Dieser Bericht beschreibt eine einfache und schnelle Technik der intrathekalen Punktion für eine lokalisierte Transfektion von siRNA in der Lenden-Wirbelsäule in der Maus unter Kurznarkose dauerhafte Licht.
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Methodenartikel
In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Technik der akuten intrathekalen Nadel-Injektionen in einer nicht-invasive Weise, dh unabhängig von der Katheter-Implantation. Der technische Nachteil dieser Operationstechnik liegt in der Feinheit der Hände. Die Einspritzung schnell, vor allem für einen geschulten Experimentator, und da Gewebezerstörung mit dieser Technik minimal ist, sind wiederholte Injektionen möglich, außerdem Immunreaktion auf Fremdwerkzeugen (. Z. B. Katheter) tritt nicht auf, wodurch eine bessere und spezifischere ausgelesen Rückenmarks Modulation. Da die Anwendung der Substanz im Wesentlichen auf die Zielregion des Rückenmarks beschränkt sind, Arzneimittel, nicht in großen Dosierungen angewendet werden müssen, und vor allem unerwünschte Wirkungen auf andere Gewebe, wie bei einer systemischen Verabreichung beobachtet dann umgangen werden, 1, 2. Darüber hinaus kombinieren wir diese Technik mit in-vivo-Transfektion von Nukleinsäure mit Hilfe polyethylenimine (PEI)-Reagens 3, die enorme Vielseitigkeit für die Untersuchung der Wirbelsäule Funktionen über Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen sowie Gen-, RNA-und Protein-Modulatoren zur Verfügung stellt.
Einleitung
Das Rückenmark ist ein sehr wichtiges Zentrum in einer Vielzahl von wichtigen biologischen Prozessen und physiologischen Funktionen, einschließlich der Verarbeitung und Übertragung von schmerzhaften (nozizeptiven) Eingängen 4-7. Verschiedene experimentelle Techniken entwickelt, um pharmakologische Modulation des Rückenmarks, wie chronische Implantation intrathekalen Katheter 8, Rückenmark-Mikroinjektion und intrathekale Injektion Nadel 9 zu ermöglichen. Jedes Verfahren hat seine eigenen Vorteile und Nachteile, je nach dem Experiment Paradigma eine Technik vielleicht besser geeignet als die anderen. Während chronische Implantation von intrathekalen Katheter ist ohne weiteres möglich in Ratte, ist diese Methode sehr schwierig in der Maus, da Größenbeschränkungen. Erfolgsquote ist sehr niedrig und motorische Defizite auftreten, oft aufgrund der sperrigen Anwesenheit eines Katheters in der stark beschränkt Subduralraum in der Maus. Darüber hinaus wird langfristig Abgabe von Medikamenten durch häufige Gerinnungs gemachtchronisch implantierten Katheter. Schließlich sind Immunreaktionen häufig.
Diese Probleme können unter Verwendung des Verfahrens von akuten intrathekale Injektion durch eine Nadel in der Abwesenheit eines vorimplantiert Katheter, der einen schnellen und anatomisch begrenzte Anwendung von Medikamenten und Reagenzien zu dem Rückenmark von Mäusen können umgangen werden. Dieses Verfahren die Vorteile der intrathekale Abgabe über andere systemische Lieferwege (z. B. oral, intravenös, intraperitoneal, etc.), wie Spezifität Rücken Modulation, die Dosierungen verringert und Grenze Nebenwirkungen erlaubt, sowie die Fähigkeit zu liefern Stoffe nicht vollständig beibehält normalerweise nicht die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, da während intrathekale Injektion wird die Nadel zwischen der Dura und dem Rückenmark eingesetzt. Wichtig ist jedoch im Vergleich zu anderen Methoden der intrathekalen Lieferung, ist die intrathekale Nadelinjektion die am wenigsten invasive Verfahren, so dass eine Vielzahl von Anwendungen in derelbe Tier, ohne dass eine erhebliche Gewebeschädigung oder Immunreaktion hervorzurufen durch Implantation von Fremdmaterial. Technische Fähigkeiten erfordert jedoch eine sehr genaue Ausrichtung der Nadel, um die Wirksamkeit zu ermöglichen.
Hier haben wir visuell demonstrieren das Verfahren zum Erreichen einer optimalen Erfolgsquote für die speziell auf die Lendenrückenmark. Die Injektionsstelle, die in diesem Experiment gewählt wird, ist die Nut zwischen L5 und L6 wirbel Spalte, in der Nähe, wo das Rückenmark endet, um die Möglichkeit der Beschädigung der Wirbelsäule zu minimieren. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung dieser Technik, um Gene im Rückenmark mit siRNAs niederschlagen.
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Protokoll
Alle Tiernutzung Verfahren waren nach ethischen Leitlinien, die von der lokalen Verwaltungskörper (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Deutschland) festgelegt.
1. Herstellung von siRNA / PEI-Komplex
Die siRNA / PEI-Komplex-Lösung wird mit Herstellers wie folgt hergestellt:
- Lösung A: Man verdünnt die gewünschte Menge der siRNA mit sterilem Wasser (falls erforderlich) bis zu einem Viertel des Endvolumens und verdünnte diese mit weiteren 10% igen Glucoselösung bis zur Hälfte des Endvolumens. Vortex sanft oder mischen durch Pipettieren von oben und unten. Die optimale Menge an siRNA muss empirisch ermittelt werden, aber 1 pg siRNA in 10 ul-Komplex-Lösung pro Tier ist ein guter Ausgangspunkt für die Optimierung.
- Lösung B: Man verdünnt das benötigte Volumen an Reagens PEI mit sterilem Wasser bis zu einem Viertel des Endvolumens und verdünnte diese mit weiteren 10% igen Glucoselösung bis zur Hälfte des Endvolumens. Vortex gently oder mischen durch Pipettieren von oben und unten.
Anmerkung: Die Menge an PEI-Reagenz bestimmt den ionischen Gleichgewicht des Komplexes, der die Effizienz der Transfektion beeinflusst. Ebenso kann die optimale Menge an PEI-Lösung muss empirisch ermittelt werden. In unseren Händen ist die optimale Menge 0,12 ul der PEI-Lösung pro 1 ug siRNA. - Mischen Sie die Lösung A mit Lösung B auf einmal, Wirbel sanft.
- Inkubieren der gemischten Lösung für 15 min bei RT vor der Verwendung. Dieser Komplex ist stabil für 2 h bei RT und 24 h bei 4 ° C.
2. Intrathekale Injektion
- Anesthetize die Maus mit 3% Isofluran, bis es zeigt keine Anzeichen des Stellreflexes. Überprüfen Sie außerdem, für Schwanz und / oder Pfote Prise Reflex, den Zustand der Anästhesie weiter zu gewährleisten.
- Rasur etwa 2 cm 2 Pelz am hinteren Ende des Tieres in der Nähe der Basis des Schwanzes, um eine bessere Visualisierung während Nadeleinführung zu erleichtern.
- Zeigen Maus inein Nasenkonus für eine weiterhin Isofluran Verwaltung während des Verfahrens, reduzieren Sie die Isofluran auf 1,5%, und decken die Augen der Maus mit Augen Gleitmittel.
- Bereiten Sie die bereit sind, siRNA Mischlösung verwenden mit einem 25 ul Hamilton Spritze zu einer 30 G in 0,5 Nadel.
- Suchen Sie den Dornfortsatz des L6, die das prominenteste und fixieren die Wirbel Spalte in dieser Gegend durch leichten Druck sollte.
- Die Nadel zwischen der Nut der L5 und L6 Wirbel vorsichtig und beachten Sie für einen Tail-flick, wie dieses Zeichen weist auf eine erfolgreiche Eintritt der Nadel in der Intraduralraum.
Tipp: Mit dem Fingernagel, sollte man in der Lage, die Nut als auch lokalisieren. - Sobald Tail-flick beobachtet wird, sofort, aber vorsichtig, sichern Sie die Nadelposition mit einer Hand und injizieren das gewünschte Volumen der Substanz mit der anderen Hand langsam.
Tipp: ein Volumen zwischen 5-10 ul optimal als Volumen weniger als 5 &# 181; l ist unzuverlässig und ein Volumen größer als 10 ul führt zu viel Druck. - Nach Injektion durchgeführt wird, bewegen Sie die Maus zurück in den Käfig, um aus der Narkose zu erholen.
- Wiederholen Sie diese Injektion mindestens 2 mal je 24 h zur optimalen Herunterregulation des Zielgens zu erreichen.
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Ergebnisse
Um eine erfolgreiche Injektion zu veranschaulichen, diese Technik durchgeführt, die wir mit Fast Green FCF Farbstoff in der Erwachsenen C57Bl6 Mäuse (8-10 Wochen alt). Das Tier wurde für ein paar Minuten nach der Injektion zu erholen, um genügend Zeit für den Farbstoff verteilt und dann mit einer Überdosis von CO 2 getötet werden. Anschließend wurde das Wirbeltier Spalte seziert und das Rückenmark wurde freigelegt. Die blaue puncta entsprechend der Farbstoff diffundiert, markiert die Injektionsstelle. Keine V...
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Diskussion
Somit ist die oben beschriebene Technik der Nadel intrathekale Injektionen wirksam, schnell, spezifisch lokalisiert und zerstörungsfrei. Technisch gesehen ist der wichtigste Aspekt des Verfahrens der Punkt der Nadeleinführung in die Nut. Es ist entscheidend, dass dieses Verfahren mit einer sehr ruhigen Hand und Geduld getan. Wie viele chirurgische Verfahren, Schulung verbessert die Rate der erfolgreichen Injektion. Dies ist auch deshalb wichtig, weil bei einem tatsächlichen Experiment erfordert diese Technik keine offen...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III Antikörper | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1-Antikörper | R& D Systems | AF5514 | |
| Schneller grüner Farbstoff | Sigma | F-7252 | |
| Isofluran | Baxter | ||
| Isofluran Aufbau | Drä ger Lü beck | ||
| Rasierer | Wella | ||
| Hamilton Spritze Gasdicht 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 Zoll 13 mm Nadel | BD Mikrolanze | 304000 | |
| Mikroskop Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 Forward Primer für qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed Primer für qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referenzen
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
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