Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

Zusammenfassung

Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren gab es die Schwierigkeit, wirksamer Therapien gegen Krebs mit weniger systemische Nebenwirkungen. Daher Photodynamische Therapie ist ein neuer Ansatz für eine Tumor selektive Behandlung.

Photodynamische Therapie (PDT), die Verwendung eines nicht-toxischen macht Photosensibilisators (PS), die bei Aktivierung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in Gegenwart von Sauerstoff, Sauerstoff-Radikale erzeugt, die eine zytotoxische Reaktion ¹ hervorzurufen. Trotz seiner Zustimmung vor fast zwanzig Jahren von der FDA wird PDT heute nur noch verwendet, um eine begrenzte Anzahl von Krebsarten (Haut, Blase) und nononcological Erkrankungen (Psoriasis, aktinische Keratose) ² zu behandeln.

Der Hauptvorteil der Anwendung der PDT ist die Fähigkeit, eine lokale Behandlung, die systemischen Nebenwirkungen verhindert zuführen. Darüber hinaus ermöglicht es die Behandlung von Tumoren an empfindlichen Stellen (zB um Nerven oder Blutgefäße). Hier wird ein intraoperative Anwendung der PDT wird als in Osteosarkom (OS), einem Tumor des Knochens, um Primärtumor Satelliten gezielt in Tumor umgebende Gewebe nach chirurgischer Tumorentfernung hinter sich gelassen. Die Behandlung zielt auf die Verringerung der Anzahl von Wiederholungen und zur Verringerung der Gefahr für die (postoperativ) Metastasierung.

In der vorliegenden Studie, in vitro PDT präsentieren wir Verfahren, um die optimalen Einstellungen für die PDT effektive Behandlung der weit verbreiteten OS-Zelllinien, die verwendet werden, um die menschliche Krankheit in etablierten intratibial OS Mausmodelle reproduzieren zu etablieren. Die Aufnahme des PS mTHPC wurde mit einem Spektrophotometer und Phototoxizität wurde mit Laserlichtanregung bei 652 nm mTHPC provoziert Zelltod mit einem WST-1-Assay und durch das Zählen der überlebenden Zellen beurteilt induzieren sucht. Die etablierten Techniken ermöglichen es uns, die optimalen Einstellungen PDT für zukünftige Studien in Tiermodellen zu definieren. Sie sind eine einfache und schnelle Werkzeug für die Bewertung der Wirksamkeit der PDT in vivo.

Einleitung

Der heutige Stand der Technik Behandlung von Osteosarkom (OS), eine primäre Knochentumor, umfasst eine Kombination von neo adjuvante Chemotherapie und Chirurgie. Dieses Behandlungsschema ergab eine Erhöhung der Überlebensrate von Patienten mit lokalisierter Erkrankung von etwa 20% vor der Verwendung der Chemotherapie zu Zeit zwischen 60-70% ^{3, 4.} Doch in den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit OS lokale Erkrankung Plateau ^{4, 5.} Außerdem 30-40% dieser Patienten einen Rückfall innerhalb von 3 Jahren nach der Diagnose und bei Patienten mit metastatischen Erkrankung weiterhin eine schlechte Überleben von 20-3....

Protokoll

1. Vergleich der Aufnahme von mTHPC in den jeweiligen Nieder-und Hoch Metastatische HOS und 143B OS-Zelllinien

1. Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM, Ham F12 und hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum in einem Verhältnis 4.5:4.5:1.
   Hinweis: Die liposomale Formulierung der PS mTHPC wurde in Wasser in einer Endkonzentration von 1,5 mg / ml mTHPC gelöst.
2. Platte 0,2 x 10 ⁶ HOS und 143B Zellen / Well in 6-Well-Platten (dreifacher Ausführung für jede Bedingung) und lassen die Zellen über Nacht halten.
   Hinweis: Die Nummer muss auf einzelne Zelllinien eingestellt werden. Eine Konfluenz von 80-9....

Ergebnisse

Mit den hier berichteten Techniken untersuchten wir mTHPC-basierte PDT in menschlichen Zellen OS. Zuerst wurde die Zeit-und Dosis-abhängige Aufnahme von mTHPC im niedrigen metastatischen HOS und in den hoch metastatischen 143B OS Zelllinien untersucht. mTHPC Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz des mTHPC mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Abbildung 2, mit freundlicher Genehmigung von Reidy et al. ¹¹ wiedergegeben) beurteilt werden. 2A veranschaulicht die.......

Diskussion

Um eine optimale Zytotoxizität in Reaktion auf die PDT zu erreichen, ist es entscheidend, die richtigen Laser Lichteinstellungen und Inkubationszeiten zu wählen. Die hier beschriebenen Verfahren sind konsistent und effizient zu PS-Aufnahme zu bestimmen und PDT induzierte Zytotoxizität in vitro zu quantifizieren. Verwendung der spezifischen Absorptionswellenlängen der PS mTHPC kann die zelluläre Aufnahme PS in direkter Weise bestimmt werden, und die PS kann aktiviert werden, um zytotoxische reaktive Sauerstoffsp.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Deutschland	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Deutschland	E15-817
Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum	GIBCO, Basel, Schweiz	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Deutschland		Da diese liposomale Formulierung aus dem Hause R& D Zur Zeit ist keine Katalognummer verfügbar. Bestand: 1,5 mg/ml; Geliefert in einer 9:1 Mischung aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% Reinheit)
Spectramax Gemini XS Plate Reader	Molecular Devices, Sunnyvale,	CA ID# 861
Mikroskop Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena
Deutschland Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Deutschland	LD652nm2W400u
Wasserlösliches Tetrazolium (WST)-Reagenz	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Schweiz	1644807