Sequentiell In-vivo- Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Zusammenfassung

Quantitative Messung der Knochenvorläuferfunktion in Frakturheilung erfordert hohe Auflösung Serienbildtechnologie. Hier werden Protokolle für die Verwendung von Intravitalmikroskopie und Osteo-Linie Tracking Bild sequentiell und Quantifizierung der Migration, Proliferation und Differenzierung der knochenbild endogene Stammzellen / Vorläuferzellen in den Prozess der Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.

Zusammenfassung

Knochen dreht sich ständig und ist sehr regenerative nach Verletzungen. Osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen haben die Hypothese aufgestellt worden, lange zu existieren, aber in vivo Nachweis solcher Zellen wurde erst kürzlich erreicht. Dabei sind in vivo bildgebende Verfahren, die Rolle von endogenem osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen (OSPCs) und deren Nachkommen in Knochenreparatur zu untersuchen ist. Mit Osteo-Linie Zellverfolgung Modelle und Intravital Bildgebung von induzierten Mikrofrakturen im Knochen Schädel kann OSPCs direkt während der ersten paar Tage nach der Verletzung, in der kritische Ereignisse in der frühen Reparaturprozess auftreten beobachtet werden. Verletzungsstellen nacheinander abgebildet werden enthüllt, dass OSPCs verlagern, um der Verletzung, vermehren und differenzieren sich in knochenbildenden Osteoblasten. Diese Methoden bieten ein Mittel zur Untersuchung der Rolle von Stammzellen-intrinsische und extrinsische molekulare Regulatoren für die Knochenregeneration und Reparatur.

Einleitung

Degenerative Knochenerkrankungen und altersbedingten Knochenverlust führt zu einem hohen Risiko für osteoporotische Fraktur zu einer großen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit ^ein. Knochenerhalt wird von knochenbildenden Osteoblasten und Osteoklasten Knochen gesteuert. Mängel der knochenbildenden Zellen sind die Hauptursache der altersbedingten Knochenverlust und degenerative Knochenerkrankungen ^2,3. Während umfangreiche Forschung hat sich auf die Verbesserung der Frakturheilung konzentriert, um die Entdeckung der zuverlässige Medikamente degenerative Knochenerkrankungen zu heilen und die Schwäche der osteoporotischen Frakturen umkehren bleibt ein wichtiges Thema. So studieren die Quelle der knochenbildenden Zellen und ihre Kontrollmechanismen in der Knochenregeneration und Reparatur stellt eine neuartige Einblicke in Skelett-Regeneration zu verbessern und umzukehren Knochenverlust Krankheiten.

Das Vorhandensein von multi mesenchymalen Zellen im Knochenmark wurde basierend auf der Identifikation von klonogenen Populationen vorgeschlagen, könnten unterschiedlicheiate in osteogene, chondrogene adipogene und Ex-vivo-Linien ^4. kurzem mehrere Studien haben berichtet, dass Skelett / mesenchymale Stammzellen (SSC / MSC) sind eine natürliche Quelle von Osteoblasten und sind entscheidend für die Knochenumsatz, Umbau-, Reparatur-und Bruch ^5,6 . Darüber hinaus unsere Linie-Tracing-Studie ergab, dass reife Osteoblasten haben eine unerwartet kurze Halbwertszeit (~ 60 Tage) und werden kontinuierlich durch ihre Stammzellen / Vorläuferzellen in beiden normalen homöostatischen und Bruchreparaturbedingungen ⁶ aufgefüllt. Die in vivo-Identität von Stammzellen und wie solche Zellen reagieren jedoch um Verletzungen zu zerbrechen und liefern knochenbildenden Zellen sind unklar. Daher ist es wichtig, eine Methode, die in der Lage, die Migration, Proliferation und Differenzierung endogener SSC / MSCs in unter physiologischen Bedingungen zu analysieren entwickeln.

Bruchreparatur ist ein vielzelliger und dynamischer Prozess durch eine Anordnung von komplexen geregeltZytokine und Wachstumsfaktoren ^7. Die beliebteste Ansatz für die Bruch Studien ist es, ein Tiermodell mit langKnochenBruch zu nutzen und Knochen durch Knochen Schnitte und Immunfluoreszenz-Techniken ^10.08 analysieren. Dieses Reparaturverfahren kann von mehreren Bildgebungstechniken einschließlich Mikro-CT ^11, Nah-Infrarot-Fluoreszenz ¹² und Chemilumineszenz Abbildungs ^​​13 überwacht werden. Jedoch hat jede dieser Techniken bestimmte Beschränkungen und es wurde keine wirksame Möglichkeit, SSC / MSC-Funktion auf zellulärer Ebene in vivo zu überwachen. Kürzlich, konfokale / Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie wurde entwickelt und verwendet werden, um Krebszellen und transplantierten hämatopoetischen Stammzellen auch bei Single-Cell-Auflösung in lebenden Tieren ¹⁴ zu erfassen im Rahmen der ihr Knochenmark-Mikroumgebung. Durch die Kombination dieser Technologie mit einer Reihe von Linienverfolgungsmodelle, waren wir in der Lage, festzulegen, dass osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen genetisch durch transiente ac gekennzeichnetvierung des Myxovirus Widerstand -1 (MX1)-Promotor und Mx1-induzierte Vorläuferzellen können die Mehrheit der reifen Osteoblasten im Laufe der Zeit zu halten, aber nicht in der Erzeugung von Chondrozyten in der erwachsenen Maus ⁶ zu beteiligen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Mx1-markierten OSPCs liefern die Mehrheit der neuen Osteoblasten in Frakturheilung ^6.

Hier mit Osteo-Linie Verfolgungsmodelle und Intravitalmikroskopie wird ein Protokoll vorgesehen, um die in vivo-Kinetik Mx1 ⁺ osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchreparatur zu definieren. Dieses Protokoll bietet sequentielle Bildgebung, um die Verlagerung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchstellen und die quantitative Messung der Osteoprogenitorzellen Expansion in der frühen Reparaturprozess zu verfolgen. Dieser Ansatz kann sinnvoll in mehreren Zusammenhängen einschließlich der Bewertung der therapeutischen Kandidaten für die Knochenreparatur zu verbessern.

Protokoll

1. Mäuse und Präkonditionierung

Hinweis: Alle Mäuse wurden in keimfreien Bedingungen gehalten und alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital genehmigt. Alle Operation sollte unter sterilen Bedingungen mit sterilen autoklaviert Ausrüstung durchgeführt werden. Mx1-Cre ^15, Rosa26-loxP-Stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP) und Rosa26-loxP-Stop-loxP-tdTomato (Rosa-Tomate), waren von Jackson Laboratories. Osteocalcin-GFP-Mäuse wurden durch Dr. Henry Kronenberg zur Verfügung gestellt. Für die quantitative Analyse der OSPC Migration und Proliferation in vivo wurden Mx1-Cre ⁺ Rosa-YFP ⁺ (einfarbig-Reporter)-Mäusen verwendet. Für detaillierte Verfolgung von deren Differenzierung in Osteocalcin ⁺ reifen Osteoblasten, verwendeten wir trigenic Mx1-Cre ⁺ Rosa-Tomate ⁺ OCN-GFP ⁺Mäusen.

1. MX1 ^+-Zellen in vivo zu kennzeichnen, bereiten Polyinosin-Polycytidylsäure (Pipc, 2,5 mg / ml) in sterile PBS-Lösung und injizieren 200 ul für 20 g Mx1-Cre ⁺ Reporter Maus intraperitoneal einmal jeden zweiten Tag für 10 Tage.
2. Um ansässig Mx1 ⁺ hämatopoetischen Zellen zu beseitigen, bestrahlen Mäusen, die mit einer Einzeldosis von 9,5 Gy. Nach 24 Stunden der Bestrahlung, Transplantationswildtyp-Knochenmark-Zellen (1x10 ⁶ Zellen / Maus) intravenös ^16. Hinweis: Da Mx1-induzierbare Zellen schließen hämatopoetischen Zellen und hämatopoetischen stammenden Osteoklasten, die Beseitigung von Mx1 ⁺ hämatopoetischen Zellen verbessert die Bildqualität und die Quantifizierung von Mx1 ⁺ osteogenen Zellen.
3. Nach Knochenmarktransplantation, überwachen Tiere für vier bis sechs Wochen, um eine erfolgreiche Wiederbesiedlung von Spendermarkzellen zu erreichen.

2. MoVorbereitung nutzen

1. Maus anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von 50 ul Ketamin / Xylazin (100 mg / kg, Xylazin 12 mg / kg Körpergewicht) unter Verwendung eines IACUC-genehmigten Verfahren. Hinweis: Die Dauer der Wirkung kann durch eine zusätzliche Dosis von Ketamin / Xylazin erweitert werden.
2. Zu bestimmen, ob die Maus vollständig durch die fehlende Reaktion auf Zehe und / oder Schwanz drückt anästhesiert. (Optional) Wenn die Maus narkotisiert, sichern eine Isofluran-Gasmaske über der Nase durch Abkleben. Stellen Sie den Pegel von Isofluran, um sicherzustellen, das Tier völlig ruhig gestellt wird.
3. Clip der Kopfhaare mit einem elektrischen Trimmer oder kleine Schere. Entfernen Sie die Haare Fragmente und sterilisieren die freiliegende Haut mit 70% Alkoholtupfer. Bewerben Tränen Gel auf der Hornhaut eine Austrocknung zu verhindern.

3. Microfracture Injury

1. Nachdem sichergestellt wurde, das Tier völlig ruhig gestellt ist, stellen Sie einen einzelnen umgekehrten L-förmigen Einschnitt, um die Kopfhaut zu öffnen. Kurz gesagt, einen ersten Querschnitt (weniger als 1 cm) starting von einem Ohr zum anderen Ohr. Schalten ~ 60 ° und weiter in Richtung der Nase einzuschneiden, bis ~ 2-3 mm von der Nase. Anmerkung: Dieser Schnitt die Bildung von Narbengewebe über dem abzubildenden Bereich minimiert.
2. Trennen Sie die Hautlappen durch Ziehen zu den Seiten hin mit einer Pinzette. Beide Stirnbeins und der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Naht sollte klar freigelegt werden.
3. Reinigen Sie die offene Fläche durch Spülen mit sterilem PBS und sanfte Wisch mit steriler Gaze oder einem Wattestäbchen, bis alle Resthaare werden eliminiert.
4. Um Mikrofrakturen auf dem Schädeldach zu erzeugen, halten Sie die Mauskopf mit einer Hand und eine 30-G-Nadel mit einer anderen Hand. Machen Sie eine Mikropunktion (~ 0,2 mm Durchmesser Wunde mit <1 mm Tiefe) auf der linken Stirnbein in der Nähe der Kreuzung der sagittalen und Koronarnaht indem Sie die Spitze einer 30 G-Nadel mit sanftem Druck und Drehbewegung. Achtung: Es ist wichtig, um die Nadel am Eindringen in das Gehirn zu vermeiden, wodurch die Minimierung bleeding-und Gewebeschäden.
5. Wechseln Sie zu einem größeren Nadel (20 oder 25 G) und erweitern das Einstichloch durch Drehen der Nadel (Durchmesser ~ 0,5 mm).
6. Wiederholen Sie Schritt 3,3 bis 3,5 auf den zweiten Punktion auf der kontralateralen Stirnbein zu generieren.
7. Wischen Sie die verletzten Stellen durch kontinuierliche Absinken der PBS bis die Blutung aufhört.
   Hinweis: Blutung auf Bruchstellen werden mit entsprechenden Bild stören und Narbenbildung induzieren.
8. Einen Tropfen steriler physiologischer Kochsalzlösung oder 2% Methocel auf den Schädel, um ein Austrocknen zu verhindern. Hinweis: Lassen Sie keine der Schädeloberfläche, um zu trocknen, die Klarheit des Bildes verringert wird. Es ist wichtig, eine ausreichende Menge an Gel oder Kochsalzlösung verwenden, um den Bereich abzudecken.

4. Intravital Imaging

1. (Optional) vor der Bilderzeugung, einige Mäuse mit einem Gefäß Farbstoff, um die Blutgefäße injiziert visualisieren. Injizieren retroorbital mit 20 ul von nicht-zielgerichteten Qtracker 705 (2 &mgr; M-Lösung in 50 mM Borat-Puffer), verdünnt in 80 ml PBS. Verwenden Sie eine Insulinspritze zu Reagenz Abfall zu minimieren. Wenn das Signal nicht ausreichend hell ist, könnten zusätzliche Mengen benötigt werden.
2. Schalten Sie den Scanner. Hinweis: Ein Polygon-basierte Laserscanner ermöglicht die gleichzeitige Mehrkanal-Bildaufnahme in Videorate (30 Bilder pro Sekunde). Video Rate Scannen ist für Live-Tierbildgebung sehr wichtig.
3. Einschalten des Multiphotonen-Laser (Femtosekunden-Titan: Saphir-Laser). Stellen Sie die Wellenlänge auf 880 nm und stellen die Energie für Erzeugung der zweiten Harmonischen-Bildgebung (440 nm) des Knochens. Für GFP und tdTomato Anregung, schalten Sie die 491 nm und 561 nm Festkörperlaser.
4. Schalten Sie den PMT (Fotovervielfacherröhre) Detektoren für jedes Signal (ein 435 ± 20 nm Bandpassfilter für die zweite Harmonische ein 528 ± 19 nm Bandpassfilter für GFP, und 590 ± 20 für tdTomato.) (Optional) verwenden eine 638 nm Helium-Neon-Laser und einen PMT mit einer 695 ± 27,5 nm Bandpassfilter zur Detektion Qtracker 705 Signal.
5. Place das Tier auf einer XYZ-Achsen-motorisierte Mikroskoptisch. Halten Sie die Maus in die bequemste Position mit einem elektrischen Heizkissen zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur (dies reduziert das Risiko von Tierverlust). Verwenden Sie Klebeband, um die Maus zu halten, um die Bewegung während der Bildaufnahme zu minimieren und die Bildfläche so waagerecht wie möglich zu halten.
6. Einen Tropfen warmen 2% Methylcellulose-Gel oder physiologischer Kochsalzlösung auf den Schädel, um ein Austrocknen zu verhindern. Setzen Sie ein Deckglas auf dem Imaging-Bereich. Verwenden Sie eine niedrige Vergrößerungslinse (30x Wasserimmersionsobjektiv mit 0,9 NA), um die Schädeldecke zu scannen.
7. Mit der XYZ-Achsen-Steuerung, finden Sie die Oberfläche der Kalotte durch Erfassen der SHG-Signal von Knochen und identifizieren eine entscheidende Meilenstein Lage, wie der Schnittpunkt zwischen der sagittalen Nähten und Koronarnaht. Erwerben Sie ein Bild und notieren Sie die XYZ-Koordinaten.
8. Weiterhin für den Ort der Verletzung durch die Beobachtung SHG-und Fluoreszenzsignalen.
9. Wenn Verletzungsstellen oder die Region of Interesse gefunden werden, erhalten ein Bild der besten Fokusebene enthält SHG-und Fluoreszenzsignale von den Zellen von Interesse. Speichern XYZ-Koordinaten und der Abstand zum Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Naht, ihre genaue Position für die nächste Runde der Abbildungs ​​definieren.
10. Um 3D-Zell-und Knochenstrukturen von Bruchschäden sammelt, speichert Bilder von Z-Stapel (2-5 um Intervall) mit ~ 100 um Tiefe von endostalen Knochenoberfläche. Nach Abschluss der Bildgebung von einer Seite der Verletzung, wiederholen Abbildungsprozesses für die nächste Verletzungsstellen.

5. Beitrag Operation Procedures

1. Nach der Bild gründlich Bildstelle mit steriler Kochsalzlösung, die Methylcellulose-Gel aus dem Schädel zu entfernen. Mit einem sterilen Wattestäbchen, eine kleine Menge von Triple antibiotische Salbe auf der Oberfläche. Decken Sie die Hautlappen und wieder schließen, die Kopfhaut durch chirurgische Naht. Dies kann mit einer hypoallergenen Nähfaden (resorbierbaren Polyglactin su getan werdentur) und 5-0 Größe Nähnadel. Achtung: Gute Nahttechnik minimiert Narbenbildung.
2. Behandeln Sie alle Tiere, die mit IP-Injektion von 0,05 bis 0,1 mg / kg alle 12 h Buprenorphin für 48 Stunden nach der Operation. Halten Sie Tiere in einer Wärmerückgewinnung Kammer, bis sie genügend Bewusstsein wieder zu erlangen. Nach 3 bis 5 Tagen, öffnen Sie erneut den Faden und wiederholen Intravital-Bildgebung vor, um die zellulären Veränderungen während der Frakturheilung zu verfolgen.

Ergebnisse

Die stabilisierte lange Knochenbruch-Modell wurde populär in der Bruchstudien. , Lange Knochen oder große Bruch Modelle führen jedoch mehrere Gewebeschäden und daher eine Beschränkung in der quantitativen Messung der Knochenzellfunktion. Wir entwickelten eine minimal invasive Schädigung (weniger als 1 mm Durchmesser mit minimaler oder ohne Eindringen in die Dura mater) am Schädelknochen frontal mit Nadelbohrung (Fig. 1A-1C). Wir wählten eine Draufsicht auf die Schädelstirnbein für in vivo-Bildgebung...

Diskussion

Die Regulierung der Skelett Stammzellen von großer Bedeutung für die Definition bessere Methoden, um die Knochenregeneration zu erreichen. Quantitative und sequentielle Bildgebung auf zellulärer Ebene ist technisch anspruchsvoll gewesen. Obwohl die Maus Röhrenknochenfrakturmodell wurde weit verbreitet und eignet sich für biomechanische Studien ^17, haben ihre tiefe Gewebestelle, unebene Bruch Größe, Weichteilschaden, und die Anwendung der stabilisierenden Fixateur sequentielle Bildgebung Intravital begrenzt. H...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664
Ketaminhydrochlorid-Injektion	Bionichepharma	67457-001-10	Fläschchengröße: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazin Sterile Lösung	Lloyd Inc.	NADA# 139-236
Buprenorphin Hl	BEDFORD LAB	NDC 55390-100-10	Fläschchen: 0,3 mg/ml, Dosen: 0,05-0,1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
Alkoholvorbereitungspads (70% Isopropylalkohol)	Kendall WEBCOL	5110
Feine chirurgische Schere	F.S.T	14568-09
Extra feine Pinzette	F.S.T	11150-10
VICRYL*Plus Nahtmaterial	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 nicht zielgerichteter Quantenpunkt	Invitrogen	Q21061
Methocel 2%	OmmiVision
pIpC (Polyinosin-Polycytidylsäure)	Sigma	P0913-50MG	100 μ l (2,5 mg/ml in PBS) für 10 g Maus
Mai Tai Abstimmbare Ultrakurzpulslaser	Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS-Laser	Cobolt AB
Radius-635 HeNe-Laser	Kohärent