Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Summary

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Abstract

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

Introduction

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternativ....

Protocol

1. Die Projektierung des Zielproteins

1. Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht.
   Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Aminosäuren 122-241 hinzugefügt gestalten.
2. Um die N-Terminus fügen Sie die folgenden Sequenzen: 6x-His-Tag für die Reinigung (HHHHHH), Tabak....

Results

Klonierung und Expression-Test

Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). Während Testa.......

Discussion

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kultivierungspar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Essigsäure, eiszeitlich	EMD	AX0073-9	2,5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antischaum 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 & Mikro; g
BL21(DE3) Kompetente Zellen	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford Reagenz	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel-Filtrationsstandard	Bio-Rad	151-1901	6 Fläschchen
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidinhydrodiorid Amioformamidinhydrochlorid	Chem-Impex International	152	kg
His-Pur Ni-NTA Harz	Thermo Scientific	88222	100 ml
Salzsäure	EMD	HX0603-3	2,5 L
Imidazol	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli Probenpuffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Laurylsulfat Natriumsalz, Natriumdodecyloberfläche	Chem-Impex International	270	500 g
LB Brühe	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Kompetente Zellen	Novagen	69825	1 ml; Klonierung Wirt
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 Packung
Kaliumchlorid	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 & Mikro; g
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Natriumphosphat diabasisch	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Natriumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracyclinhydrochlorid	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycin/SDS Puffer, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Trypton, Pankreas	EMD	1.07213.1000	1 kg
Hefeextrakt,	granuliert EMD	1.03753.0500	500 g
Ä KTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Enthält Kits und Zubehör
Tisch-Orbitalschüttler	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzym wird mit Reaktionspuffern und Biotinlösung geliefert
Dialysekassette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (extra stark)
Dialyseschlauch	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25.000 und 50.000
Durchflussumleitungsventil FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin-Quantifizierungs-Assay-Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Röhrchenracks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraktionssammler Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Inklusive Kits und Zubehör
Beheizter/gekühlter Umwälzthermostat	VWR	13271-102	Modell 1156D
Wärmeschrank FD Serie	Binder		Modell FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Eingestellt - Ersatzprodukt: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Zentrifuge	Beckman Schar	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Schar	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Enthält 1 l Polyporpylenflaschen
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Serie Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		unendlich M200
Mini-PROTEAN Tetra	Cell Bio-Rad	165-8004	4-Gel vertikal Elektrophorese-System
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-Well-Kamm
Ni-NTA Säule	Bio-Rad	737-2512	49 ml  Volumen ECONO-Säule
Plasmid Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Netzteil	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Polypropylen-Copolymer-Röhrchen mit rundem Boden	VWR	3119-0050	50 ml  Röhrchen für JA 25.50 Rotor
Spin-X UF Konzentratoren	Corning	431488, 431483	20 und 6 ml; MWCO: 10.000 Da
Subklonierungsdienst	GenScript USA Inc.		Protein
Services Ultraschallprozessor	Cole-Parmer	18910445A	Modell CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Modell G560