Name: Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Expression, Isolierung und Reinigung biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration. Diese Methode nutzt Affinitätschromatographie zur Herstellung funktionaler Rekombinantproteine in Bakterien.

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Die Autoren danken der University of Akron für die Finanzierung, die diese Arbeit unterstützt bestätigen.

1. Die Projektierung des Zielproteins <ol><li> Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht. Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Aminosäuren 122-241 hinzugefügt gestalten. </li><li> Um die N-Terminus fügen Sie die folgenden Sequenzen: 6x-His-Tag für die Reinigung (HHHHHH), Tabak Etch Virus (TEV) Protease geschnitten Website zur Entfernung von His-Tag (ENLYFQG), Biotin-Tag-Sequenz für die Biotinylierung von Protein bei K (GLNDIFEAQKIEWHE) und flexiblen Gelenk mit Lücken, die Raum für die richtige Proteinrückfaltung (EFPKPSTPPGSSGGAP) ermöglichen. Anmerkung: Diese Sequenzen können je nach der gewünschten Fusions prot variierenEin. </li><li> Senden vollständige Aminosäuresequenz an ein Unternehmen für die Gen-Design / Optimierung für gewünschte Wirtsarten und Synthese. Subklonieren in einen Vektor der Wahl mit der BamHI-NotI-Stelle mit einem Kit oder durch Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen. </li></ol> 2. Machen Agar-Platten Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass alle Aktien von Antibiotika, Platten, Puffer, etc. ordnungsgemäß gelagert (Temperatur und Dauer) und bleiben frei von Proteasen (sterilisiert). <ol><li> Abwiegen Agar bei 1,5 Gew.% und Lysogenie Brühe (LB) bei 20 g / L und in eine Glasflasche Medien. Ein 500-ml-Flasche macht etwa 15 Platten. </li><li> Volumetrisch hinzufügen Reinstwasser, gut mischen und Autoklaven. </li><li> Lassen Flasche kühl an und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika. Vermeiden vorzeitigen Erstarrung der Agar, aber wenn Flasche kühlt zu viel und Lösung beginnt zu erstarren, Aufwärmen in der Mikrowelle. Hinweis: Unsere Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-GenE. Daher müssen alle Schritte Ampicillin bei 100 ug / ml enthalten. Die E. coli K12-Stamm erfordert Klonierung Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotikum. BL21-Bakterien-Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotikum. </li><li> Gießen 25-30 ml Lösung in 90 mm Petrischalen und genügend Zeit, um zu trocknen. </li><li> Label-Gericht mit geeigneten Antibiotika und speichern upside-down in 4 ° C, mit Parafilm oder in einem wiederverschließbaren Beutel. Hinweis: Die Platten sind gut für etwa einen Monat. </li></ol> 3. Klonierung des Biotin Tagged Plasmid Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Spin down Plasmid-Vektor bei 6.000 xg für 3 min, um zu pelletieren, und fügen Sie 10 ul sterilisiert Reinstwasser. </li><li> Entfernen Sie 50 ul chemisch kompetente E. coli-Zellen hohe Transformationseffizienz von -80 ° C und sofort auf Eis für 5-10 min. </li><li> 1 ul der Vektor-Lösung bei 0,5-1 ng/5056, L-Zellen an die 50 &amp;mgr; l E. coli-Zellen, und legen Sie die restlichen Plasmid in -80 ° C </li><li> Platzieren der Bakterien-Zellen, die den Vektor auf Eis für 5 min. </li><li> Hitzeschock die Zelle und Vektor Mischung für 30-45 sec in 42 ° C Wasserbad und Ortszellen wieder auf Eis für 2 min. </li><li> Add 250 ul Superbrühe mit optimalen Repression (SOC)-Medium (2% w / v-Bacto-Trypton, 0,5% w / v Bacto-Hefeextrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM Glucose , hochreinem Wasser, pH = 7,0) hinzugefügt und bei 250 Upm bei 37 ° C für 30 min. Hinweis: SOC nicht autoklavierbar, sondern Filter durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert werden. </li><li> Trockenplatten 10-15 min vor dem Beschichten Zellen. </li><li> Pipette 25, 50 und 100 &amp;mgr; l der Zelllösung auf separate Agarplatten, die Ampicillin (100 &amp;mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika. Verwenden Sie Glasperlen Lösung gleichmäßig auf Agar-Platten zu verteilen. </li> &lt;li&gt; Platten bei 37 ° C inkubieren upside-down für 15-18 Std. </li><li> Check für kleine Einzelbakterienkolonien auf den Platten bei 4 ° C lagern Oberseite nach unten bis zur weiteren Verwendung (Fig. 2A). <ol><li> Wenn keine Kolonien vorhanden sind: <ol><li> Überprüfen Sie die Frische und Sterilität von Puffern und Zubehör. </li><li> Erhöhen Sie die Menge von Plasmid E. hinzugefügt coli K12-Stamm. </li></ol></li><li> Wenn große Kolonien vorhanden sind oder ein übermäßiges Wachstum der Kolonien (Abbildung 2B und 2C), restreak ein neues Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Platten Zellen bei niedriger Lautstärke. </li></ol></li><li> Beimpfen von 5 ml LB, enthaltend Ampicillin (100 &amp;mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika mit einer einzelnen Kolonie transformierter E. coli-Zellen. Aufwachsen Zellen über Nacht bei 37 ° C bei 250-300 UpM. </li><li> Der folgende Tag, verwenden Sie ein Plasmid Isolation Kit, um die Zielvektor aus der Nacht gro isolierenw-und Speicher gereinigt Plasmid bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. <ol><li> Optional: Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmid mit Absorptionswert bei 260 und 280 nm erhalten. </li></ol></li></ol> 4. Transformation von Plasmid in Expression-Host Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,10 für E. coli BL21-Zellen mit den folgenden Änderungen: Hinweis: BL21 Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotika Ampicillin daher nur auf den Agarplatten zur Transformation aufgenommen. <ol><li> In 2-5 ul isolierte Plasmid bei 0,5-2 ng/50 ul Zellen aus Schritt 3,12-50 ul E. coli-Expressionswirtszellen. </li><li> Hitzeschock-Zellen, die für 60 bis 90 Sekunden. </li><li> Schütteln Lösung mit SOC-Medium bei 250 rpm für 60 min statt 30 min. </li></ol></li><li> Zupfen Sie eine Einzelkolonie von transformierten Bakterienzellen aus der Petrischale mit einem sterile Applikatorstäbchen und in ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium mit der entsprechenden Konzentration an Ampicillin (100 ug / ml). </li><li> Platzieren Reagenzgläser in Schüttler über Nacht bei 37 ° C bei 250 UpM. </li><li> Am folgenden Morgen, nehmen Sie 200 ul der Nacht wachsen-up und auf 5 ml LB mit Ampicillin bei 100 ug / ml hinzuzufügen. </li><li> Frieren Sie unten die restlichen Zellen mit 250 ul 50% Glycerin (steril) auf 750 ul Kultur und halten in -80 ° C Hinweis: Neue Testausdruck und Scale-up-Verfahren kann mit einem sterilen Applikator-Stick, ein Kratzen der gefrorenen Zellen zu erhalten und Impfen LB mit den entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden. </li><li> Platzieren Reagenzglas in Schüttler bei 250-300 Upm bei 37 ° C, bis die optische Dichte (OD) zwischen 0,7-0,8 bei einer Absorption von 600 nm gemessen. </li><li> Induzieren Zellen mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM. </li><li> Schütteln für weitere 4 h bei 37 ° C bei 300 UpM. Alternativ können auch Zellenüber Nacht bei 18 ° C bei 250-300 rpm geschüttelt werden. Dies kann eine höhere Ausbeute an Plasmid zu erzeugen in Abhängigkeit von dem Zielprotein. </li><li> Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse der Testausdruck <ol><li> Nehmen Sie 500 ul der Kultur und der Platz in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min. Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften &quot;löslich&quot;. Pellet unter Vortexen in 200 &amp;mgr; l Beladungsfarbstoff (50 ul 2-Mercaptoethanol, 950 &amp;mgr; l Laemmli-Probenpuffer). Hinweis: Löslich Bakterienpellets wird verwendet, um zu bestimmen, ob das rekombinante Protein in den cytoplasmatischen Regionen der Bakterienzellen. Pellets können in -80 ° C ohne Belastung Farbstoff, bis sie benötigt gespeichert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als lösliche als auch zum Vergleich behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie 1000 ul der Kultur und in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min.Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften &quot;unlöslich&quot;. Hinweis: unlöslich Pellets Denaturierung Verfahren unten, um Proteine ​​in Einschlusskörpern von Bakterien Zellen gefunden loslassen zu unterziehen. Pellets können in -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als unlösliche als auch zum Vergleich behandelt werden. <ol><li> Resuspendieren Sie das unlösliche Pellet in 200 ul BugBuster und bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Spin down Probe erneut bei 13-15 g für 5 min und nehmen 50 ul Überstand und es um neue &quot;unlöslich&quot; 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen. </li><li> Dann fügen Sie 50 ul Ladefarbstoff auf diese neue Probe. </li></ol></li><li> Sieden löslichen und unlöslichen Proben für 5 min, um Proteine ​​für die SDS-PAGE-Analyse zu denaturieren. </li><li> Legen Sie jede Probe in Elektrophorese-Gel mit Standard-Leiter. </li><li> Um zu visualisieren, die Proteinproben mit einem staining Reagenz und folgen Sie der Firma Protokoll. </li><li> Bestimmen, ob das Protein exprimiert, in den löslichen und / oder unlöslichen Fraktionen durch Vergleich dieser zwei Bahnen sowie den Vergleich der Spuren mit den löslichen und unlöslichen Kontrollspuren (siehe Anmerkung 4.9.1 und 4.9.2) auf den SDS-PAGE-Gel (Abb. 2). Ein dunkles Band sollte um das Molekulargewicht des Proteins in der löslichen oder unlöslichen Fahrspuren angezeigt. Damit wird festgelegt, welche Isolierungsverfahren in Protokoll Nr. 6 zu verwenden. Anmerkung: Wenn ein Band in diesen beiden Regionen entweder als Isolation in 6 verwendeten Protokoll unten durchgeführt werden, oder das Protein kann in beide Richtungen getrennt werden, um zu bestimmen, welche Isolierungsverfahren erzeugt eine höhere Ausbeute an rekombinantem Protein (Fig. 3) . </li><li> Wenn ein 4 h und Induktion über Nacht durchgeführt wurde, festzustellen, welche Induktionsmethode die höchste Proteinproduktion für das Scale-up-Prozess (Abbildung 2). </li></ol></li></ol&gt; 5. Scale-up Verfahren und Hauptkultur <ol><li> Bereiten Wachstumsmedien mit 85,7 g Terrific Broth und 28,8 ml 50% Glycerin in 1,8 l Reinstwasser und Autoklaven auf Flüssigkeitskreislauf für 1 Stunde. </li><li> Starten Sie eine Übernachtkultur von gefrorenen Zell Lager in Schritt 4.5 erstellt. Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Mischungs 20 ml LB mit einer Endkonzentration von Ampicillin bei 100 ug / ml in einer sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben. </li><li> Mit einem sterilen Applikator-Stick einen Verschrottung von transformierten E. coli-Zellen und Drop-Applikator in den Kolben. Entfernen Applikator-Stick und Stecker Kolben mit Schaumstoffstopper oder Baumwolle und mit Alufolie abdecken, um die Sterilität zu erhalten. </li><li> Schütteln über Nacht bei 250 UpM bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Hauptkultur Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Gießen-Nacht-Kultur in 1,8 L von sterilen Nährmedien und fügen Ampicillin bei 100 &amp;mgr; g / ml und 6 bis 8 Tropfen sterilen Antischaum 204 unter Verwendung einer Pasteurpipette. </li><li> Platz Kulturen in einem 37 ° C Wasserbad mit 0,2 mm durch Belüftung Steine ​​gefilterte Druckluft Blasenbildung in Kulturen. </li><li> Sobald der OD 600 nm von 0,7-0,8 erreicht, induziert mit IPTG (1 mM) und damit zur Induktion entweder 4 h bei 37 ° C oder über Nacht in Abhängigkeit von löslichen / unlöslichen Ergebnisse von SDS-PAGE in Schritt 4.9 auftreten, auf 18 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln E. coli-Zellen <ol><li> Spin-Down der Zellkultur in 1 l-Zentrifugenflaschen (2 Flaschen / Kultur) für 15 min bei 14.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand abgießen und mit einem dünnen Spachtel, schöpfen die Bakterien zu pelletieren in zwei 50-ml-Röhrchen. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletiert werden. Hinweis: Jeder 1,8-l-Kultur in zwei Bakterienpellets, eine in jeder 50-ml-Zentrifugenrohr führen. </li><li> Shop-Pellets in -80 C bis Proteinisolierung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 6. Isolierung und Reinigung von rekombinantem Protein Hinweis: Wenn das Protein in der löslichen Region auf Basis von SDS-PAGE-Analyse von Schritt 4,9, dann wird &quot;native Isolation&quot; verwendet werden, aber für die unlöslichen Proteinen &quot;Nonnative Isolation&quot;-Verfahren durchgeführt. <ol><li> Zelllyse <ol><li> Nonnative <ol><li> Transformierten E. entfernen coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank und 20 ml Lyse / Waschpuffer (Tabelle 1) zu jedem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vortex und schütteln Sie die gefrorenen Pellets, bis es taut und löst in der Pufferlösung ohne großen Brocken. Inkubation über Nacht auf Nutator. Am folgenden Morgen sollte das Pellet jetzt eine viskose Aufschlämmung aufgrund der Denaturierung des Proteins aus dem Puffer sein. </li><li> Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei Raumtemperatur für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol></li><li&gt; Native <ol><li> Erhalten transformierten E. coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Hinzufügen Lysis Buffer (Tabelle 1) Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen und zu entfernen gefrorene Pellet durch Verwirbeln und rigoros Schütteln. Zeigen Pellet auf Eis. </li><li> Waschen Sonicator Sonde mit 70% Ethanol bei 100% Amplitude für 1-2 min. Wiederholen Sie dann mit hochreinem Wasser. </li><li> Ultraschallbad Bakterien zu pelletieren, während auf Eis für 5 min (Gesamtzeit von 10 min). <ol><li> Stellen Ultraschallgerät bei 30% Amplitude mit Puls von 30 Sekunden an/30 s aus. </li><li> Bob Zentrifugenröhrchen nach oben und unten während der Beschallung Intervall, um vollständig brechen die Zellpellet. Am Ende der Gesamtzeit sollte es keine sichtbaren Bakterien zu pelletieren Verlassen einer sehnig, zähflüssige Brei. </li><li> Reinigen Sie das Ultraschallgerät Sonde zwischen verschiedenen Proteinisolierungen sowie für die Lagerung mit 70% Ethanol und Reinstwasser, wie in Schritt 6.1.2.3 beschrieben. </li></ol></li&gt; <li> Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol></li></ol></li><li> Ni-NTA-Affinitäts-Chromatographie <ol><li> Nonnative <ol><li> 1-ml-Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung zu jedem Zentrifugenröhrchen (2 ml Harz für insgesamt 1,8 l-Kultur) und Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 h auf Nutator. </li><li> Gießen Schlamm in Affinitätssäule und lassen Lösung durch Hahn Ventil vollständig in die Abfallbecherglas tropfen. </li><li> Zuführen 10 Wäschen mit 10 ml Lyse / Waschpuffer für jeden Waschgang. <ol><li> Für die ersten zwei Wäschen, fügen Sie die 10 ml-Zentrifugenröhrchen auf die zusätzliche Harz zu entfernen und gießen Sie dann in die Spalte. Die zusätzlichen Waschungen können direkt Spalte hinzugefügt werden. </li><li> Nach jedem Wasch, rühren Sie den Harz mit einem Glasstab. Sobald der Wasch tropft in den Abfall Becher können die nächsten 10 ml zugegeben werden. </li></ol></li><li> Nach dem vollständigen dr waschendurch ips, in der Nähe Absperrventil, entfernen und ersetzen Abfallbecherglas mit 50 ml-Zentrifugenröhrchen für die Protein-Sammlung. </li><li> 15 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und rühren-up Harz, so dass Lösung für 5 min zu sitzen. Absperrhahn öffnen Ventil und sammeln Elution. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren 15 ml. </li></ol></li><li> Ureinwohner <ol><li> Folgen Sie der Nonnative Affinity Chromatography oben (Schritte 6.2.1.1-6.2.1.4) mit Ausnahme stellen Sie die folgenden Parameter: <ol><li> Inkubieren Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 h auf Nutator. </li><li> Verwenden Sie die geeignete Waschpuffer (Tabelle 1). </li></ol></li><li> 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und Inkubation mit Harz 5 min. <ol><li> Offene Absperrventil und sammeln Elution, bis die meisten der Lösung durchtropft. </li><li> In 90 ul / Bradford Reagenz auf 96-Well-Platte zu löschen. Nach jeder Elution ermöglichen 10 ul soLösung, um aus der Spalte in den wohl mit 90 ul Bradford-Reagenz tropfen. </li><li> Weiter Zugabe von 5 ml Elution Buffer an, bis Bradford-Test erkennt nicht mehr Protein (Farbe reicht von dunkelblau bis hellblau zu löschen). Dies dauert in der Regel 4-5 Elutionsvolumina. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Dialyse / Renaturierung <ol><li> Machen nonnative (Renaturierung) und native Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Speicher in 4 ° C Anmerkung: Der pH-Wert der Dialyse-Puffer werden durch isoelektrische Punkt des Zielproteins (pI) bestimmt. Als eine Faustregel, Proteine ​​sollten mindestens einen vollen Punkt über oder unter ihrem pI-Werte gepuffert werden. </li><li> Übertragen nativen und nicht-nativen Elutionen einen Dialyseschlauch mit entsprechenden Molekulargewichtsgrenze (25.000 MWCO für NGF und 50.000 MWCO für Sema3A). Je eine Proteinprobe in jeweiligen Dialysepuffer 1 für 4 h bei 4 ° C und dann mit dem entsprechenden Puffer 2 über ersetzenNacht bei 4 ° C Hinweis: Protein muss in jedem Puffer für mindestens 4 Stunden für die ordnungsgemäße Rückfaltung und Pufferaustausch stattfinden dialysiert werden. </li><li> Konzentrieren Sie die dialysiert Protein Elutionen auf weniger als 5 ml Zentrifugen mit Spin-Konzentratoren. Hinweis: Die Proteine ​​können durch Verwendung schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt und erneut eingeengt werden. </li></ol></li><li> Bestimmen Proteinkonzentration (mg / ml) durch Gefriertrocknen einer 10-50 ml Probe in einem vorgewogenen Zentrifugenröhrchen. <ol><li> Optional: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ε, so daß die Konzentration des Proteins in Zukunft Isolierungen durch Messung der Absorption einer Probe bei 280 nm unter Verwendung des Lambert-Beer-Gesetzes bestimmt werden: C = A 280nm / &amp;epsi; L, wobei L die Weglänge ist. </li></ol></li></ol> 7. Biotinylierung von gereinigtem Protein <ol><li> Dialysiere Proteine ​​in 10.000 MWCO Dialysekassetten against 10 mM Tris (pH = 8,0), die Änderung der Puffer alle 4 Stunden mit insgesamt sechs Veränderungen. </li><li> Transfer der rekombinanten Proteine ​​(jetzt in 10 mM Tris-Puffer), um 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Biotinylierung. </li><li> Biotinylieren Proteine ​​unter Verwendung einer Biotin-Protein-Ligase-Kit. </li><li> Proteine ​​dialysiert gegen PBS (pH = 7,4) mit 10.000 MWCO Dialysekassetten mit 3 Puffer ändert einen Tag für 2 Tage. </li><li> Bestimmen Sie die Prozent Biotinylierung von Proteinen mit Hilfe eines quantitativen Kit. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration wieder wie in 6.4 und bei 4 ° C oder aliquotieren und bei -20 ° C zur Langzeitlagerung beschrieben. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kultivierungspar...

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternative zu niedermolekularen Wirkstoffen. 1977, ein Gen, das 14 Aminosäuren Somatostatin-Sequenz, einer der ersten Werk Polypeptide unter Verwendung von E. geschaffen coli ein. Bald nach 1979 wurde Insulin in pBR322 kloniert, transformiert, ausgedrückt und gereinigt 2. Seitdem haben rekombinanten Proteinen, ihren Einfluss, um mehrere Felder der Rechts erweitertSuche wie Biomaterialien, Wirkstofftransport, Gewebetechnik, Bio-Pharmazie, Landwirtschaft, industrielle Enzyme, Biokraftstoffe, etc. (siehe Referenzen für Bewertungen 3-8). Dies ist weitgehend auf die Vielseitigkeit, die das Verfahren bietet über die Zugabe von anwendungsspezifischen chemischen Einheiten oder Proteinsequenzen zu Zwecken einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zielproteinidentifizierung, Stabilisierung und Reinigung begrenzt. Über rekombinante DNA-Technologie können rekombinante Proteine ​​in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtssystemen, einschließlich Säuger-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz oder Bakterien exprimiert werden. Jeder Host bietet verschiedene Vorteile und in der Regel das beste System wird auf der Grundlage der Proteinfunktion, Ertrag, Stabilität, Gesamtkosten und Skalierbarkeit bestimmt. Bakterien-Zellen fehlen oft die post-translationale Modifikation Mechanismen, die eukaryotischen Wirten (dh Glykosylierung, Disulfidbrücken, E<html> tc.) 5. Als Ergebnis Säuger-und Insekten-Systemen in der Regel eine bessere Kompatibilität und die Expression von eukaryontischen Proteinen führen, aber diese Rechner sind in der Regel teuer und zeitaufwendig 9. Daher E. coli ist der bevorzugte Wirt für unsere Expressionssystem, da die Zellen rasch expandieren in preiswerten Wachstumsbedingungen und die genetische Expression Mechanismen sind gut verstanden 5,9. Zusätzlich ist dieses System leicht trotz des Fehlens von posttranslationalen Modifikationen 10 Scale-up für Produktionszwecke und die Ergebnisse in funktionelle Proteine. Die E. coli K12 Stamm wird in diesem Protokoll für das Klonen gewählt, weil dieser Stamm bietet ausgezeichnete Plasmid-Ausbeuten bezogen auf hohe Transformationseffizienz. Darüber hinaus wird ein E. coli-Stamm BL21 zur Expression verwendet werden, da diese Wirtsstamm enthält die T7-RNA-Polymerase-Gen, gesteuert Protein Expression und Stabilität 11 liefert. Zelt &quot;&gt; Nach Hostauswahl müssen weitere Pflege in der Wahl des geeigneten Expressionsvektor ausgewählt und gesteuert Proteinexpression zu erleichtern aufgenommen werden. Synthese von rekombinanten Proteinen beginnt mit einem Ziel-DNA-Sequenz, die unter der Leitung des Bakteriophagen T7 Transkriptions-und Translationssignale kloniert wird, und Expression in Wirtszellen, die chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gen 12 enthält, induziert. Diese Vektoren, aus dem Plasmid pBR322 (für einen Überblick siehe Referenz 13), fest mit dem T7-Promotor zunächst von Studier und Mitarbeiter entwickelten 14 gesteuert und zusätzliche Steuerung durch die Einbeziehung der lac-Operator-lac-Repressor (LAC1) 15,16. Für die rekombinante Proteintechnik bietet das Expressionssystem die Fähigkeit, eine spezifische Aminosäuresequenz eines gewünschten Proteins durch Einsetzen verschiedener DNA-Zielsequenzen anzupassen oder um Fusionsproteine ​​zu erzeugen bis kombinierter Domain gemachts von einzelnen Proteinen. Darüber hinaus können einige Vektorreihe umfassen Peptid-Tag Modifikationen am N-oder C-Terminus angeordnet werden. Unser Gestaltungszwecken wurde ein Histidin (His)-Tag an die DNA-Zielsequenz zur Reinigung aufgenommen und 15 Aminosäure biotinylatable Sequenz wurde für die Biotinylierung 17,18 enthalten. In diesem Protokoll ein Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, wurde ausgewählt, um unsere biotinylatable Fusionsprotein-Sequenzen tragen. Die Expression wird in diesem Vektor durch T7-lac-Promotor kontrolliert und ist leicht mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Test Ausdrücke (kleine Kulturen) werden verwendet, um das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins, das entweder in einer löslichen oder unlöslichen Form zu formulieren Reinigungsverfahren ausgedrückt werden kann zu bestimmen. Ein lösliches Protein innerhalb der Bakterienzelle exprimiert wird spontane Faltung unterziehen, um seine native Struktur 19 zu halten. Typischerweise ist die MutterStruktur ist thermodynamisch günstig. In vielen Fällen ist die Stoffwechselaktivität der Rechner ist nicht förderlich für das Zielprotein, indem Druck auf das System, um die unlöslichen Proteinproduktion und die Bildung von Einschlusskörpern von unlöslichen Proteinaggregaten zusammen führt. Damit das Zielprotein denaturiert, wodurch sie im allgemeinen biologisch inaktiven 20. Beide Test Ausdrücke vergrösserte und Isolationsverfahren sind durch die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt wird. Eine weitere Renaturierung oder Rückfaltungsschritt für unlösliche Proteine ​​erforderlich. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​können weiter unter Verwendung von Grßenausschluß-Chromatographie gereinigt werden. Im Haus bietet rekombinanten Proteinproduktion Kostenvorteile gegenüber kommerziellen Produkten seit Milligramm Zielprotein pro Liter Hauptkultur isoliert werden. Die meisten der benötigten Ausrüstung ist in einer typischen biologischen oder chemischen Labor erhältlich. Protein-Engineering ermöglicht die Erzeugungvon kundenspezifischen Fusionsproteine ​​mit zusätzlichen Funktionen, die nicht im Handel erhältlich sind immer. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Verfahren in der Technik rekombinanten Proteinen beteiligt. Mit diesem Expressionssystem haben wir viele biotinylatable Proteine, wie Interferon-gamma, Plättchenwachstumsfaktor, Knochen-morphogenetisches Protein 21-23 angelegt, aber wir werden auf zwei Proteine, die wir für Axon Führung, NGF (29 kDa ausgebildet konzentrieren ) und Sema3A (91 kDa) 10 (für eine Übersicht siehe Referenz 24). Biotinylierung ist eine übliche Technik zur Identifizierung, Isolierung und Immobilisierung der markierten Proteine ​​unter Verwendung der bekannten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung 25-27. Biophysikalischen Sonden 28,29, Biosensoren 30 und Quantenpunkte 31 sind Beispiele von Systemen, die hohe Affinität von Biotin-Streptavidin Konjugation mit einem K d in der Größenordnung von 10 -15 M 27 nutzen. Die E. coli bioZinn-Ligase BirA, unterstützt die kovalente Bindung von Biotin an die Lysin-Seitenkette in der Biotin-markierten Sequenz gefunden 18,32. Tethering Biotin an Werkstoffen und Biomolekülen hat anhaltende Abgabe von Wachstumsfaktoren produziert, um für mehrere Tissue Engineering Anwendungen 21,33-35 Zelle. Daher Engineering diese maßgeschneiderten biotinylatable Proteinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das mehrere Forschungsinteressen überwinden kann.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hydroxyethylmercaptan &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Essigsäure, eiszeitlich</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Antischaum 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 & Mikro; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Kompetente Zellen</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; Expression Host</td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Gel-Filtrationsstandard</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 Fläschchen</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Guanidinhydrodiorid Amioformamidinhydrochlorid</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td> 1 <td>kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA Harz</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Laurylsulfat Natriumsalz, Natriumdodecyloberfläche</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Brühe &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Kompetente Zellen</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Klonierung Wirt</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 Packung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 & Mikro; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Natriumphosphat diabasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/Glycin/SDS Puffer, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Trypton, Pankreas</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Hefeextrakt, </td><td>granuliert EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Enthält Kits und Zubehör</td></tr><tr><td>Tisch-Orbitalschüttler</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzym wird mit Reaktionspuffern und Biotinlösung geliefert</td></tr><tr><td>Dialysekassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (extra stark)</td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25.000 und 50.000</td></tr><tr><td>Durchflussumleitungsventil FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Biotin-Quantifizierungs-Assay-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Röhrchenracks, Rack C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Fraktionssammler Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Inklusive Kits und Zubehör</td></tr><tr><td>Beheizter/gekühlter Umwälzthermostat&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Modell 1156D</td></tr><tr><td>Wärmeschrank FD Serie</td><td>Binder</td><td></td><td>Modell FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Eingestellt - Ersatzprodukt: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Schar</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>Enthält 1 l Polyporpylenflaschen</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Serie Clean Bench</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td>unendlich M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra</td><td>Cell Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-Gel vertikal Elektrophorese-System</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Any kDa, 15-Well-Kamm</td></tr><tr><td>Ni-NTA Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; Volumen ECONO-Säule</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Polypropylen-Copolymer-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; Röhrchen für JA 25.50 Rotor</td></tr><tr><td>Spin-X UF Konzentratoren</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 und 6 ml; MWCO: 10.000 Da</td></tr><tr><td>Subklonierungsdienst</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>Protein</td></tr><tr><td>Services Ultraschallprozessor&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Modell CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Modell G560</td></tr></tbody></table>

expression, isolierung und reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter proteine ​​für nervengeweberegeneration

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

<html> Klonierung und Expression-Test Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). Während...

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, rekombinante biotinylierte Proteine erfolgreich zu konstruieren, zu exprimieren und zu isolieren, die in eine Vielzahl von Anwendungen wie Sonden, Sensoren, Arzneimittelabgabe und Gewebeengineering integriert werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst der maßgeschneiderte Plasmid mittels Kulturen im kleinen Maßstab in eine bakterielle Wirtszelllinie transformiert und anschließend die Expression des Zielproteins induziert wird. Danach wird das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt, um geeignete Reinigungsverfahren zu entwickeln.Anschließend wird das Verfahren hochskaliert, um größere Mengen des Zielproteins zu gewinnen, die anschließend mittels Affinitätschromatographie isoliert werden. Schließlich werden die Proteine gereinigt und für nachgeschaltete Anwendungen und Analysen angereichert. Abschließend bestätigen SDS-Page- und FPLC-Ergebnisse, dass rekombinante Proteine erfolgreich isoliert und gereinigt wurden, und die Proteine werden zusätzlich auf ihre Funktionalität getestet.Der Hauptvorteil der rekombinanten Proteintechnik liegt darin, dass sie die Herstellung von großtechnischen oder im Milligramm-Maßstab liegenden Mengen maßgeschneiderter Proteine ermöglicht, die exakt unseren wissenschaftlichen Vorgaben entsprechen. Beispielsweise können wir bestimmten Abschnitten dieser Proteine neue Funktionen hinzufügen, um neue Eigenschaften zu erzielen. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie die Enden spezifischer Proteine mit Biotin markieren können, und wie man dies nutzt, um diese Proteine gezielt an Oberflächen zu immobilisieren oder zu verankern, um zelluläre Funktionen wie das axonale Wachstum oder die neuronale Differenzierung zu steuern.Personen, die neu in dieser Technik sind, sollten keine großen Schwierigkeiten haben, wenn sie die Verfahren zur Isolierung von nativen oder nicht-nativen Proteinen befolgen. Viele Schritte sind identisch, erfordern jedoch ein spezifisches Puffermittel, das entweder für native oder nicht-native Bedingungen formuliert ist. Sorgfältige Beachtung der Details zu Beginn ist wichtig.Die Transformations- und Testexpressionsstufen gewährleisten eine hohe Proteinausbeute während des späteren endgültigen Hochskalierungsprozesses. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da sie zeigt, wie rekombinante Proteine unter Verwendung einfacher Laborgeräte und -materialien hergestellt werden können. Mithilfe der einfachen Chargenreaktion werden der Ausgleich und das Wachstumsmedium im Vorläufermaßstab angezogen und erzeugen 10 Milligramm Protein pro Hauptkultur.Außerdem können Chromatographietechniken verwendet und demonstriert werden, um zu zeigen, wie Proteine für nachgeschaltete Anwendungen weiter gereinigt werden. Heute wird Alicia aus dem Graduate Cinema Lab das Verfahren demonstrieren. Nach dem Klonen und Testen der Expression des Zielproteins sowie dem Anzüchten einer 20-Milliliter-Kultur über Nacht gießt man laut Textprotokoll die Übernachtkultur in 1,8 Liter steriles Wachstumsmedium mit Ampicillin und gibt mit einer Pasteurpipette sechs bis acht Tropfen sterilem Antischaummittel 204 hinzu. Die Kulturen werden in ein Wasserbad mit 37 °C gestellt; über einen 0,2-Mikron-Filter wird mithilfe von Belüftungssteinen komprimierte Luft in die Kulturen eingeblasen. Wenn die Kultur einen OD600 von 0,7 bis 0,8 erreicht hat, fügt man einmillimolares IPTG hinzu und induziert vier Stunden bei 37 °C oder über Nacht bei 18 °C, abhängig davon, ob das Protein im löslichen oder unlöslichen Bruchteil bei der Expressionsprüfung gefunden wurde.Experimente durchführen, um die Zellen zu gewinnen, die Kultur in Ein-Liter-Zentrifugenröhrchen umfüllen und 15 Minuten bei 14.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand abgießen und mit einem dünnen Spatel das bakterielle Pellet in zwei 50-Milliliter-Röhrchen umschaufeln. Die Zellen erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletieren, bevor die Pellets bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Um nicht-native Proteine zu isolieren. Fügen Sie für ein unlösliches Protein zu jedem gefrorenen E. coli-Pellet 20 Milliliter Lyse- und Waschpuffer hinzu und wirbeln und schütteln Sie, um aufzulösen, um eventuelle große Klumpen zu beseitigen.Nach der Inkubation über Nacht auf einem Mutator sieht die Lösung wie ein viskoser Brei aus, der zentrifugiert wird. Zentrifugieren Sie den Brei bei 20.500 × g und Raumtemperatur für 30 Minuten. Überführen Sie das Überstand in ein frisches Gefäß und verwerfen Sie den Pellet für die native Proteinisolierung.Resuspendieren Sie die Pellets in Lysepuffer bis zu einem Endvolumen von 30 Milliliter, wobei der resuspendierte Pellet auf Eis gehalten wird. Stellen Sie das Ultraschallgerät auf eine Amplitude von 30 % mit einem Puls von 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus ein und führen Sie die Sonolyse fünf Minuten lang durch. Bewegen Sie das Gefäß während der Sonolyse auf und ab, um das Zellpellet vollständig aufzulösen.Zentrifugieren Sie die Suspension bei 20.500 × g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Überführen Sie dann den Überstand in ein frisches Gefäß und verwerfen Sie das Pellet. Um eine Affinitätschromatographie an einem nicht-nativ isolierten Protein durchzuführen, geben Sie je Zentrifugenröhrchen ein Milliliter Nickel-NTA-Harzlösung hinzu und inkubieren Sie mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Mutaschüttler oder Schüttler.Geben Sie die Suspension in eine Affinitäts-Säule und lassen Sie die Lösung vollständig durch das Stopfbrennerventil in einen Abfallbecher laufen. Geben Sie 10 Milliliter Waschpuffer in das Zentrifugenröhrchen, um das restliche Harz zu entfernen, und fügen Sie die Lösung hinzu, nachdem sie vollständig durchgelaufen ist. Rühren Sie das Harz mit einem Glasrührstab um und lassen Sie es vollständig durchlaufen, bevor Sie eine weitere Waschung hinzufügen.Als Nächstes verwenden Sie 10 Milliliter Waschpuffer, um die Spülung des Zentrifugenröhrchens zu wiederholen, und überführen Sie diesen in die Säule. Führen Sie anschließend acht weitere Waschungen der Säule mit jeweils 10 Milliliter Lysepuffer durch. Sobald die Waschungen abgeschlossen sind, schließen Sie den Hahn und ersetzen den Abfallkolben durch das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Geben Sie 15 Milliliter Eluierpuffer auf die Säule, rühren Sie das Harz um und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang stehen. Öffnen Sie dann den Hahn und sammeln Sie das EIT, bevor Sie den Vorgang mit weiteren 15 Millilitern Eluierpuffer wiederholen, um ein natives Protein zu reinigen. Nachdem das Nickel-NTA-Harz der Proteiniösung zugesetzt wurde, inkubieren Sie die Mischung auf einem Rüttler bei vier Grad Celsius für mindestens eine Stunde.Nachdem die Säule zehnmal mit Waschpuffer gewaschen wurde, fünf Milliliter Elutionspuffer hinzufügen und das Harz fünf Minuten lang inkubieren, bevor mit einem frischen Gefäß das meiste EIT gesammelt wird, während das EIT aus der Säule tropft. 90 Mikroliter pro Vertiefung Bradford-Reagenz in eine klare 96-Loch-Platte geben. Nach jeder fünfmilliliter-Elution mit Puffer 10 Mikroliter der Lösung aus der Säule in eine Vertiefung tropfen lassen, die 90 Mikroliter Bradford-Reagenz enthält. Fortfahren mit dem EEU, bis kein Protein mehr nachgewiesen wird, um zu dialysieren und/oder Rena.Die Proteine werden jeweils in Dialyse-Schläuche überführt und gegen den geeigneten Puffer dialysiert, einmal vier Stunden bei vier Grad Celsius, bevor der Puffer durch den jeweiligen Puffer ersetzt wird. Zwei Übernachtungen bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie Spin-Konzentratoren, um die dialysierten Proteine auf weniger als fünf Milliliter einzukonzentrieren, und reinigen Sie gegebenenfalls durch Größenausschlusschromatographie mittels Atin acht.Entsprechend dem Textprotokoll wurden während der Testexpression NGF und SEMA drei A zunächst vier Stunden bei 37 Grad Celsius induziert, und die SDS-Page-Analyse ergab, dass sich beide Proteine in diesem löslichen Fraktion befanden. Die Proteinexpression schien zufriedenstellend, daher wurde eine weitere Testexpression mit einer Übernacht-Induktion bei 18 Grad Celsius untersucht. Die Expression von NGF in der löslichen Fraktion verbesserte sich, während kein bemerkbarer Unterschied bei SEMA drei festzustellen war.NGF wurde unter nativen und nicht-nativen Bedingungen isoliert und zur Reinigung über eine FPLC-Säule geleitet. Obwohl NGF während der Testexpression in der löslichen Fraktion vorlag, ergab die native Isolierung eine geringe Ausbeute sowohl bei der Induktion bei 37 Grad Celsius als auch bei 18 Grad Celsius. Eine höhere Ausbeute an NGF wurde dagegen durch nicht-native Isolierung mit anschließender Renaturierung erzielt.Daher wurde NGF unter nicht-native Bedingungen isoliert. Nach einer Übernachtlichen Induktion bei 18 Grad Celsius führte die nicht-native Isolierung zu keiner Produktion von SEMA drei a, während bei nativer Isolierung 8,61 ± 3,1 Milligramm pro Hauptkultur von zwei Litern erhalten wurden. Daher wurde SEMA drei A vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius induziert und unter Verwendung nativer Isolierungsparameter gewonnen.Die FPLC-Peaks wurden gesammelt und NGF- sowie SEMA drei A-Proben wurden mittels SDS-Page analysiert. Zusätzliche Proteinpeaks, die in der FPLC-Ausgabe für SEMA drei A gefunden wurden, wurden gesammelt und per SDS-Page analysiert und befanden sich nicht im molekulargewichtsmäßigen Bereich von SEMA drei A. Diese Fraktionen sind höchstwahrscheinlich Abbauprodukte, da sie in zellbasierten Assays nicht funktionell aktiv waren, im Gegensatz zu SEMA drei.Ein Peak ist hier markiert. Sobald die rekombinante Proteinexpression etabliert und beherrscht ist, sollten Isolierung und Reinigung, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden, nur noch wenige Tage in Anspruch nehmen. Die anfänglichen Schritte der bakteriellen Transformation und der Testexpression dauern jedoch länger, um die Proteinsolubilität korrekt bestimmen zu können.Nach der Bestimmung der Löslichkeit kann eine Bibliothek der transformierten Bakterien bei minus 80 gelagert werden. Außerdem können E. coli-Pellets nach der Proteinexpression ebenfalls bei minus 80 aufbewahrt werden, bis eine weitere Isolierung und weitere Experimente durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die Puffer sterilisiert und frisch hergestellt werden, um zu verhindern, dass Proteasen die Proteine denaturieren und abbauen.Puffer für die Isolierung sollten alle vier bis sechs Wochen hergestellt und sterilisiert werden, und Dialysepuffer sollten am Tag vor der Isolierung angesetzt werden. N-I-N-T-A- und FPLC-Säulen sollten gemäß den Herstellervorschriften gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination durch mehrere biotinylierte Proteine zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man maßgeschneiderte biotinylierte Proteine mittels eines bakteriellen Expressionssystems exprimiert, isoliert und reinigt.Dies ähnelt den wissenschaftlichen und kommerziellen Verfahren im kleinen und großen Maßstab. Daher ist dies breit anwendbar.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Dieses Video zeigt die Isolierung von Zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen aus einer Astrozytenkultur. Die Astrozytenkultur wird auf Eis gelegt, um die Endozytose zu hemmen, und dann werden die Proteine auf der Zelloberfläche mit einem Biotinylierungsreagenz markiert. Die Zellen werden lysiert, um die biotinylierten Zelloberflächenproteine und nicht-biotinylierten intrazellulären Proteine freizusetzen. Schließlich werden Streptavidin-beschichtete Kügelchen verwendet, um die...

Isolierung von zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen aus einer Astrozytenkultur

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Präsentiert wird hier ein Protokoll, das ein in vitro neural-endotheliales Kokultursystem und die metabolische Einbeziehung von Sialoglycan mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen kombiniert, um primäre neuronale Stamm- und Vorläuferzellen zu erweitern und ihre Oberfläche zu beschriften. sialoglycoproteinzur Bildgebung oder Massenspektrometrieanalyse von Zelloberflächenmarkern.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Rekombinantes BDNF, das eine Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen kostengünstig hergestellt und durch Affinitätschromatographie gereinigt. BDNFavi wird dann direkt mit dem Enzym BirA in einer Röhre mono-biotinyliert. BDNFavi und monobiotinyd BDNFavi behalten ihre biologische Aktivität im Vergleich zu kommerziell erhältlichen BDNF.

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Das Protokoll stellt eine Methode für die kovalente In-vivo-Bindung von Biotin an Proteine vor, die auf ihrer Nähe zu einer Biotin-Ligase basiert, die mit einem Protein von Interesse fusioniert ist. Diese Modifikation ermöglicht eine selektive Anreicherung der Proteine mit Streptavidin-Kügelchen, wie sie in Proteininteraktionsstudien benötigt wird.

Im lebenden Organismus Proximity-Biotinylierung für Proteininteraktionsstudien in Paramecium tetraurelia

Erfahren Sie die Expression, Isolierung und Reinigung biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration. Diese Methode nutzt Affinitätschromatographie zur Herstellung funktionaler Rekombinantproteine in Bakterien.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

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