Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Geregelte endozytischen Handel ist der zentrale Mechanismus erleichtert eine Vielzahl von neuromodulatorischen Veranstaltungen, die von dynamischen Steuerung Rezeptor-Ionenkanal und Transporter Zelloberfläche Präsentation auf einem Minuten-Zeitskala. Es gibt eine breite Vielfalt von Mechanismen, die endozytischen Handel einzelner Proteine steuern. Studien zur Untersuchung der molekularen Grundlagen von Menschenhandel wurden in erster Linie auf die Oberfläche Biotinylierung verlassen, um quantitativ Veränderungen in der Membranproteinoberfläche messen Ausdruck als Reaktion auf exogene Reize und Gen-Manipulation. Allerdings wurde dieser Ansatz vor allem auf kultivierten Zellen, die nicht treu die physiologisch relevanten Mechanismen im Spiel bei erwachsenen Neuronen spiegeln kann begrenzt. Darüber hinaus kann kultivierten Zell Ansätze regionsspezifische Unterschiede in Handel Mechanismen unterschätzen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der Zelloberfläche Biotinylierung der akuten Hirnschnittpräparat erstreckt. Wirzeigen, dass diese Methode bietet eine High-Fidelity-Ansatz zur schnellen Veränderungen in der Membranproteinoberfläche Ebenen bei erwachsenen Nervenzellen messen. Dieser Ansatz dürfte eine breite Dienstprogramm auf dem Gebiet der neuronalen endozytischen Handel zu haben.
Einleitung
Endozytischen Handel ist ein allgegenwärtiges zellulären Mechanismus, der die Feinabstimmung des Plasmamembran Präsentation einer Vielzahl von integralen Membranproteinen. Endozytose liefert lebenswichtige Nährstoffe, um die intrazelluläre Milieu 1 und desensibilisiert-Rezeptor-Signal als Reaktion auf 2-Rezeptor-Aktivierung. Endocytotischen Recycling zurück in die Plasmamembran erhöhen zusätzlich zelluläre Signalgebung durch Erhöhung der Proteinexpressionsniveaus an der Zelloberfläche 3. Darüber hinaus sind Membrantransport Störungen in zahlreichen Krankheiten und pathologischen Bedingungen 4,5 verwickelt, und betonte die N....
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Protokoll
Alle Tierbehandlung und Gewebe Ernte wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) durchgeführt, nach dem genehmigten Protokoll # A1506 (Melikian, PI).
Benötigte Lösungen
Künstliche Liquor (ACSF) - Machen Sie täglich frisch
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose
Hinweis: Bereiten ACSF als 10....
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Ergebnisse
Die neuronale Dopamintransporter wird in Reaktion auf PKC-Aktivierung in Zelllinien 16-20 internalisiert. Obwohl viele Berichte zeigen PKC-induzierte DAT Oberflächenverluste in einer Vielzahl von Zelllinien und Expressionssystemen ist es schwierig gewesen, diese Feststellung in kultivierten dopaminergen Neuronen 21-23 bestätigen. Wir verwendeten Maus Striatum Scheiben direkt zu testen, ob DAT verinnerlicht als Reaktion auf PKC-Aktivierung in der Erwachsenen dopaminergen Neuronen. Folgende Schnittpr.......
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Diskussion
Trotz langjährige Wissen, dass endozytischen Handel kritisch Auswirkungen synaptischen Signal im Gehirn, hat es schwierig, quantitativ Veränderungen in der Proteinoberflächen-Expression in adulten Neuronen messen bewährt. In dieser Arbeit, einen zuverlässigen Ansatz zur Oberflächenprotein ex vivo in akuten Hirnschnitten beschriften berichten wir. Hirnschnittpräparate haben eine langjährige Geschichte der Nutzen für elektrophysiologischen Ableitungen, wie sie synaptischen Verbindungen und die Lebensfähigkeit der.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen, dass Konflikte mit dieser Arbeit.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DA15169 und DA035224 zu HEM finanziert
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Sulfo NHS-SS-Biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin Agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-freies, Proteasefreies Rinderserumalbumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrierender Mikrotom-Schnitter | diverse | ||
| Schüttelwasserbad | diverse | ||
| Millicell Mesh-Bodeneinsätze (8 & Mikro; m Porengröße) | Millipore | PI8P 012 50 | Diese können von Hand gewaschen und wiederverwendet werden |
Referenzen
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
