Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, rekombinante biotinylierte Proteine erfolgreich zu entwerfen, zu exprimieren und zu isolieren, die in eine Vielzahl von Anwendungen wie Sonden, Sensoren, Wirkstoffverabreichung und Tissue Engineering integriert werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst das kundenspezifisch entwickelte Plasmid unter Verwendung von Kulturen im kleinen Maßstab in eine bakterielle Wirtszelllinie umgewandelt und dann die Expression des Zielproteins induziert wird. Als nächstes wird das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt, um geeignete Reinigungsverfahren zu formulieren.

Dann wird das Verfahren hochskaliert, um größere Ausbeuten des Zielproteins zu erzielen, die dann mit Hilfe von Affinitätschromatographie-Techniken isoliert werden. Schließlich werden die Proteine aufgereinigt und dann für nachgelagerte Anwendungen und Analysen konzentriert. Letztendlich bestätigen die Ergebnisse der SDS-Seite und der FPLC, dass rekombinante Proteine erfolgreich isoliert und gereinigt wurden, und die Proteine werden weiter auf ihre Funktionalität getestet.

Der Hauptvorteil des rekombinanten Protein-Engineerings besteht darin, dass es uns ermöglicht, große Mengen oder Milligramm-Mengen an kundenspezifischen Proteinen herzustellen, die genau unseren wissenschaftlichen Spezifikationen entsprechen. Zum Beispiel können wir Teilen dieser Proteine neue Funktionalitäten hinzufügen, um neue Eigenschaften zu ermöglichen. Wir zeigen Ihnen heute, wie Sie die Enden bestimmter Proteine biotin können, und wir nutzen dies, um diese Proteine spezifisch zu immobilisieren oder an Oberflächen zu binden, um zelluläre Funktionen wie das Wachstum von Neuronen oder die neuronale Differenzierung zu steuern.

Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, sollten keine großen Schwierigkeiten haben, wenn sie die Verfahren zur Isolierung nativer oder nicht-nativer Proteine befolgen. Viele Schritte sind identisch, erfordern jedoch einen spezifischen Puffer, der für systemeigene oder nicht-native Bedingungen formuliert wurde. Sorgfältige Aufmerksamkeit für Details am Anfang.

Die Transformations- und Testexpressionsstufen werden eine hohe Proteinausbeute während des späteren finalen Scale-up-Prozesses gewährleisten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da sie zeigt, wie rekombinante Proteine mit einfachen Laborgeräten und -materialien hergestellt werden können. Unter Verwendung der einfachen Batch-Reaktion werden E-Ausgleichs- und Wachstumsmedien im Leader-Maßstab gezüchtet, wodurch 10 Milligramm Protein pro Hauptkultur produziert werden.

Darüber hinaus können Chromatographietechniken verwendet und demonstriert werden, um zu zeigen, wie Proteine für die nachgelagerte Anwendung weiter gereinigt werden. Heute wird Alicia, Absolventin des Cinema Lab, das Verfahren nach dem Klonieren und Testen der Expression am Zielprotein von Interesse und dem Züchten einer 20-Milliliter-Kultur über Nacht demonstrieren. Gießen Sie die Übernachtkultur gemäß dem Textprotokoll in 1,8 Liter steriles Wachstumsmedium mit Ampicillin und geben Sie mit einer Pasterpipette sechs bis acht Tropfen steriles Anti-Schaummittel 2 0 4 in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad durch einen 0,2-Mikron-Filter, lassen Sie Druckluft durch Belüftungssteine in die Kulturen. Wenn die Kultur einen OD 600 von 0,7 bis 0,8 bei einem millimolaren IPTG erreicht und diesen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei 18 Grad Celsius induziert, je nachdem, ob das Protein in der Testexpression in der löslichen oder unlöslichen Fraktion gefunden wurde.

Experimente, um die Zellen zu sammeln, die Kultur in Ein-Liter-Zentrifugenflaschen zu überführen und sie 15 Minuten lang bei 14.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius herunterzuschleudern. Gießen Sie das Super Natin ab und schöpfen Sie das Bakterienpellet mit einem dünnen Spatel in zwei 50-Milliliter-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation für einige Minuten, bevor Sie die Pellets bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Zur Durchführung von nicht-nativem Protein. Isolierung eines unlöslichen Proteins zu jedem gefrorenen E-Coli-Pellet. Fügen Sie 20 Milliliter Lyse, Waschpuffer und Vortex hinzu und schütteln Sie, um zu resuspendieren und große Stücke zu entfernen.

Nach der Inkubation auf einem Mutator über Nacht sieht die Lösung aus wie eine zähflüssige Güllezentrifuge. Die Gülle wird 30 Minuten lang bei 20.500-facher Schwerkraft und Raumtemperatur hergestellt. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet zur Isolierung des nativen Proteins.

Bei der Wiederbelebung werden die Pellets in einem Lysepuffer mit einem Endvolumen von 30 Millilitern suspendiert, wobei das resuspendierte Pellet auf Eis liegt. Stellen Sie die Beschallung auf eine Amplitude von 30 % ein, mit einem Impuls von 30 Sekunden, 30 Sekunden aus, und beschallen Sie sie fünf Minuten lang. Bewegen Sie das Rohr während der Beschallung auf und ab, um das Zellpellet vollständig aufzubrechen.

Zentrifugieren Sie die Aufschlämmung bei 20.500-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Füllen Sie dann den Überstand in ein frisches Rohr um und entsorgen Sie das Pellet. Um eine Affinitätschromatographie an einem nicht-nativen isolierten Protein durchzuführen, geben Sie einen Milliliter Nickel-NTA-Harzlösung in jedes Zentrifugenröhrchen und inkubieren Sie mindestens eine Stunde lang auf einem Mutator oder Shaker bei Raumtemperatur.

Gießen Sie die Gülle in eine Affinitätssäule und lassen Sie die Lösung vollständig durch das Absperrhahnventil in ein Abfallbecherglas tropfen. Geben Sie 10 Milliliter Waschpuffer in das Zentrifugenröhrchen, um Harzreste zu entfernen, und geben Sie die Lösung in die Säule, nachdem die Lösung durchgetropft ist. Rühre das Harz mit einem Rührstab aus Glas um und lasse es fertig tropfen, bevor du es erneut wäschst.

Verwenden Sie anschließend 10 Milliliter Waschpuffer, um das Spülen des Zentrifugenröhrchens zu wiederholen und in die Säule zu übertragen. Führen Sie dann acht weitere Waschgänge der Säule mit 10 Millilitern Lysewaschpuffer für jede Wäsche durch. Schließen Sie nach Abschluss der Wäschen den Absperrhahn und ersetzen Sie den Abfallbecher durch das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie 15 Milliliter elucianischen Puffer in die Säule, rühren Sie das Harz um und lassen Sie die Lösung fünf Minuten einwirken. Öffnen Sie dann den Absperrhahn und sammeln Sie das EIT, bevor Sie es mit zusätzlichen 15 Millilitern Elutionspuffer wiederholen, um ein natives Protein zu reinigen. Nach Zugabe des Nickel-NTA-Harzes zur Proteinlösung mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem Mutator inkubieren.

Nachdem Sie die Säule 10 Mal mit Waschpuffer gewaschen haben, fügen Sie fünf Milliliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie das Harz fünf Minuten lang, bevor Sie ein frisches Röhrchen verwenden, um den größten Teil des EIT zu sammeln, während das EIT aus der Säule tropft. Geben Sie 90 Mikroliter Bradford-Reagenz pro Vertiefung in eine klare 96-Well-Platte. Lassen Sie nach jeweils fünf Millilitern Elucian mit Puffer 10 Mikroliter Lösung aus der Säule in eine Vertiefung mit 90 Mikrolitern Bradford-Reagenz tropfen. Fahren Sie mit der EAWU fort, bis das Protein nicht mehr zur Dialysierung und/oder Rena nachgewiesen wird.

Die Proteine übertragen jedes EIT in den Dialyseschlauch und dialysieren gegen den entsprechenden Puffer, einen für vier Stunden bei vier Grad Celsius, bevor er durch den entsprechenden Puffer ersetzt wird. Zwei über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie Spin-Konzentratoren, um die dialysierten Proteine auf weniger als fünf Milliliter zu konzentrieren, und reinigen Sie sie auf Wunsch mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie bis Atin Acht.

Gemäß dem Textprotokoll wurden während der Testexpression NGF und SE drei A zunächst vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius induziert, und die SDS-Seitenanalyse ergab, dass sich beide Proteine in dieser löslichen Fraktion befanden. Die Proteinexpression schien fair zu sein, so dass eine weitere Testexpression mit Induktion über Nacht bei 18 Grad Celsius untersucht wurde. Die NGF-Expression verbesserte sich in der löslichen Fraktion, während es bei SEMA drei keinen merklichen Unterschied gab.

Ein NGF wurde unter nativen und nicht-nativen Bedingungen isoliert und zur Reinigung durch die FPLC-Säule geleitet. Obwohl NGF während der Testexpression in der löslichen Fraktion lag, führte die native Isolierung sowohl bei 37 Grad Celsius als auch bei 18 Grad Celsius Induktion zu einer geringen Ausbeute. Eine höhere Ausbeute an NGF wurde jedoch durch nicht-native Isolierung mit Renaturierung erzielt.

Infolgedessen wurde NGF unter nicht-nativen Bedingungen isoliert. Nach Induktion über Nacht bei 18 Grad Celsius führte die nicht-native Isolierung zu keiner SEMA-Drei-Produktion mit 8,61 plus oder minus 3,1 Milligramm pro Hauptkultur von zwei Litern für die native Isolierung. Daher wurde SEMA drei A vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius induziert und mit nativen Isolationsparametern isoliert.

FPLC-Peaks wurden gesammelt und NGF- und SEMA-Drei-A-Proben wurden mit der SDS-Seite analysiert. Zusätzliche Proteinpeaks, die in der FPLC-Ausgabe für SEMA drei A gefunden wurden, wurden mit der SDS-Seite gesammelt und analysiert und befanden sich nicht in der SEMA drei a Molekulargewichtsregion. Bei diesen Fraktionen handelt es sich höchstwahrscheinlich um Abbauprodukte, da sie sich in zellbasierten Assays nicht funktionell verhielten, wie es bei SEMA drei der Fall war.

Hier ist ein Gipfel angedeutet. Sobald das rekombinante Protein etabliert und beherrscht ist, sollten die Isolierung und Reinigung bei ordnungsgemäßer Durchführung nur wenige Tage dauern. Die anfängliche Bakterientransformation und die Testexpressionsphasen dauern jedoch länger, um die Löslichkeit des Proteins richtig zu identifizieren.

Sobald die Löslichkeit bestimmt ist, kann eine Bibliothek der transformierten Bakterien im minus 80 gespeichert werden. Darüber hinaus können E-Coli-Pellets nach der Proteinexpression bis zur weiteren Isolierung und zum Experimentieren ebenfalls im Minusbereich von minus 80 gelagert werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Puffer sterilisiert und frisch gemacht werden, um zu verhindern, dass Proteasen denaturieren und Ihre Proteine abbauen.

Isolationspuffer sollten alle vier bis sechs Wochen hergestellt und sterilisiert werden, und Dialysepuffer sollten am Tag vor der Isolierung hergestellt werden. N-I-N-T-A- und FPLC-Säulen sollten gemäß den Protokollen des Herstellers gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination durch mehrere biotinylierte Proteine zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kundenspezifische biotinylierte Proteine mit einem bakteriellen Wirtsexpressionssystem exprimieren, isolieren und aufreinigen können.

Dies ähnelt dem, was sowohl wissenschaftlich als auch kommerziell im kleinen und großen Maßstab getan wird. Somit hat dies eine breite Anwendung.