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Methodenartikel

Einem Mausmodell der zervikalen Rückenmarksverletzung zu Post-läsionaler Atemneuroplastizität Studieren

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DOI:

10.3791/51235

28. Mai 2014

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Atemversagen ist die häufigste Todesursache nach einer zervikalen Rückenmarksverletzungen. Nachdem eine reproduzierbare, messbare und verlässliche präklinischen Tiermodell der Atemversagen durch eine teilweise zervikalen Verletzungen induziert wird helfen, die Atemwege und des anschließenden nicht-respiratorischen Neuroplastizität zu verstehen und ermöglichen die Prüfung vermeintlichen Reparaturstrategien.

Zusammenfassung

Ein zervikalen Rückenmarksverletzung induziert dauerhafte Lähmung und führt zu Atemnot oft. Bisher wurden keine wirksamen Therapeutika entwickelt worden, um zu verbessern / verbessern die Atemversagen nach hohen zervikalen Rückenmarksverletzung (SCI). Hier schlagen wir eine Maus präklinischen Modell der Hoch SCI am zervikalen 2 (C2) metamere Ebene diverse Post-läsionaler Atemneuroplastizität zu studieren. Die Technik besteht aus einem Operationsteilschäden an der C2-Ebene, die eine Halbseitenlähmung der Membran durch eine Deafferentierung der Zwerchfellmotoneuronen aus den Atemzentren im Hirnstamm induziert wird. Die Gegenseite der Verletzung bleibt erhalten und ermöglicht dem Tier Erholung. Anders als andere Gebiete von gemeinschaftlicher Bedeutung, die die Bewegungsfunktion (bei der Brust-und Lendenbereich) betreffen, wird die Atemfunktion nicht erforderlich Tier Motivation und die Quantifizierung des Defizits / Recovery leicht durchgeführt werden (Membran-und Zwerchfellnerv Aufnahmes, Ganzkörper Lüftung). Diese präklinischen C2 SCI Modell ist ein leistungsfähiges, nützliche und zuverlässige präklinischen Modell, um verschiedene Atem-und nicht-respiratorischen Ereignisse Neuroplastizität auf verschiedenen Ebenen (molekulare Physiologie) zu studieren und diverse vermeintliche therapeutische Strategien, die die Atmung verbessern könnten, testen SCI-Patienten.

Einleitung

Rückenmarksverletzung ist eine häufige Verletzung in der menschlichen Bevölkerung mit dramatischen Vorfälle, wie Dauer Paralyse beobachtet. Die Schwere der Verletzung, hängt jedoch von der Höhe und dem Umfang des anfänglichen Traumas. Atemversagen ist die häufigste Todesursache folgenden oberen zervikalen Rückenmarksverletzung (SCI) ein. Derzeit ist die einzige therapeutische Behandlung des Patienten unter Atemunterstützung zu platzieren. Da nur wenige Patienten von der Atemunterstützung entwöhnt werden 2, durch spontane Erholung, die mit Post-läsionaler Verzögerung auftritt, ist die Notwendigkeit, neue innovative nicht-invasive Therapien entwickeln dringenden 3. Eine gute standardisierte präklinischen Modell, um die Wirkung einer zervikalen SCI auf respiratorische Insuffizienz zu untersuchen und somit die Anwendung der vermeintlichen therapeutischen Strategien zu untersuchen, ist unerlässlich.

In diesem technischen Artikel beschreiben wir einen spezifischen präklinischen Mausmodell of Beeinträchtigung der Atemwege durch eine teilweise Hals-SCI an der C2-Ebene induziert. Dieses Modell wird derzeit von mehreren Labors auf der ganzen Welt verwendet werden (Bewertungen: 4-13). Allerdings können geringe Unterschiede in den chirurgischen Eingriff unter den verschiedenen Forschern beobachtet, dass diese besondere zervikalen Verletzungen Mausmodell zu erzeugen. Die Wirkung einer C2 SCI auf die Atemleistung wurde zuerst 1895 von Porter 14 beschrieben. Ein Hals-Hemisektion induziert eine Deafferentation der Zwerchfellmotoneuronen aus ihrer zentralen Antrieb (in der RVRG im Hirnstamm, 1A befindet) auf der gleichen Seite der Verletzung, die zu einer stillen Zwerchfellnervenaktivität und der anschließenden Membran Lähmung. Die Gegenseite erhalten bleibt und ermöglicht es dem Tier, um zu überleben. Im Gegensatz zu verschiedenen SCI in einem unteren Wirbelsäulensegment (zum Beispiel ein kontusive Verletzungen an C4 Ebene 15) befindet, wird die Integrität des Zwerchfellmotoneuron Kern auf beiden Seiten erhalten. Nach einer cervschen C2 Verletzungen können einige spontane Aktivität auf der ipsilateralen Seite (Zwerchfell und Zwerchfell) aufgrund einer Aktivierung des kontralateralen synaptischen stille Wege, die das Rückenmittellinie auf der Segmentebene C3-C6 (Gekreuzte Wege phrenic, CPP, 1B) gekreuzt beobachtet werden . Die Aktivierung der CPP, das ist per Definition ein C2 Hemisektion, kombiniert mit einer kontralateralen phrenicotomy die eine ipsilaterale Teil Phrenikus Erholung zu induzieren, kann von Stunden bis Wochen nach der Verletzung auftreten, 16-18. Die eigentliche positive Wirkung dieser CPP Weg auf die Atem Erholung ist begrenzt 19 und eine weitere Untersuchung und Behandlung zu entwickeln, um das Ausmaß der spontanen Wiederherstellung 3 zu verbessern.

Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke Art der präklinischen Mausmodell die Atmungs Post-läsionaler Plastizität auf verschiedenen Ebenen zu studieren (Atemphysiologie von der Vor-und Zwerchfellmotoneuronen, Inter, Molekular-und cellular, Fortbewegung der Vordergliedmaße zum Beispiel) sowie ein Modell für invasive und nicht-invasive Therapiestrategien das Ziel, die Atemwege und des Bewegungsapparates Erholung nach C2 Teil zervikalen Rückenmarksverletzungen verbessern zu testen.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Ethik-Ausschuss des RBUCE-UP Stuhl of Excellence (Universität Paris Sud, Finanzhilfevereinbarung Nr. 246556) und der Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines genehmigt.

1. Vorbereitung der sterilisierte chirurgische Instrumente

  1. Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente mit Laborreinigungsmittel.
  2. Autoklaven werden die Instrumente vor der Operation.
  3. In einer chirurgischen Sitzung, die Werkzeuge zu sterilisieren, indem Sie die Tipps in eine heiße Perle Sterilisator für 10 min bei 180 ° C zwischen zwei Operationen.

2. Herstellung von Drogen

  1. Bereiten Sie 2 x 1 ml-Spritzen für Pre-Anästhetika Cocktail und nach der Operation Medikamente.
  2. Entsprechend dem Gewicht der Ratte Herstellung einer Spritze mit vorge Anästhetika: Carprofen (5 mg / kg), Buprenorphin (50 ug / kg), Baytril (5 mg / kg) und Dexmedetomidin (0,5 mg / kg). Füllen Sie das Volumen auf 1 ml mit Ringer-Laktat.
  3. Bereiten Sie imeine andere Spritze die Auflösung für die Pre-Anästhetika: Atipamezol (500 ug / kg).

3. Anästhesie der Ratte

  1. Subkutan verabreichen, um dem Tier die Lösung der in Schritt 2.2 beschrieben vorge Anästhetika. Dann, setzen Sie das Tier im Käfig zurück und warten, bis die sedierende Wirkung erscheint.
  2. Legen Sie die Ratte in eine geschlossene Kammer mit 5% Isofluran in 100% O 2 gefüllt und warten, bis der Atemrhythmus verlangsamt (ca. 30 sec). Entfernen Sie dann die Ratte aus der Kammer und legen Sie sie auf den Tisch Intubation.

4. Orotracheale Intubation

  1. Legen Sie sich das Tier auf dem Rücken, dann sichern Sie den Kopf, indem sie einen Gurt um seine Vorderzähne an den Tisch befestigt.
  2. Mit einem Glasfaser-Licht, leuchten den Brustraum. Legen Sie dann einen Kehlkopfspiegel (oder eine maßgeschneiderte ein, Jou et al. 20 für Details) in das Maul des Tieres. Visualisieren Sie die Stimmbänder.
  3. Geschobene und platzieren Sie eine orotracheale Führung in der Luftröhre (zwischen den Stimmbändern). Schieben Sie die Orotrachealtubus (16 G Kathetergröße) auf der Führungs.
  4. Entfernen der Führung und Überprüfung mit einer Kehlkopfspiegel am Ende der Orotrachealtubus für die Anwesenheit von Feuchtigkeit platziert, Bestätigung der entsprechenden Position der Röhre in die Luftröhre und in die Speiseröhre.
  5. Schließen Sie den Schlauch an einem Nagetier Ventilator (683 Nagetier Ventilator, Harvard Apparatus) und stellen die Konzentration von Isofluran bis 2% (in 100% O 2).
  6. Sichern Sie die Orotrachealtubus mit chirurgischen Band.

5. Wirbelsäulenchirurgie

  1. Legen Sie das Tier in Bauch Dekubitus-Position auf einem beheizten Operationsplatte, mit der Nase, die auf 90 °-Winkel an den Chirurgen. Pflegen Sie die Körpertemperatur um 37,5 ° C in der gesamten Chirurgie.
  2. Rasieren Sie die Haare mit Klipper zwischen den Schulterblättern und entfernen Sie die Haare mit Gaze.
  3. Reinigen Sie die Haut mit betadine, dann mit 70% Alkohol. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
  4. Eine Zehe Prise vor Beginn der Operation durchgeführt, um die ordnungsgemäße Narkosetiefe zu gewährleisten.   Führen Sie dann einen seitlichen Hautschnitt rostro-kaudal mit der Schere zwischen den Schulterblättern.
  5. Schneiden Sie die acromiotrapezius Muskel rostro-kaudal durch folgende Sehne, um Blutungen zu verhindern. Dann distanzieren den Rautenmuskel, um die Muskeln spinalis (rund um die Wirbel) zugreifen.
  6. Fahren Sie den spinalis Muskel von C1 bis C3 Wirbel. Die C2-Wirbels ist das mit einem prominenten apophysis.
  7. Reinigen Sie die Muskulatur rund um den dorsalen Teil der Wirbel mit sterilen Wattestäbchen.
  8. Beginnen Sie vorsichtig mit einer Zange entfernen Sie den Fortsatz des C2. Dann weiter akribisch, bis der dorsalen Rückenmark freiliegt. Stellen Sie sicher, dass Laminektomie ist ein Rücken Hemi Laminektomie. Achten Sie besonders auf die Dauer, die das Rückenmark, und die Arterien in der Nähe von diesem Bereich umschließt.
  9. Mit einem # 55 Pinzetten, sezieren rostro-kaudal die Dura entlang C2, nächste seitlich weiterhin auf jedem rostral und kaudal.
  10. Schwamm den Liquor.
  11. Machen Sie einen seitlichen Schnitt unter der zervikalen Hinterwurzel Nummer 2 mit der Mikroschere. Verifizierung mit einem Mikroskalpell, dass das Ausmaß der Läsion nahe genug ist, um die Mittellinie des Rückenmarks (siehe Fig. 2A eine dorsale Ansicht der Verletzung) zu erreichen. Wenn nicht, dann könnte ein weiterer Schnitt vorgenommen werden, um die Schädigung zu vervollständigen. Im Falle von Blutungen, sterile Wattestäbchen. Achten Sie darauf, nicht auf die Gegenseite zu gehen, sonst wird das Tier nicht von der Verletzung erholen und wird ein Atemversagen haben.
  12. Nähen Sie die Muskeln als Schutzschicht und vernähen wieder die Haut. Reinigen Sie die Wunde mit steriler Gaze Betadine gesättigt.
  13. Schalten Sie die Isofluran-Verdampfer und injizieren die Umkehrung Medikamente (Atipamezol [500 ug / kg, im]), überprüfen Sie die Körpertemperatur.
  14. Wenn das Tier beginnt, gegen den Ventilator atmen,trennen Sie den Trachealtubus vom Beatmungsgerät, und nehmen Sie die Orotrachealtubus. Legen Sie das Tier in einem beheizten Käfig für die Verwertung.

6. Post-chirurgische Versorgung

Nach der Operation werden die Tiere kontinuierlich überwacht, um die beste Umgebung für die Wiederherstellung möglich zu gewährleisten. Antibiotika (Baytril, 5 mg / kg), entzündungshemmende (Carprofen, 5 mg / kg) und Buprenorphin (50 ug / kg) Arzneimittel alle 12 h für die ersten 2 Tage nach der Operation, um Infektionen zu verhindern, und reduziert das Auftreten gegeben von postoperativen Schmerzen. Ratten haben Zugriff ad libitum zu weiche Nahrung und Wasser (oder geliert Wasser für die ersten postoperativen Tag). Subkutanen Flüssigkeiten können verwendet werden, um Austrocknung zu der ersten Tage nach der Operation zu verhindern. Das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme werden täglich überwacht. Ihre Umgebung wird während des Experiments und die Zeit nach der Verletzung (Dual-Gehäuse, Schläuche in ihren Käfigen) bereichert.

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Ergebnisse

Ausmaß der Verletzung

Der Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser besonderen experimentellen Modell sind abhängig von der Erfahrung jedes Manipulator / Chirurgen. Die anschließende Höhe von Atemwiederherstellung (Zwerchfellnervenaktivität und Membranaktivität) nach einer Verletzung C2 korreliert mit der Rest ventrolateralen verschont weißen Substanz 21. Da die Verletzung ist "handmade" und erfordert einige Übung von dem Chirurgen, der Umfang der einzeln...

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Diskussion

Technische Schwierigkeiten bei der Herstellung der C2 Verletzungsmodell

Die C2-Verletzung Mausmodell ist ein interessantes Tool, um Atem Post-läsionaler Neuroplastizität zu studieren. Allerdings sind die notwendigen Schritte, um eine reproduzierbare und zuverlässige Modell produzieren zahlreiche und jeder über die Ergebnisse der Studie beeinflussen können. Zum Beispiel während der Intubation Verfahren ist extrem darauf geachtet werden, da die Orotrachealtubus können eine Ent...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wird mit Mitteln aus der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 246556 (europäische Projekt RBUCE-UP) unterstützt, HandiMedEx zugeteilt von der Französisch Öffentliche Investment Board. Marcel Bonay wurde von der Chancellerie des Universités de Paris (Beine Poix), dem Fonds de Recherche en Santé Dotation Respiratoire, und dem Centre d'Assistance Respiratoire à Domicile d'Île de France (CARDIF) unterstützt

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Materialien

Drugs
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Animal
Männliche Sprague Dawley RatteJanvier225-250 g
Chirurgische Instrumente
Student Dumont #5 PinzetteFine Science Tool91150-20
Student Standard Pattern PinzetteFine Science Tool91100-12
Mayo-Stille SchereFine Science Tool14013-15Gebogene
Vannas FederschereFine Science Tool91500-09Gerade
Federschere - 8 mm KlingenFine Science Tool15025-10Gerade Blunt/Blunt
Friedman Pearson RongeurFine Science Tool16121-14Gebogenes
Präpariermesser - Fine ScienceToolmit feiner Spitze10055-12Gerader
Olsen-Hegar NadelhalterFine Science Tool12002-14Gezackter
Weitlaner-Locktite RetraktorFine Science Tool17012-112x3 Blunt
Resorbierbares chirurgisches NahtmaterialCentravetBYO001Nahtgröße 4-0
Ausrüstung
HeißperlensterilisatorFine Science Werkzeug18000-45
Katheter CentravetCAT18816 G
Laryngoskop
Führungsdraht
KehlkopfspiegelCentravetMIR011
Laktated RingersCentravetRIN020
SpritzeCentravet
NadelCentravet
O2Air Liquid I1001M20R2A001
683 RodentT Ventilator 115/230VHarvard Apparat55-0000
Stand-Alone VaporizerWPIEZ-155
Dünnleitungs-HeizbettWPIEZ-211
LuftkanisterWPIEZ-258<
CarprofenCentravet
RimadylCentravetRIM011
BuprenorphinCentravetBUP001
BaytrilCentravetBAY001
DexmedetomidinCentravetDEX010
AtipamezolCentravetANT201
Betadine LösungCentravetVET002
IsofluranCentravetVET066
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Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Phrenikusaktivit tZwerchfellhemiparalyseVerletzung des 2 Halswirbelk rpers C2chirurgische HemilaminektomieVerwendung von Nagetier Ventilatorenhistologische TechnikenNerven Muskel Ableitungengekreuzter Phrenikusweg