Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen In-vitro-

Zusammenfassung

Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren gab es die Schwierigkeit, wirksamer Therapien gegen Krebs mit weniger systemische Nebenwirkungen. Daher Photodynamische Therapie ist ein neuer Ansatz für eine Tumor selektive Behandlung.

Photodynamische Therapie (PDT), die Verwendung eines nicht-toxischen macht Photosensibilisators (PS), die bei Aktivierung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in Gegenwart von Sauerstoff, Sauerstoff-Radikale erzeugt, die eine zytotoxische Reaktion ¹ hervorzurufen. Trotz seiner Zustimmung vor fast zwanzig Jahren von der FDA wird PDT heute nur noch verwendet, um eine begrenzte Anzahl von Krebsarten (Haut, Blase) und nononcological Erkrankungen (Psoriasis, aktinische Keratose) ² zu behandeln.

Der Hauptvorteil der Anwendung der PDT ist die Fähigkeit, eine lokale Behandlung, die systemischen Nebenwirkungen verhindert zuführen. Darüber hinaus ermöglicht es die Behandlung von Tumoren an empfindlichen Stellen (zB um Nerven oder Blutgefäße). Hier wird ein intraoperative Anwendung der PDT wird als in Osteosarkom (OS), einem Tumor des Knochens, um Primärtumor Satelliten gezielt in Tumor umgebende Gewebe nach chirurgischer Tumorentfernung hinter sich gelassen. Die Behandlung zielt auf die Verringerung der Anzahl von Wiederholungen und zur Verringerung der Gefahr für die (postoperativ) Metastasierung.

In der vorliegenden Studie, in vitro PDT präsentieren wir Verfahren, um die optimalen Einstellungen für die PDT effektive Behandlung der weit verbreiteten OS-Zelllinien, die verwendet werden, um die menschliche Krankheit in etablierten intratibial OS Mausmodelle reproduzieren zu etablieren. Die Aufnahme des PS mTHPC wurde mit einem Spektrophotometer und Phototoxizität wurde mit Laserlichtanregung bei 652 nm mTHPC provoziert Zelltod mit einem WST-1-Assay und durch das Zählen der überlebenden Zellen beurteilt induzieren sucht. Die etablierten Techniken ermöglichen es uns, die optimalen Einstellungen PDT für zukünftige Studien in Tiermodellen zu definieren. Sie sind eine einfache und schnelle Werkzeug für die Bewertung der Wirksamkeit der PDT in vivo.

Einleitung

Der heutige Stand der Technik Behandlung von Osteosarkom (OS), eine primäre Knochentumor, umfasst eine Kombination von neo adjuvante Chemotherapie und Chirurgie. Dieses Behandlungsschema ergab eine Erhöhung der Überlebensrate von Patienten mit lokalisierter Erkrankung von etwa 20% vor der Verwendung der Chemotherapie zu Zeit zwischen 60-70% ^{3, 4.} Doch in den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit OS lokale Erkrankung Plateau ^{4, 5.} Außerdem 30-40% dieser Patienten einen Rückfall innerhalb von 3 Jahren nach der Diagnose und bei Patienten mit metastatischen Erkrankung weiterhin eine schlechte Überleben von 20-30% ^{4, 6, 7} aufweisen. Um die Ergebnisse dieser Patienten zu verbessern, müssen neue therapeutische Strategien entwickelt werden.

Photodynamische Therapie (PDT), eine ziemlich neuartige Antikrebstherapie verwendet Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Anregung eines phototizer (PS), die nach der Injektion in den Blutstrom in den Tumorzellen akkumuliert. Laserlichtanregung der PS erzeugt Sauerstoffradikale in Gegenwart von Sauerstoff, die zytotoxische Reaktion in Tumorzellen und Zelltod induzieren. Neben dieser Hauptmechanismus, zwei zusätzliche PDT hervorgerufen biologische Prozesse tragen zu reduziertem Tumorwachstum: PDT verursacht Vasokonstriktion und Thrombosebildung des Tumors Mikrovaskulatur und damit lokale Hypoxie und Anoxie im Tumor, was zu Tumorinfarkt. Schließlich verletzt PDT und sterbenden Tumorzellen auslösen, eine lokale Immunantwort, eine ziemlich einzigartige Merkmal der PDT. Dies beinhaltet das Komplementsystem und die Aktivierung von Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen ^8. Somit sind die Bedingungen für die Präsentation von Tumorantigenen mit anschließender Aktivierung lymphoider Zellen erzeugt, was zu tumorspezifischen Immunität.

So weit, PDT wurde verwendet, um verschiedene Arten von Weichteiltumoren und hyperpl behandelnAsiens, wie aktinische Keratose, Barrett-Ösophagus, Endobronchialtumor, Blasenkrebs, Basaliome und palliative Behandlung von Kopf-und Halskrebs ^2. Die Behandlung ist bekannt, lokal, Groß Nekrose mit wenig Nebenwirkungen zu induzieren, und hat damit das Potenzial, Tumorgewebe selektiv zu beseitigen. Trotz dieser Vorteile bleibt die Anwendung der PDT technisch anspruchsvoller als die Verabreichung von Chemotherapeutika. Um die maximale Wirksamkeit, die PS-Konzentration, Belichtungszeit und Gesamtlichtenergieübertragung zu erreichen müssen optimiert werden. Dies kann in in vivo-Experimenten gemacht werden, aber aufgrund der relativ großen Anzahl von Parametern, die optimiert werden müssen, ist es effizienter, um optimale Bedingungen in vitro zunächst bestimmen.

In den unten beschriebenen Experimenten testeten wir die in vitro Wirksamkeit der PDT mit der PS 5,10,15,20-Tetrakis-(meta-hydroxyphenyl)-chlOrin, abgekürzt mTHPC (Abbildung 1A). mTHPC ist der Wirkstoff in dem Arzneimittel Foscan, die derzeit in der Klinik für die palliative Behandlung von Kopf-und Halstumoren eingesetzt wird. Es ist eines der stärksten PS, Induktion massiven Zellschäden bereits bei niedrigen Konzentrationen, und es wurde gezeigt, besser als andere zu sein PS in Bezug auf Gewebepenetration ^{9, 10.} Die Lichtabsorptionsspektrum (Abbildung 1B) zeigt zwei prominente Peaks, einen bei 417 nm und eine zweite bei 652 nm, die für die Gewebe Lokalisierung der anfall PS und für die PDT Induktion verwendet werden, auf.

Derzeit ist eine liposomale Formulierung für mTHPC in der Entwicklung. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Aufnahme von diesem liposomale Formulierung zu quantifizieren und PDT in zwei menschlichen Zelllinien OS durchzuführen; die niedrige metastasierendem HOS und die hohen metastatischen 143B-Zellen. Einige der hier vorgestellten Daten wurden zuvor ¹¹ gemeldet. Thhier beschriebenen e-Ansatz ermöglicht es uns, die Wirkung einer metastatischen Phänotyp PDT Wirksamkeit zu untersuchen. 143B-Zellen, orthotop in die Hinterbeine von immundefizienten SCID-Mäusen injiziert verursachen intratibial metastasierenden Primärtumoren, ein Modell genau imitiert die menschliche metastasierende Erkrankung. So sind die vorgeschlagenen in vitro Experimente perfekt geeignet zur Beurteilung der optimalen Einstellungen PDT später in in vivo-Experimenten verwendet werden.

Protokoll

1. Vergleich der Aufnahme von mTHPC in den jeweiligen Nieder-und Hoch Metastatische HOS und 143B OS-Zelllinien

1. Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM, Ham F12 und hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum in einem Verhältnis 4.5:4.5:1.
   Hinweis: Die liposomale Formulierung der PS mTHPC wurde in Wasser in einer Endkonzentration von 1,5 mg / ml mTHPC gelöst.
2. Platte 0,2 x 10 ⁶ HOS und 143B Zellen / Well in 6-Well-Platten (dreifacher Ausführung für jede Bedingung) und lassen die Zellen über Nacht halten.
   Hinweis: Die Nummer muss auf einzelne Zelllinien eingestellt werden. Eine Konfluenz von 80-90% am meisten zu der Zeit des Versuchs geeignet.
3. Am folgenden Tag, Inkubation der Zellen mit einer festen Konzentration von mTHPC für verschiedene Zeiträume (zeitabhängige Aufnahme) oder mit steigenden Konzentrationen von mTHPC während einer festen Zeitperiode (Dosis abhängige Aufnahme).
4. Die Zellen mit mTHPC inkubieren bestimmten Zeit punkte oder Konzentrationen von mTHPC.
   Anmerkung: In dieser Studie wurden sowohl die HOS und 143B Zelllinien mit 0,6 &mgr; g / ml inkubiert mTHPC für 0, 2,5, 5 oder 10 Stunden, oder mit 0, 0,6, 2,5 und 10 ug / ml mTHPC 5 Stunden. Die angewandten Zeiträume und Dosierungen können in Abhängigkeit von der Zelllinie, die verwendet wird, variieren.
5. Denken Sie daran, immer im Dunkeln oder bei gedimmten Lichtverhältnissen arbeiten, um Licht Exposition der Zellen zu verhindern.
6. Nach Inkubation der Zellen bei den angegebenen Bedingungen absaugen Medium und die Zellen werden dreimal mit PBS. Als nächstes lösen Sie die Zellen mit 0,5 ml Trypsin / EDTA und zählen Sie die Zellen.
7. Nach dem Ablösen Zentrifugation der Zellen bei 400 × g für 5 min, saugt den mittleren und Resuspendieren der Zellen in PBS auf eine endgültige Dichte von 200.000 Zellen / ml.
8. Je 100 &mgr; l der erhaltenen Zellsuspension (dh 20.000 Zellen) in einer 96-well-Platte und Messen der Fluoreszenz dieser Zellen in einem Fluoreszenz-Spektralphotometer. Die Einstellungs für mTHPC Fluoreszenzmessungen sind: 417 nm für die Anregung und 652 nm für die Emission.
9. Um die Menge des pro Zelle internalisierten mTHPC berechnen, normalisieren die relative Fluoreszenzeinheit (RFU) für die Zellzahl und Zellvolumen, wie folgt:
10. Bereiten Sie eine Standardkurve mit verschiedenen Konzentrationen von mTHPC in PBS von 0-4 pg / ml (Verwendung Dreifachmessungen). Je 100 ul jeder Verdünnung in eine 96-Well-Platte und messen die Fluoreszenz der Brunnen mit den unter Schritt 1.6 beschriebenen Einstellungen.
11. Teilen die RFU (20.000 Zellen) erhalten durch die Steigung der linearen Standardkurve von mTHPC, die die Konzentration von mTHPC (in ug / ml) in dem Schacht gibt.
12. Teilen diese mTHPC Konzentration von 10, um die Gesamtmenge der mTHPC in einer Vertiefung (in &mgr; g, die 100 ul der Zellsuspension) erhalten und teilt diesen Wert durch das Volumen von 20.000 Zellen.
13. Berechnen Sie das Volumen mit der Formel für eine Kugel: (4/3 x π) xr ^3. Erhalten des Radius r durch Messen des Durchmessers von 20 trypsiniert Zellen unter einem Mikroskop, und Dividieren dieses Werts durch 2.
14. Schließlich normalisieren alle Werte mit denen für HOS-Zellen nach 10 h Inkubation (dosisabhängige Aufnahme) oder mit 10 ug / ml mTHPC (Zeit abhängige Aufnahme), die auf 100% gesetzt wurden behandelt worden sind.

2. Die Messung der Phototoxizität von PS In-vitro-

1. Seed 3.000 Zellen / Well in einer 96-Well-Platte (dreifacher Ausführung für jede Konzentration der mTHPC verwendet) und lassen Sie sie über Nacht zu halten. Ebenso bereiten eine zusätzliche 96-Well-Platte und Behandlung der Zellen, wie unten beschrieben, aber dann legte sie beiseite für Phasenkontrast-Bildgebung.
   Anmerkung: Die Anzahl muss für jede einzelne Zelllinie eingestellt werden. Eine Konfluenz von 50-60% zum Zeitpunkt des Experiments ist ideal.
   1. Denken Sie daran, die entsprechende Dunkeltoxizität Kontrolle von Zellen für jedes der mTHPC-Konzentrationen hinzufügen. Diese sind Zellen, die in Abwesenheit oder in Gegenwart von ausgewählten Konzentrationen mTHPC inkubiert werden, wird aber nicht ausgeleuchtet werden.
2. Am folgenden Tag, Inkubation der Zellen mit je nach Zelllinien verschiedenen Konzentrationen von mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 und 10 ug / ml) und halten sie in der Dunkelheit für 5 Stunden.
   1. Siehe Abschnitt 1.3.2
      Hinweis: Die Inkubationszeit vor der Bestrahlung hängt von der Zelllinie und der PS verwendet, daher ist es ratsam, den verschiedenen Konzentrationen und zu verschiedenen Zeitpunkten in getrennten Experimenten getestet.
3. Nach der Inkubation für den angegebenen Zeitraum, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und neue frisches Medium ohne mTHPC.
4. Beleuchten Sie die Zellen mit einem 652 nm Diodenlaser, die spezifisch für die mTHPC Absorptionsspektrum (siehe Abbildung 1).
   1. Stellen Sie den Laser, um 21.88 mW / cm ² Leistung bei einer Höhe von 13,5 cm distaNOA aus den Zellen, um eine Energiedosis von 5 J / cm ² erhalten. Beleuchten Sie die Zellen für 230 sek. Beleuchten Sie nicht die Dunkeltoxizität Kontrollzellen (mit und ohne mTHPC).
      Hinweis: Tragen Sie immer eine Brille, die Augen von der zur Anregung der PS verwendet Laserlicht zu schützen.
5. Nach der Beleuchtung, halten die Zellen im Dunkeln bei 37 º C für 24 Stunden. Anschließend fügen wasserlösliche Tetrazoliumsalz (WST-1)-Reagenz (10 μl/100 ul Medium).
6. Drei Stunden nach der Zugabe des WST-1-Reagens wird die Extinktion der einzelnen Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen bei 415 nm auf.
7. Um den Prozentsatz der überlebenden Zellen zu berechnen, setzen Sie den Mittelwert der für die nicht behandelten Zellen mTHPC für jede Bedingung zu 100% (dh beleuchtet, ohne mTHPC und nonilluminated, ohne mTHPC) erhaltenen Werte.

3. Schätzung der Anzahl von Zellen durch Zellzählung

1. Seed 20.000 Zellen / wirll in einer 24-Well-Platte und lassen Sie sie über Nacht zu halten.
2. Inkubieren der Zellen für 5 h mit mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 und 1,25 ug / ml) und beleuchten sie wie oben beschrieben.
3. Sammeln Sie das Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, trypsinize sie und sammeln sie durch Zentrifugation bei 400 g für 5 min.
4. Nach der Zentrifugation saugen Sie den mittel-und Resuspendieren der Zellen in 200 ml frisches Medium.
5. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer.

Ergebnisse

Mit den hier berichteten Techniken untersuchten wir mTHPC-basierte PDT in menschlichen Zellen OS. Zuerst wurde die Zeit-und Dosis-abhängige Aufnahme von mTHPC im niedrigen metastatischen HOS und in den hoch metastatischen 143B OS Zelllinien untersucht. mTHPC Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz des mTHPC mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Abbildung 2, mit freundlicher Genehmigung von Reidy et al. ¹¹ wiedergegeben) beurteilt werden. 2A veranschaulicht die...

Diskussion

Um eine optimale Zytotoxizität in Reaktion auf die PDT zu erreichen, ist es entscheidend, die richtigen Laser Lichteinstellungen und Inkubationszeiten zu wählen. Die hier beschriebenen Verfahren sind konsistent und effizient zu PS-Aufnahme zu bestimmen und PDT induzierte Zytotoxizität in vitro zu quantifizieren. Verwendung der spezifischen Absorptionswellenlängen der PS mTHPC kann die zelluläre Aufnahme PS in direkter Weise bestimmt werden, und die PS kann aktiviert werden, um zytotoxische reaktive Sauerstoffsp...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Deutschland	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Deutschland	E15-817
Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum	GIBCO, Basel, Schweiz	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Deutschland		Da diese liposomale Formulierung aus dem Hause R& D Zur Zeit ist keine Katalognummer verfügbar. Bestand: 1,5 mg/ml; Geliefert in einer 9:1 Mischung aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% Reinheit)
Spectramax Gemini XS Plate Reader	Molecular Devices, Sunnyvale,	CA ID# 861
Mikroskop Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena
Deutschland Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Deutschland	LD652nm2W400u
Wasserlösliches Tetrazolium (WST)-Reagenz	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Schweiz	1644807