experiment Satz nimmt dieser die Variation durch Variieren Peri eingeführtRAL Bedingungen und erhöht die Zuverlässigkeit der Daten.

Es wird empfohlen, daß die Signalvereinigungsmessverfahren (2) von derselben Person und in einer Blind Weise, wenn möglich, durchgeführt werden. Dies könnte dazu beitragen, den Fehler, indem mehrere persönliche Fehlerquellen und reduzieren die Vorspannung, wie der ROI zu jedem phagosome zugeordnet ist, ausgewählt und nach jeder Rahmen von Hand bewegt werden.

Während natürlich die Regel "je größer die Stichprobe, desto besser" gilt auch hier, vermeiden wir die Bewertung von mehr als 5 Perlen phagosome pro Zelle in das Blickfeld zu verhindern, was zu viel Gewicht auf eine einzelne Zelle als das Verhalten aller Zellen innerhalb der gleichen Kultur ist nicht notwendigerweise homogen 19. Diese Phagosomen sollte so weit wie möglich nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden. In diesem Zusammenhang Parameter wie Phagosomen nicht voll sichtbar in der Brennebene für die gesamte Dauer der Bildgebung und auch nicht in derdurch übermäßige Foto Bleich betroffen sind unerlässlich. Außerdem Fluidaufnahme eine große Anzahl von großen Partikeln von einer einzigen Zelle können die Fusionsdynamik für die Phagosomen in der Zelle beeinflussen, so dass die Priorität sollte den Phagosomen, die früher in den Prozess durch eine relativ "leeren Zelle" uptaken gegeben werden. Als allgemeine Regel gilt, dass die gemittelten Messwerte von mindestens fünf Zellen, die aus bis zu fünf unabhängigen Experimenten (also bis zu 25 Phagosomen) für eine gute statistische Signifikanz zu liefern.

Die Anwendung der Zeitreihenanalyse oder ein vergleichbares Verfahren, um eine mögliche Foto-Bleichwirkung (Abbildung 3) zu erkennen ist sehr wichtig, da einige Sonden von der starken Bleich leiden, während einige sind sehr photostabil. Der Photobleichkorrekturschritt (Fig. 4) nur angewendet werden, wenn eine starke Bleichwirkung bei allen Versuchen mit der gleichen Sonde beobachtet. Es muss darauf hingewiesen werden, dass dieses Verfahren nur teilweise richtigdie Wirkung der Bleich. Wichtig ist, dass übermäßiges Bleichen nur in wenigen Fällen ein Zeichen von nicht optimalen Bedingungen, wie falsch Anregungs-oder Imaging-Einstellungen, falsche Medium pH-Wert, ungesunde Zellen oder nonfresh Reagenzien.

In 5C mit einem Pfeil angedeutet die Wulst-phagosome in der Fig. 5A und 5B, wird analysiert und die Dex70kD Signalintensität (SI)-Unterstützung zur Reifung phagosome während einer Zeitspanne von 90 min aufgetragen. Die Quelle des Rauschens in der Kurve ist der Rahmen, um Variationen des Messsignals durch Faktoren wie Obstruktion des analysierten phagosome andere Phagosomen und Fokalebene Schwankungen Rahmen. Allerdings ist die zeitliche Entwicklung der Signal Assoziation zum Phagosom leicht klar. Nach Mittelung der Analyse von 10 Phagosomen aus den beiden Zellen in 5A sichtbar ist, kann eine Durchschnittskurve dargestellt werden (5D), für die die statistische error kann als Standardfehler des Mittelwerts (SEM) oder die Standardabweichung (SD) in Abhängigkeit von der Probenmenge und Versuchsbedingungen aufgetragen werden. Während die absolute SI-Werte der gemittelten Kurve ist in der Regel anders als die eines einzelnen analysiert Phagosom ist die zeitliche Entwicklung der Regel sehr ähnlich. Nach der Analyse kann der Schluss gezogen, dass die Lieferung von Dex70kD als lysosomale Lumen Fracht zu Wulst-Phagosomen in Wildtyp BMM ein Plateau erreicht in der 35 bis 40 Minuten nach der Phagozytose werden.

Dieses Verfahren kann daher verwendet werden, um die qualitative oder quantitative Wirkung verschiedener Faktoren auf Phagosomenreifung Verfahren zu untersuchen.

Fig. 1 ist. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung. Vorbereitete BMM in einem Glasbodenschale mindestens 12 Stunden vor der Zugabe ausgesätDextran wird Lösung von Dextran in Medium mit 20 ug / ml Konzentration zugegeben und für 2-8 h (Laden) inkubiert, die Zellen werden gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und Zelle für mindestens 4 h (chase) inkubiert, um Zellen erneut gewaschen und Bead-Suspension wird unmittelbar vor Beginn der Bildgebung aufgenommen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

2. Schritt für Schritt-Anleitung für die Bildanalyse. Nach dem Laden der Zeitraffer-Video-oder Bildsequenz in verschiedenen Kanälen in Fidschi, die Auswertung folgt in diesen Schritten (Beachten Sie, dass die Abbildung zeigt eine Bildcollage und nicht alle hier abgebildeten Fenster gleichzeitig geöffnet bleiben ). (A) Unter den "Analyze"-Menü, PixelAbstand Skalierung wird, falls die Meta-Daten der Bilder sind nicht für Fidschi zurückzusetzen, verschiedene Vergrößerungen zuvor in Fidschi verwendet oder die Zeitraffer-Aufnahmen sind in verschiedenen Vergrößerungen, indem Sie auf (b) "Set Scale" ( c) Ankreuzen des "Global"-Box, die den Reset für alle nachfolgend geladenen Bild-Serie gilt und auf "klicken Sie auf das Scale-Entfernen". (D) Stellen Sie sicher, dass sowohl das Hellfeld (BF) Kanal-Bildserie (wo Wulst-Phagosomen sind deutlich sichtbar) und der Kanal mit Sondensignals geladen und haben genau die gleichen Rahmen-Grafen und Pixelabmessungen, z. B.. zwei Reihen von je 400 Frames 450 x 450 Pixel-Dimensionen. (E) Unter Menü "Analysieren", können die Parameter der Bewertung unter "Set Messungen", in dem "Bereich", "Integrierte Dichte" und "Display Label" Parameter ausgewählt werden müssen, festgelegt werden. (F (G) Dies gewährleistet die Messung der Rot-Kanal-Intensität in der gleichen Region of Interest (ROI), der von der gestrichelten Linie und der weiße Pfeil in Rot-Kanal angezeigt wird. Das Rundschreiben ROI in der BF-Kanal mit Hilfe der "Oval" Auswahl-Werkzeug ausgewählt ist. (H) Starten Sie die Messung unter "Analysieren", "Messen" oder mit der Tastenkombination Befehl ein, und wiederholen Sie für jeden Frame der gesamten Serie für die gewünschte Dauer des Experiments (z. B. 90 min). In jedem Rahmen bewegen und justieren Sie den ROI-Ort zur Raupen Phagosom der Zinsen und beachten Sie, dass als nächstes Rahmen in der BF-Serie und geben die "Measure"-Befehl automatisch misst den ROI in dem entsprechenden Rahmen der rot-Kanal. (I) Die Messergebnissewerden als Liste im Fenster "Ergebnisse" angezeigt. In der Spalte "Bezeichnung" wird die genaue Rahmen für jede Zeile eindeutig identifiziert; nutzen diese, um für die wiederholte Messung einer einzelnen Rahmen oder übersprungen Frames in langen Bildserien zu überprüfen. (J) Der "IntDen", kurz für integrierte Dichte ist die kritische Ausgangsparameter; kopieren zumindest das Etikett und die "IntDen" Werte in eine Excel-Tabelle, mit der Bewertung fortsetzen. Die Einheit der IntDen Wert ist nicht definiert und als willkürliche Einheiten (au) angegeben ist, bedeutet dies nicht, Probleme zu schaffen, solange die Protokolle strikt befolgen. Maßstabsbalken 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

3. Analyse von Foto-Bleichen.60 (a) Bild Open-Serie in den Kanal von Interesse und stellen Sie sicher, wurde die Skala bei Bedarf entfernt, (b) Unter "Plugins" Menütaste (c) "Time Series Analyzer". (D) Mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug ein rechteckige ROI, die fast den ganzen Rahmen oder zumindest die gesamte Zelle von Interesse für die gesamte Dauer des Films, (e) fügen Sie die ausgewählten ROI, (f) Sie auf "Ihre Durchschnitts Zeitspuren "und (g) Die Ergebnisse werden in der angezeigt werden", "Tisch und" Time Traces Average "Handlung. Beachten Sie jedoch, daß nur ein "durchschnittlicher" (mittlere Intensität) Wert wird mit der Rahmennummer und nicht die "IntDen"-Wert aufgezeichnet. (H) Unter "Analyze"-Menü, run "Measure" ohne Änderung der anderen Parameter, um die "IntDen" für die exakt gleiche ROI im gleichen Rahmen zu messen. Dadurch wird das Äquivalent der Me bereitzustelleneine Intensität in "IntDen", verwenden Sie diesen Wert, um den Umrechnungsfaktor (entspricht der "Area") zu berechnen und zeichnen Sie die "IntDen" der ganzen Rahmen ROI gegen die Zeit in Sekunden in MS Excel. (J) Klicken Sie auf "List", die Liste der Werte kopieren, um eine Excel-Tabelle und konvertiert alle "Mean"-Werte auf "IntDen"-Werte. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

4. Korrektur der Fotobleichen. Abhängig von der verwendeten Sonde und Abbildungseinstellungen, können Fotobleichen auftreten. Dies könnte sich stark auf das Ergebnis der Auswertung. A) Raw IntDen Werte (in au) der Sonde aus dem gesamten Rahmen gegen die Zeit in Sekunden in MS Excel aufgetragen. Fügen Sie eine lineareTrend-line;.. ein klar negativer Steigung zeigt die Anwesenheit von Photobleaching-Effekt B) Als Beispiel der Anwendung der umgekehrt Slop auf der rohen IntDen mit der Korrekturformel ergibt die korrigierte IntDen C) Korrigierte IntDen Werte sind teilweise für die kompensierte Wirkung von Foto-Bleichen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

5. Darstellung von repräsentativen Zellen, Kinetik und Mittelung des korrigierten Signals. A) BMM mit Dextran Sonde bei Aufnahme des IgG-beschichtete Kügelchen durch den Pfeil angedeutet geladen min bei 0. Maßstabsbalken 10 um. Entspricht ein Film B) das 2,5 fache vergrößert einfügen von einem Zeitraffer-Film, der Darstellung der angegebenen Phagosom über einen Zeitraum von 85 min für bessere Sicht mit "thal" Look-Up-Table (LUT) in ImageJ nach der Aufnahme, falsch-farbig. Die gemessene phagosome ROI wird mit der weißen gestrichelten Linie gekennzeichnet. Die Instanzen von Dextran Lieferung und Akkumulation in der Phagosom sind mit weißen Pfeilen angedeutet. C) Korrigierte Fluoreszenzsignal von Texas Red Dextran 70kDa von Lysosomen geliefert an die angegebene Phagosom. D) gemittelte Fluoreszenz IntDen Werte von 10 Phagosomen innerhalb der beiden angegebenen Zellen ± SEM . Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.