Methodenartikel

Der Nachweis eines multiresistenten Mycobacterium tuberculosis Verstärkung Microarray

DOI:

10.3791/51256

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25. April 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Akonni Biosystems, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Verstärkungsmikroarray kombiniert asymmetrischen PCR-Amplifikation und Mikroarray-Hybridisierung in einer einzigen Kammer, die Mikroarray-Arbeitsprozess deutlich vereinfacht für den Endbenutzer. Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann.

Zusammenfassung

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Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von MDR-TB-Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann. Ein Verstärkungsmicroarray kombiniert asymmetrische PCR-Amplifikation Zielgrößenauswahl, Zielkennzeichnung, und Microarray-Hybridisierung in einer einzigen Lösung und in einem einzigen mikrofluidischen Kammer. Eine Batch-Verarbeitungsverfahren ist mit einem 9-plex asymmetrische Master-Mix und Low-Density-Gel Element Microarray zur Genotypisierung multiresistenter Mycobacterium-Tuberkulose (MDR-TB) demonstriert. Das hier beschriebene Protokoll kann in 6 Stunden abgeschlossen sein und korrekte Genotypisierung mit mindestens 1000 Zelläquivalente von genomischer DNA. Mit On-Chip Waschschritten durchführbar ist, die in einer völlig geschlossenen Amplikon Verfahren und System führt. Das Ausmaß der mit einer Multiplex-Amplifikation Mikroarray wird schließlich durch die Anzahl der Primerpaare, die in einem einzigen Master-m kombiniert werden können, eingeschränktix und trotzdem die gewünschte Empfindlichkeit und Spezifität Leistungsmetriken, anstatt die Anzahl von Sonden, die auf dem Array immobilisiert sind. Ebenso kann die Gesamtanalysezeit verkürzt oder verlängert werden, je nach dem speziellen Verwendungszweck Fragestellung und gewünschte Nachweisgrenze. Dennoch ist die allgemeine Vorgehensweise deutlich Microarray-Workflow optimiert für den Endanwender, indem die Anzahl der manuell intensive und zeitaufwendige Verarbeitungsschritte und bietet eine vereinfachte biochemischen und Mikrofluidik-Pfad für die Übersetzung von Microarray-basierte Diagnostik in der klinischen Routine.

Einleitung

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Frühe Erkennung und Fall schnelle Behandlung gelten als die wirksamsten Kontrollstrategien zur Mycobacterium tuberculosis (MTB) Getriebe 1 zu reduzieren, und es gibt jetzt einen breiten Konsens in der TB-Community, die ein Point of Care (POC) oder in der Nähe von POC-Test, um gleichzeitig zu diagnostizieren TB und Arzneimittelresistenz (DR) benötigt. Technologien wie Cepheid Genexpert und andere Nukleinsäure-Amplifikation Tests reduzieren die Zeit bis zur Diagnose für viele TB-Patienten und bieten eine schnelle Auslesen der angibt, Resistenz gegen Rifampicin oder ausgewählte Mutationen eine Resistenz gegen andere erste oder zweite Linie 2 Drogen. Obwohl Echtzeit-und isothermen Nucleinsäureamplifikation Tests sind für die Medikamentenresistenz Mutationen, die zu MDR-TB führen, zu identifizieren, ist das Spektrum der Mutationen erkennen sie oft nicht ausreichend, um eine individuelle medikamentöse Behandlung, die der Arzneimittel-Resistenz-Profil des Patienten zu gestalten, und technische Zwänge im Zusammenhangum optisches Übersprechen oder die Komplexität der chemischen Verstärkung und Berichts Mai 3-7 die Anzahl der Loci oder Mutationen, die erfasst werden, zu begrenzen. So sind Detektionstechnologien mit höherer Kapazität erforderlich, um Multiplexing bekannt Lücken im MDR-TB POC Diagnostik zu adressieren.

Microarrays und die WHO-endorsed Hain Linie Sondentests können die "multiple Gen, mehrere Mutationen" Herausforderung der Diagnose von MDR-TB 8-29 ehen. Leider sind diese Hybridisierung-basierte Multiplex-Detektionsplattformen verwenden mehrstufigen, kompliziert und Open-Amplikon Protokolle, die eine umfassende Ausbildung und Kenntnisse in molekularen Techniken erfordern. Die Verstärkung Microarray-30 wurde entwickelt, um einige dieser Microarray-Work-Flow und Betriebs Anliegen anzusprechen. Die Vereinfachung fluidischen Grundsätze sind zu ergänzen, zu hybridisieren und erkennen Nukleinsäure-Targets in einem einzigen mikrofluidischen Kammer. Der Benutzer stellt die Nukleinsäure-Amplifikation und master mischen in einem fluidischen Kammer mit einer Pipette und startet den Temperaturwechsel-Protokoll. Für die hier gezeigte Stapelverarbeitung Verfahren werden Mikroarrays anschließend in Lösung gewaschen, getrocknet und abgebildet. Diese Studie veranschaulicht die Funktionalität von einem Verstärkungsmikroarray unter Verwendung eines MDR-TB Microarray-Test rpoB (30 Mutationen) katG (2 Mutationen), inhA (4 Mutationen), rpsL (2 Mutationen), embB (1-Mutation), IS1245, IS6110 und eine interne Verstärkung und Hybridisierungskontrolle. Mindestens ein angepaßtes Paar von Mikroarray-Sonden (Wildtyp (WT) und Single-Nukleotid-Mutante (MU)) für jede Mutation von Interesse enthalten. Gereinigte Nukleinsäuren von multiresistenter M. Tuberkulose sind von der TDR-Tuberkulose-Stamm Bank-31. Gel-Element-Microarrays auf Glassubstraten durch Copolymerisation im Wesentlichen hergestellt wie an anderer Stelle 32, mit der Ausnahme, dass wir 4% Monomer und 0,05 mM jede Sonde in der polymerization Mischung. Arrays werden mit einem 50-ml-Dichtung vor der Verwendung umgeben. Nach dem thermischen Zyklus, Hybridisierung und die Waschschritte werden Amplifikation Mikroarrays auf ein tragbares Analyse Akonni abgebildet. Hintergrund-korrigiert, integrierte Signalintensitäten von der rohen erhalten. Tif Bilder mit einem festen Kreis-Algorithmus. Lärm für jedes Gel Element als das Dreifache der Standardabweichung der lokalen Stelle Hintergründe berechnet. Gen-Targets werden in der Regel als nachweisbar Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)-Werte ≥ 3. Um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Mutation in jedem Gen oder Codon zu bestimmen, wird eine Diskriminanzanalyse Verhältnis aus den SNR-Werte als (WT-MU) / (WT + MU) berechnet. Diskriminanzanalyse Verhältnisse <0 deuten auf eine Medikamentenresistenz Mutation an der Stelle, während die Verhältnisse> 0 sind bezeichnend für die Wildtyp-Sequenz.

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Protokoll

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Für Labore, die universelle PCR-Anweisungen nicht befolgen, ist es operativ effizienter, mehrere Verstärkung Microarrays und Dichtungen pro Substrat enthalten und waschen für alle Verstärkungsmicroarrays gleichzeitig in einem Großbehälter, wie hier beschrieben. Verbrauchsmaterialformate sind für die Durchführung nach der Amplifikation Microarray-Waschschritte in einem völlig abgedichtet, geschlossene Amplikon-Test zur Verfügung, wie an anderer Stelle berichtet, 30,33.

1. Setup-

  1. Extrahieren und zu reinigen Nukleinsäuren aus der Probe unter geeigneten Bedingungen die biologische Sicherheit mit einer Methode der Wahl. Voraussetzung ist, dass Nukleinsäuren ausreichender Reinheit für die asymmetrische, Multiplex-PCR-Amplifikation.
  2. Bereiten Arbeitsbereich durch Abwischen Oberflächen und Geräte mit Dekontaminierung Lösungen.
  3. Zeigen Amplifikationsreagenzien auf Eis oder kalten Block.
  4. Beschriften Sie eine sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für die Verstärkung Master-Mix, und kennzeichnen eine sterile 0,2-ml-Mikro tuwerden für jede Probe.
  5. Nach Reagenzien werden aufgetaut, kurz Wirbel und sammeln Inhalt auf den Boden des Röhrchens mit einem puls Spin in einer Minizentrifuge. Vortexen nicht Taq-Polymerase. Flick vorsichtig das Rohr zu mischen und folgen mit einem Impuls-Spin-in Mini-Zentrifuge.
  6. Bereiten Sie eine Verstärkung Master-Mix mit den pro-Probenreaktion in Tabelle 1 dargestellt Bände. Um mögliche Ungenauigkeiten Pipettieren Konto, bereiten mindestens eine weitere Reaktionsvolumen als die Gesamtzahl der Proben verarbeitet werden. Beachten Sie, dass die Master-Mix enthält zusätzliche Taq-Polymerase, die über das, was mit der Muliplex-PCR-Puffer vorgesehen ist. Fügen Sie nur die Verstärkung / Hemmung Steuerung an den Master-Mix, nachdem alle anderen Reagenzien kombiniert werden, und die Aktien Reagenzröhrchen den Speicher zurück.
Reagens Per-Probenvolumen (ul) Finale []
Mulitplex-PCR-Puffer mit HotStar Taq Plus- 25 1x
Rinderserumalbumin (BSA) 0,55 0,6 mg / ml
Formamid 3.8 7,6%
Zusätzliche Taq-Polymerase 0,8 Einheiten / ul (4 Einheiten insgesamt)
MDR-TB-Primer-Gemisch 15,75 -
RNase-freie H 2 O 2.1 -
Verstärkung / Hemmung Steuer 1 5,0 fg / ul
Gesamt 49

Tabelle 1. MDR-TB Verstärkung Microarray-Master-Mix-Zusammensetzung.

  1. Wirbel die Master-Mix und sammeln Inhalt auf den Boden des Röhrchens mit einem Impuls-Spin in einer Minizentrifuge.
  2. Kombinieren Sie 49 ul des Master-Mix und 1 ul von M. tuberculosis-DNA mit jedem der Probenröhrchen von Schritt 1.4, oben. Für eine externe, nicht-Template-Kontrolle (NTC), verwenden Sie 1 ul der Molekularbiologie Wasser anstelle des M. Tuberkulose DNA-Probe. Vortex-Spin-und Impuls die Röhre (n), wenn Sie fertig.

2. Legen Amplification Microarrays

  1. In 48 ul jeder Master-Mix / Probe auf die Mitte der jeweiligen Mikroarrays, wobei Sie darauf achten, den Microarray selbst nicht berühren.
  2. Legen Sie ein Deckglas auf dem Microarray-Dichtung und Dichtung, man aufpassen, nicht zu stoppen keine Luftblasen in der Microarray-Kammer. Luftblasen können sich negativ auf Verstärkungseffizienzund kann zu Artefakten oder Rauschen in dem nachfolgenden Bild-Mikroarray zu erzeugen.

3. Thermal Cycling

  1. Sobald alle Microarrays sind mit Probe werden Substrate auf der flachen Block Thermocycler geladen. Stellen Sie sicher, dass der beheizte Deckel Option auf "Aus". Ausstattung von Akonni Biosystems wird bereits für die Verwendung präqualifiziert werden. Ansonsten ist es sehr wichtig, um zu überprüfen, dass die flache Block Thermocycler (n) bieten (n) einheitliche, konsistente Heizung in allen Mikroarray-Substraten.
  2. Öffnen Sie den Thermocycler-Software, wählen Sie das entsprechende Programm, geben Sie "50 ul" für das Reaktionsvolumen, und starten Sie die Sicht. Die hier beschriebene Wärmezyklus-Protokoll besteht aus:
    Thermal Cycling Schritte
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 Sek.
    3 55 ° C 1 min
    4 65 ° C 30 Sek.
    5 Wiederholen Sie die Schritte (2-4) für 50 Zyklen
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 Stunden
  3. Die Gesamtzahl der thermischen Zyklen und 55 ° C nach der Amplifikation Haltezeit unabhängige Variable sind, dass der Benutzer zu ändern, wie benötigt oder für den spezifischen Experiment geeignet. Da der MDR-TB-Master-Mix schafft asymmetrisch (überwiegend Einzelstrang) Amplikons, ist es meist hilfreich, mehr Wärmezyklen, als es sonst für einen herkömmlichen, exponentielle PCR-Amplifikation-Protokoll verwendet werden, umfassen.
  4. Wenn der Temperaturwechsel und Hybridisierung Programm abgeschlossen ist, beenden Sie das Programm, entfernen Sie die Verstärkung Microarrays, schließen Sie die Software, und schalten Sie den Thermocycler (n).

4. Waschen und Trocknen

  1. Zum Waschen bis zu 24 Substrate gleichzeitig werden mindestens 250 ml 1x SSPE - 0,1% Triton X-100 Waschpuffer, und zwei Behälter mit mindestens 250 ml deionisiertem oder Milli-Q-Wasser jeweils. Der Waschpuffer kann im Voraus erstellt werden.
  2. Das Deckglas und die Dichtung von jedem Verstärkung Microarray Kammer mit Flach-End-Zange vorsichtig entfernen. Dieser Schritt ist der Punkt, an dem es das größte Risiko von schädlichen physikalisch-Gel-Element-Arrays. Verwenden Sie geeignete PCR-Kontaminationskontrollen, um die Ausbreitung zu verhindern amplifizierten Nukleinsäuren in der Arbeitsumgebung.
  3. Zeigen Microarray-Substraten in einer Histologie Objektträger-Halter, und setzen Sie alle Folien in den Waschkorb mit der Waschpuffer. Bedecken Sie den Behälter mit einem Deckel.
  4. Waschen Mikroarrays für 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  5. Tauchen Sie den Microarrays jeweils drei Mal in zwei aufeinanderfolgenden Waschungen VE-oderMilli-Q-Wasser und der Luft trocknen.

5. Imaging

Die asymmetrische MDR-TB-Primer-Gemisch erzeugt Cy3-markierten Amplikons. Gel-Element-Microarrays kann mit jedem Standard-Microarray-Imager in der Lage, Bild Cy3 abgebildet werden. Die folgende Bildverfahren ist spezifisch für die MDR-TB-Master-Mix, Dx2100 Feld tragbare Imager und automatisierte Analyse-Software von Akonni Verfügung gestellt.

  1. Stellen Sie sicher, dass das Ethernet-Kabel vom Scanner an den Computer angeschlossen ist.
  2. Schalten Sie den Scanner. Der Netzschalter befindet sich auf der Rückseite des Gerätes befindet. Blaue LEDs auf der Vorderseite der Abbildungs ​​leuchtet, wenn Imager eingeschaltet ist.
  3. Den Computer einzuschalten.
  4. Auf dem Computer-Desktop, doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, um die automatisierte Bildanalyse-Software zu starten.
  5. Warten Sie auf die Software, um eine Verbindung mit dem Imager-Kamera zu etablieren. Sobald die Verbindung hergestellt ist, wird die Schaltfläche Analysieren zur Verfügung, und dieMeldung "Verbindung erfolgreich" wird in der unteren linken Ecke des Bildschirms angezeigt.
  6. Legen Sie die getrockneten Mikroarray-Verstärkung mit der Mikroarray abgewandten den Benutzer und Richtung der Objektivlinse. Wenn das Mikroarray mit nicht gegen der Linse und der Kamera ausgerichtet ist, wird die automatisierte Analyse-Software nicht, um ein Raster auf dem Fluoreszenzbild zu platzieren.
  7. Schließen Sie die Tür. Eine Vorschau Bild wird auf dem Computer-Bildschirm verfügbar sein.
  8. Wählen Sie das MDR-TB-Analyse Skript aus dem Dropdown-Menü und geben Sie die gewünschte Belichtungszeit (in Millisekunden). Ein typischer Ausgangspunkt für Gel-Element Verstärkung Microarrays 100-500 ms.
  9. Gesättigte Pixel auf dem Vorschaubild in rot angezeigt. Einstellen der Belichtungszeit, um die Anzahl von gesättigten Bildelementen innerhalb einzelner Flecken zu minimieren.
  10. Klicken Sie auf Analysieren, um das Fluoreszenzbild zu erwerben und zu analysieren. Die Software wird automatisch vergeben einenMDR-TB-Assay-spezifischen Gitter auf das Bild, zu extrahieren und integrierte Intensität der Hintergrundwerte und berichten Arzneimittelresistenz und Genotypisierung Ergebnisse. Die automatisierte Analyse dauert in der Regel ein paar Sekunden. Für anspruchsvolle Bilder, die Kratzer, Staub, fluoreszierende Artefakte oder physische Schäden an den Microarray-Funktionen enthalten, muss die Software bis zu 1 min, um die Analyse abzuschließen.
  11. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Speichern, wählen Sie den Zielordner, geben Sie einen Dateinamen ein, und klicken Sie auf OK. Basiswert Microarray-Daten werden als. Xls-Datei gespeichert und können für die Offline-Analysen exportiert werden, wenn gewünscht.
  12. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, entfernen die Verstärkung aus der Microarray-Imager, und klicken Sie auf Neu, um die nächste Analyse einzuleiten.
  13. Beim Sammeln von Daten abgeschlossen ist, schließen Sie die Software, den Computer herunterfahren, und schalten Sie den Bildwandler.

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Ergebnisse

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Qualitative Bildanalyse Einblick in Quellen von Lärm oder experimentelle Variabilität, die herausfordern, um in Datentabellen durch automatisierte Bildanalyse-Software erzeugt identifizieren. So kann es sinnvoll sein, um visuell festzustellen, dass 1) Alle Elemente Gel intakt und unbeschädigt sind, 2) die globalen Grund frei von Artefakten, die einzelnen Fluoreszenzsignal-Rausch-Verhältnis-Werten (SNR) beeinträchtigen könnte, 3) es gibt keine Beweise für Blasenbildung oder ungleichmäßige Amplifikation / Hybridisierung ü...

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Diskussion

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Das Ausmaß der mit einer Multiplex-Amplifikation Mikroarray wird letztendlich von der Effizienz der Multiplex-PCR asymmetrisch, nicht das Mikroarray bestimmt wird. Nach unserer Erfahrung können 10-12 einzigartigen Primerpaare leicht zu einer Verstärkung Microarray-Format gemultiplext werden. Herkömmliche Primer-und Sondendesign Kriterien daher, neue Tests, mit Ausnahme, dass man muss auch mögliche Wechselwirkungen zwischen Lösungsphase Nukleinsäuren und Microarray-Sonden immobilisiert, der thermische Wirkungsgrad der Th...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) unter dem Förder RC3 AI089106 unterstützt.

MDR-TB Nukleinsäuren wurden durch das Kinderhilfswerk der Vereinten Nationen Entwicklungsprogramm Fund / UN / Weltbank / Weltgesundheitsorganisation Sonderprogramm für Forschung und Ausbildung in Tropical Diseases (TDR), Genf, Schweiz zur Verfügung gestellt.

Wir danken Dr. Tom Shinnick der US Centers for Disease Control and Prevention zur Orientierung auf die spezifischen Gene und Mutationen in der Prototypen-Test enthalten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MDR-TB-Amplifikations-Microarrays, mit applizierter Dichtung und vorgestanzten DeckgläsernAkonni BiosystemsInquire
Multiplex-PCR-Kit, bestehend aus 2X PCR-Puffer mit HotStar Taq plusQiagen#206143
Taq-PolymeraseQiagen#201207
RNAsefreiem WasserQiagen#206143 
FormamidThermo Fisher Scientific, Inc.#BP227-500
20 mg mL-1 nicht acetlyiertes Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X konzentrierte MDR-TB-PrimermischungAkonni BiosystemsAnfrage
500 fg uL-1 Amplifikations- und HemmkontrolleAkonni BiosystemsAnfrage
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.#BP151-500
Desinfektionsspray Current Technologies, Inc.
70% IsopropylalkoholDecon Labs, Inc.#8416
Microarray-Imager, mit automatisierter Bild- und DatenanalysesoftwareAkonni Biosystems100-20011
Thermocycler mit flachem BlockeinsatzAkonni Biosystems100-10021
Waschstation mit hohem Durchsatz und ObjektträgerhalterArrayItHTW
PräparierzangeThermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
Mini VortexerVWR#3365040
Mini-ZentrifugeVWR#93000-196
Airbrush Kompressor KitZentrale Pneumatik#95630
#BRSPRAY128

Referenzen

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Asymmetrische PCRMultiplex PCRmikrofluidische KammerMDR TB GenotypisierungDNA MutationsdetektionThermocyclingMicroarray HybridisierungOn Chip WaschungEcon DX 2100 Imager

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