Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Geregelte endozytischen Handel ist der zentrale Mechanismus erleichtert eine Vielzahl von neuromodulatorischen Veranstaltungen, die von dynamischen Steuerung Rezeptor-Ionenkanal und Transporter Zelloberfläche Präsentation auf einem Minuten-Zeitskala. Es gibt eine breite Vielfalt von Mechanismen, die endozytischen Handel einzelner Proteine steuern. Studien zur Untersuchung der molekularen Grundlagen von Menschenhandel wurden in erster Linie auf die Oberfläche Biotinylierung verlassen, um quantitativ Veränderungen in der Membranproteinoberfläche messen Ausdruck als Reaktion auf exogene Reize und Gen-Manipulation. Allerdings wurde dieser Ansatz vor allem auf kultivierten Zellen, die nicht treu die physiologisch relevanten Mechanismen im Spiel bei erwachsenen Neuronen spiegeln kann begrenzt. Darüber hinaus kann kultivierten Zell Ansätze regionsspezifische Unterschiede in Handel Mechanismen unterschätzen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der Zelloberfläche Biotinylierung der akuten Hirnschnittpräparat erstreckt. Wirzeigen, dass diese Methode bietet eine High-Fidelity-Ansatz zur schnellen Veränderungen in der Membranproteinoberfläche Ebenen bei erwachsenen Nervenzellen messen. Dieser Ansatz dürfte eine breite Dienstprogramm auf dem Gebiet der neuronalen endozytischen Handel zu haben.
Einleitung
Endozytischen Handel ist ein allgegenwärtiges zellulären Mechanismus, der die Feinabstimmung des Plasmamembran Präsentation einer Vielzahl von integralen Membranproteinen. Endozytose liefert lebenswichtige Nährstoffe, um die intrazelluläre Milieu 1 und desensibilisiert-Rezeptor-Signal als Reaktion auf 2-Rezeptor-Aktivierung. Endocytotischen Recycling zurück in die Plasmamembran erhöhen zusätzlich zelluläre Signalgebung durch Erhöhung der Proteinexpressionsniveaus an der Zelloberfläche 3. Darüber hinaus sind Membrantransport Störungen in zahlreichen Krankheiten und pathologischen Bedingungen 4,5 verwickelt, und betonte die Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen, die Protein endozytischen Handel regieren zu untersuchen. Während viele Proteine nutzen klassische Clathrin-abhängigen Internalisierung Mechanismen, Anzeichen dafür in den vergangenen Jahren zeigt, dass mehrere Clathrin-unabhängige Mechanismen endozytischen regeln die endozytischen Potential einer wachsenden Palette vonProteine 6,7. So hat die Notwendigkeit, endozytischen Mechanismen für Menschenhandel in physiologisch relevanten Systemen zu untersuchen stark gewachsen.
Im Gehirn hat endozytischen Handel von Rezeptoren, Ionenkanäle und Neurotransmitter-Transporter eine primäre Rolle bei der Gründung der synaptischen Plastizität 8-11 und der Reaktion auf Drogen 12-15, letztlich Auswirkungen auf die neuronale Erregbarkeit und synaptischen Antworten. Bis heute hat die Mehrheit der neuronalen Handel Studien entweder heterologen Expressionssystemen oder kultivierten primären Nervenzellen verlassen können, von denen weder zuverlässig reflektieren Mechanismen eine Rolle spielen bei erwachsenen Neuronen. Hier ein Ansatz, der Biotinylierung Oberfläche verwendet, um quantitativ Oberflächenproteinspiegel in akuten Hirnschnitten von erwachsenen Nagern abgeleitet messen berichten wir. Mit diesem Ansatz können Daten, die zeigen, dass die Maus striatale Dopamin-Transporter schnell verinnerlicht in re präsentieren wirReaktion auf Phorbolester-vermittelte Protein-Kinase C (PKC).
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Protokoll
Alle Tierbehandlung und Gewebe Ernte wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) durchgeführt, nach dem genehmigten Protokoll # A1506 (Melikian, PI).
Benötigte Lösungen
Künstliche Liquor (ACSF) - Machen Sie täglich frisch
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose
Hinweis: Bereiten ACSF als 10x Stammlösung, ohne NaHCO 3 und Glucose. Machen 1x Arbeitslösungen täglich aus dem 10fach, in Ergänzung mit frischen NaHCO 3 und Glucose.
Saccharose-ergänzt ACSF (SACSF) - Stellen täglich frisch
250 mM ErfolgRose, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose
Hinweis: Bereiten SACSF als 10x Stammlösung, ohne NaHCO 3 und Glucose. Machen 1x Arbeitslösungen täglich aus dem 10fach, in Ergänzung mit frischen NaHCO 3 und Glucose.
Sulfo-N-Hydroxysuccinyl-SS-Biotin (Sulfo-NHS-SS-Biotin, Pierce Chemical Company)
Auf Lösungen sollten 200 mg / ml in DMSO und sind resistent gegen mehrere Einfrieren / Auftauen. Aliquots werden bei -20 ° C gelagert Die Succinylester schnell in wässriger Lösung hydrolysiert, so Arbeits Lösungen sollten unmittelbar vor dem Aufbringen auf Scheiben hergestellt werden.
Scheibe Quench-Lösung
ACSF mit 100 mM Glycin supplementiert
RIPA Lyse Buffer
10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na-Desoxycholat
RIPA mit Protease-Inhibitoren (RIPA / PI) - Machen Sie täglich frisch
RIPA ergänzt mit 1 &mgr; M Leupeptin, 1 &mgr; M Pepstatin, 1 &mgr; M Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid.
1. Bereiten Hirnschnitten
- Stellen Sie frische 1x SACSF und 1x ACSF
- Chill-SACSF auf Eis in einem kleinen Becherglas. Dies wird verwendet, um die frisch geernteten Gehirn der Maus zu halten.
- Tränken Sie das ACSF und SACSF mit Sauerstoff durch Blasenbildung mit 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 min auf Eis.
- P30-38-Mäuse sollten für eine optimale Gewebelebensfähigkeit verwendet werden. Sacrifice Tiere durch Genickbruch und Enthauptung, und das Gehirn wird rasch zu entfernen, in vorgekühlte, sauerstoff SACSF.
- Mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotom, stellen 300 um Gehirnschnitte in der Region von Interesse.
- Falls gewünscht, können weitere Scheiben vor der Verwertung zerlegt werden, um für bestimmte Hirnregionen oder separaten rechten und linken Hemisphäre als Kontroll-und Versuchsscheiben zu verwenden, bzw. zu bereichern.
- Mit einem feuerpolierten Pasteur Pipette Scheiben Kammern in 24-Well-Platten gesetzt Boden eingreifen.
- Lassen Scheiben für 40 min in Sauerstoff angereichert ACSF erholen, 31 ° C, mit ständigen, sanfte Blubbern.
2. Drug Treatment (falls zutreffend) und Scheibe Biotinylierung
- Nach der Erholung, waschen Scheiben 3x in vorgewärmten (37 ° C), sauerstoff ACSF sprudelnden ständig mit 95% / 5% O 2 / CO 2.
- In Testverbindungen und Inkubation mit kontinuierlicher Sauerstoffversorgung.
- Für die Bequemlichkeit, einen 1/10 Volumen 10x konzentrierter Droge, und mischen durch vorsichtiges Umdrehen.
- Schütteln Platten vorsichtig in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur.
- Nach der medikamentösen Behandlung, schnellChill-Scheiben durch Waschen 3x in eiskalter ACSF.
3. Biotinylieren Oberflächenproteine
- Planen 1,0 mg / ml Sulfo-NHS-SS-Biotin in eiskaltem ACSF unmittelbar vor der Etikettierung.
- In 0,75 ml Sulfo-NHS-SS-Biotin an Scheiben Scheiben und Inkubation auf Eis, 45 min.
- Dreimal waschen Scheiben schnell mit eiskaltem ACSF, dann Inkubation für 10 min in eiskaltem ACSF auf Eis.
- Scheiben waschen dreimal mit eiskaltem Scheibe Quenchpuffer und Inkubation mit 0,75 ml Scheibe Quenchpuffer zwei Mal, 25 min, auf Eis, freie Sulfo-NHS-SS-Biotin zu stillen.
4. Bereiten Gewebelysaten
- Dreimal waschen Scheiben in eiskalter ACSF und übertragen jede Scheibe zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer feuerpolierten Pasteurpipette.
- Pellet vorsichtig Scheibe durch Zentrifugation 200 g, 1 min und sorgfältig absaugen restlichen ACSF.
- In 400 ul eiskaltem RIPA / PI und brechen Gewebe durch Auf-und Abpipettieren einmal durch eine P200 pipette.
- Über dissoziiert Slice / RIPA in ein frisches Röhrchen und Inkubation 30 min, 4 ° C, Drehen, um die Lyse zu vervollständigen.
- Pelletierung von Zelltrümmern durch Zentrifugation, 18.000 x g, 15 min, 4 ° C
- Proteinkonzentrationen bestimmen Lysat unter Verwendung des BCA-Proteinassay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.
5. Isolieren biotinylierter Proteine
- Optimieren Bead / Gesamtprotein-Verhältnis.
Hinweis: Einzelne Proteinexpressionsniveaus kann weit in den verschiedenen Hirnregionen unterschiedlich. Wenn nicht alle der biotinylierten Proteinen in einer gegebenen Menge von Gewebelysat erfasst, ist es nicht möglich, alle möglichen Veränderungen in der Oberflächenexpression genau zu erfassen. Daher ist es zwingend notwendig, um empirisch bestimmen die optimale Perlen / Gesamtproteinverhältnis für ein bestimmtes Protein / Hirnregion vor der Einschiffung auf eine neue Scheibe Biotinylierung Studie.- Inkubation 25 ul Streptavidin-Agarose-Beads mit zunehmender Menges Gewebelysat (ungefähren Bereich von 25 bis 200 ug) und dann gehen Sie wie folgt für die Bindung, Waschen und Elution Schritten beschrieben.
- Quantifizierung der resultierenden immunreaktiven Banden und wählen Sie eine Perle / Lysat-Verhältnis im linearen Bereich der Bindung, die genaue Quantifizierung von entweder erhöht oder verringert Protein-Oberflächenexpression ermöglichen.
- Bereiten Streptavidin-Agarose Beads
- Bestimmen Sie die Gesamt Wulst Volumen für alle Proben notwendig. Eine ausreichende Schweißnahtvolumen für diesen Betrag plus ein zusätzliches (dh 4 Proben bei 25 ul / Probe = 100 ul Perlen + ein extra = 125 ul Perlen.
- Vortex Streptavidin Wulst Lager und Pipette heraus gewünschte Lautstärke. Bei Verwendung eines P200 Pipette, schneiden Sie das Ende der Spitze zu einer Verstopfung oder Wulst Schäden zu verhindern.
- Waschen Sie Perlen 3-mal in 0,5 bis 1,0 ml RIPA / PI Konservierungsmittel, Verwirbelung nach jedem RIPA hinaus und sammeln Perlen zwischen den Waschgängen durch Zentrifugation 18.000 xg, 1 min zu entfernen, bei Raumtemperaturratur.
- Absaugen Puffer zwischen den Waschgängen mit einem Glas-Pasteur-Pipette auf eine Vakuumflasche angebracht. Ein Kunststoff-P200 Spitze bis zum Ende der Glaspasteurpipette befestigt bietet feinere Kontrolle beim Ansaugen. Es ist nicht unbedingt notwendig, alle Puffer für die ersten zwei Waschungen entfernen, da es Risiken Ansaugen Kügelchen in die Pipette. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen, so viel überschüssigen Puffer wie möglich ohne Absaugen der Perlen.
- In RIPA / PI, um Perlen wieder in ihre ursprüngliche Volumen zu bringen, und Abpipettieren zu resuspendieren. Vermeiden Verwirbelung an dieser Stelle, als Perlen werden an der Rohrwand haften.
- Aliquot Perlen in Mikrozentrifugenröhrchen mit einem P200 mit der Spitze abgeschnitten. Pipette nach oben und unten mehrmals zwischen der Probenahme zu gewährleisten, Perlen bleiben gleichmäßig suspendiert und unter den Röhrchen verteilt.
- Bind biotinylierten Proteine Streptavidin-Perlen
- Verteilen Zelllysate auf die Rohre, die die Agarose-Perlen. Für Experimente whe re mehrere Proben verglichen werden, stellen Sie sicher, um die gleiche Menge an Protein für jede Probe für genaue Vergleiche zu verwenden.
- Fügen Sie zusätzliche RIPA / PI, um Proben zu einem minimalen Volumen 200 ul zu bringen. Dies gewährleistet, dass die Proben während der Inkubation ausreichend zu mischen und auch vereinheitlicht die Proteinkonzentrationen in Proben.
- Die Röhrchen in ein Rohr Rotator und über Nacht mischen bei 4 ° C
- In getrennten Röhrchen, verzichtet werden ein Äquivalent des gesamten Lysats Volumen für jede Probe verwendet. Alternativ, wenn die Probenmengen hoch sind, ein Bruchteil des gesamten Lysats Volumen anstelle reserviert werden, um die maximale Ladevolumen auf SDS-PAGE-Gelen unterzubringen. Diese werden verwendet, um die Oberflächenexpression auf die Gesamtproteinmenge zu normalisieren.
- Fügen Sie entweder das gleiche Volumen 2x oder 1/5 Vol. 6x SDS-PAGE-Probenpuffer und Inkubation entweder bei 4 ° C, parallel zu Wulst Proben oder bei -20 ° C bis Proben analysiert.
- Beads durch Zentrifugation pelle 18.000 × g, 2 min bei Raumtemperatur.
- Überstand wird abgesaugt und Waschperlen dreimal mit 0,75 ml RIPA. Um Wulst Verlust zu minimieren, lassen einen kleinen Kopf Volumen Puffer oben Perlen zwischen Wäschen. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen, so viel wie möglich RIPA, ohne dass der Wulst Pellets.
- Eluiere biotinylierten Proteine aus Streptavidin-Kügelchen durch die Reduzierung der Disulfidbrücke. In 25 ul 2x SDS-PAGE-Probenpuffer reduziert, Vortex gut und drehen Proben 30 min, Raumtemperatur.
Anmerkung: Viele Membranproteine haben eine hohe Tendenz zu aggregieren, wenn sie in SDS-PAGE-Probenpuffer gekocht, deren elektrophoretische Mobilität stark beeinträchtigen. Wenn dies der Fall für das Protein untersucht wird, zu vermeiden Erhitzen von Proben und stattdessen eluieren bei Raumtemperatur langsam. Wenn kochendem absolut notwendig ist (zB wenn ein anderes Protein parallel beurteilt erfordert Sieden), samplE-Puffer mit 2 M Harnstoff (Endkonzentration) ergänzt werden, um die Aggregation zu minimieren. Während bei der Verringerung Aggregation in einigen Fällen Harnstoff oft Kompromisse Band Auftritte. - Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot.
- Auftauen Gesamt Lysatproben und drehen parallel Wulst Proben, 30 min, Raumtemperatur.
- Getrennte Proteine auf SDS-PAGE-Gelen.
- Identifizieren Protein (e) von Interesse durch Immunoblotting.
- Seien Sie sicher, dass die Bänder im linearen Bereich der Detektion für die richtige Quantifizierung detektiert.
- Um sicherzustellen, daß das Biotinylierungsreagenz hat keinen Zugang zu intrazellulären Proteinen durch beschädigte / gefährdeten Zellen gewonnen. Dies wird am besten durch Immunoblotting parallel zu einem intrazellulären Protein spezifisch für den Zelltyp untersucht erreicht.
- Quantifizieren Band Dichten und berechnen relative Proteinoberflächendichte in Prozent des Gesamtproteinexpressionsniveau.
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Ergebnisse
Die neuronale Dopamintransporter wird in Reaktion auf PKC-Aktivierung in Zelllinien 16-20 internalisiert. Obwohl viele Berichte zeigen PKC-induzierte DAT Oberflächenverluste in einer Vielzahl von Zelllinien und Expressionssystemen ist es schwierig gewesen, diese Feststellung in kultivierten dopaminergen Neuronen 21-23 bestätigen. Wir verwendeten Maus Striatum Scheiben direkt zu testen, ob DAT verinnerlicht als Reaktion auf PKC-Aktivierung in der Erwachsenen dopaminergen Neuronen. Folgende Schnittpr...
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Diskussion
Trotz langjährige Wissen, dass endozytischen Handel kritisch Auswirkungen synaptischen Signal im Gehirn, hat es schwierig, quantitativ Veränderungen in der Proteinoberflächen-Expression in adulten Neuronen messen bewährt. In dieser Arbeit, einen zuverlässigen Ansatz zur Oberflächenprotein ex vivo in akuten Hirnschnitten beschriften berichten wir. Hirnschnittpräparate haben eine langjährige Geschichte der Nutzen für elektrophysiologischen Ableitungen, wie sie synaptischen Verbindungen und die Lebensfähigkeit der...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen, dass Konflikte mit dieser Arbeit.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DA15169 und DA035224 zu HEM finanziert
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Sulfo NHS-SS-Biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin Agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-freies, Proteasefreies Rinderserumalbumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrierender Mikrotom-Schnitter | diverse | ||
| Schüttelwasserbad | diverse | ||
| Millicell Mesh-Bodeneinsätze (8 & Mikro; m Porengröße) | Millipore | PI8P 012 50 | Diese können von Hand gewaschen und wiederverwendet werden |
Referenzen
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