Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, rekombinante biotinylierte Proteine erfolgreich zu konstruieren, zu exprimieren und zu isolieren, die in eine Vielzahl von Anwendungen wie Sonden, Sensoren, Arzneimittelabgabe und Gewebeengineering integriert werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst der maßgeschneiderte Plasmid mittels Kulturen im kleinen Maßstab in eine bakterielle Wirtszelllinie transformiert und anschließend die Expression des Zielproteins induziert wird. Danach wird das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt, um geeignete Reinigungsverfahren zu entwickeln.

Anschließend wird das Verfahren hochskaliert, um größere Mengen des Zielproteins zu gewinnen, die anschließend mittels Affinitätschromatographie isoliert werden. Schließlich werden die Proteine gereinigt und für nachgeschaltete Anwendungen und Analysen angereichert. Abschließend bestätigen SDS-Page- und FPLC-Ergebnisse, dass rekombinante Proteine erfolgreich isoliert und gereinigt wurden, und die Proteine werden zusätzlich auf ihre Funktionalität getestet.

Der Hauptvorteil der rekombinanten Proteintechnik liegt darin, dass sie die Herstellung von großtechnischen oder im Milligramm-Maßstab liegenden Mengen maßgeschneiderter Proteine ermöglicht, die exakt unseren wissenschaftlichen Vorgaben entsprechen. Beispielsweise können wir bestimmten Abschnitten dieser Proteine neue Funktionen hinzufügen, um neue Eigenschaften zu erzielen. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie die Enden spezifischer Proteine mit Biotin markieren können, und wie man dies nutzt, um diese Proteine gezielt an Oberflächen zu immobilisieren oder zu verankern, um zelluläre Funktionen wie das axonale Wachstum oder die neuronale Differenzierung zu steuern.

Personen, die neu in dieser Technik sind, sollten keine großen Schwierigkeiten haben, wenn sie die Verfahren zur Isolierung von nativen oder nicht-nativen Proteinen befolgen. Viele Schritte sind identisch, erfordern jedoch ein spezifisches Puffermittel, das entweder für native oder nicht-native Bedingungen formuliert ist. Sorgfältige Beachtung der Details zu Beginn ist wichtig.

Die Transformations- und Testexpressionsstufen gewährleisten eine hohe Proteinausbeute während des späteren endgültigen Hochskalierungsprozesses. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da sie zeigt, wie rekombinante Proteine unter Verwendung einfacher Laborgeräte und -materialien hergestellt werden können. Mithilfe der einfachen Chargenreaktion werden der Ausgleich und das Wachstumsmedium im Vorläufermaßstab angezogen und erzeugen 10 Milligramm Protein pro Hauptkultur.

Außerdem können Chromatographietechniken verwendet und demonstriert werden, um zu zeigen, wie Proteine für nachgeschaltete Anwendungen weiter gereinigt werden. Heute wird Alicia aus dem Graduate Cinema Lab das Verfahren demonstrieren. Nach dem Klonen und Testen der Expression des Zielproteins sowie dem Anzüchten einer 20-Milliliter-Kultur über Nacht gießt man laut Textprotokoll die Übernachtkultur in 1,8 Liter steriles Wachstumsmedium mit Ampicillin und gibt mit einer Pasteurpipette sechs bis acht Tropfen sterilem Antischaummittel 204 hinzu. Die Kulturen werden in ein Wasserbad mit 37 °C gestellt; über einen 0,2-Mikron-Filter wird mithilfe von Belüftungssteinen komprimierte Luft in die Kulturen eingeblasen. Wenn die Kultur einen OD600 von 0,7 bis 0,8 erreicht hat, fügt man einmillimolares IPTG hinzu und induziert vier Stunden bei 37 °C oder über Nacht bei 18 °C, abhängig davon, ob das Protein im löslichen oder unlöslichen Bruchteil bei der Expressionsprüfung gefunden wurde.

Experimente durchführen, um die Zellen zu gewinnen, die Kultur in Ein-Liter-Zentrifugenröhrchen umfüllen und 15 Minuten bei 14.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand abgießen und mit einem dünnen Spatel das bakterielle Pellet in zwei 50-Milliliter-Röhrchen umschaufeln. Die Zellen erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletieren, bevor die Pellets bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Um nicht-native Proteine zu isolieren. Fügen Sie für ein unlösliches Protein zu jedem gefrorenen E. coli-Pellet 20 Milliliter Lyse- und Waschpuffer hinzu und wirbeln und schütteln Sie, um aufzulösen, um eventuelle große Klumpen zu beseitigen.

Nach der Inkubation über Nacht auf einem Mutator sieht die Lösung wie ein viskoser Brei aus, der zentrifugiert wird. Zentrifugieren Sie den Brei bei 20.500 × g und Raumtemperatur für 30 Minuten. Überführen Sie das Überstand in ein frisches Gefäß und verwerfen Sie den Pellet für die native Proteinisolierung.

Resuspendieren Sie die Pellets in Lysepuffer bis zu einem Endvolumen von 30 Milliliter, wobei der resuspendierte Pellet auf Eis gehalten wird. Stellen Sie das Ultraschallgerät auf eine Amplitude von 30 % mit einem Puls von 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus ein und führen Sie die Sonolyse fünf Minuten lang durch. Bewegen Sie das Gefäß während der Sonolyse auf und ab, um das Zellpellet vollständig aufzulösen.

Zentrifugieren Sie die Suspension bei 20.500 × g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Überführen Sie dann den Überstand in ein frisches Gefäß und verwerfen Sie das Pellet. Um eine Affinitätschromatographie an einem nicht-nativ isolierten Protein durchzuführen, geben Sie je Zentrifugenröhrchen ein Milliliter Nickel-NTA-Harzlösung hinzu und inkubieren Sie mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Mutaschüttler oder Schüttler.

Geben Sie die Suspension in eine Affinitäts-Säule und lassen Sie die Lösung vollständig durch das Stopfbrennerventil in einen Abfallbecher laufen. Geben Sie 10 Milliliter Waschpuffer in das Zentrifugenröhrchen, um das restliche Harz zu entfernen, und fügen Sie die Lösung hinzu, nachdem sie vollständig durchgelaufen ist. Rühren Sie das Harz mit einem Glasrührstab um und lassen Sie es vollständig durchlaufen, bevor Sie eine weitere Waschung hinzufügen.

Als Nächstes verwenden Sie 10 Milliliter Waschpuffer, um die Spülung des Zentrifugenröhrchens zu wiederholen, und überführen Sie diesen in die Säule. Führen Sie anschließend acht weitere Waschungen der Säule mit jeweils 10 Milliliter Lysepuffer durch. Sobald die Waschungen abgeschlossen sind, schließen Sie den Hahn und ersetzen den Abfallkolben durch das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie 15 Milliliter Eluierpuffer auf die Säule, rühren Sie das Harz um und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang stehen. Öffnen Sie dann den Hahn und sammeln Sie das EIT, bevor Sie den Vorgang mit weiteren 15 Millilitern Eluierpuffer wiederholen, um ein natives Protein zu reinigen. Nachdem das Nickel-NTA-Harz der Proteiniösung zugesetzt wurde, inkubieren Sie die Mischung auf einem Rüttler bei vier Grad Celsius für mindestens eine Stunde.

Nachdem die Säule zehnmal mit Waschpuffer gewaschen wurde, fünf Milliliter Elutionspuffer hinzufügen und das Harz fünf Minuten lang inkubieren, bevor mit einem frischen Gefäß das meiste EIT gesammelt wird, während das EIT aus der Säule tropft. 90 Mikroliter pro Vertiefung Bradford-Reagenz in eine klare 96-Loch-Platte geben. Nach jeder fünfmilliliter-Elution mit Puffer 10 Mikroliter der Lösung aus der Säule in eine Vertiefung tropfen lassen, die 90 Mikroliter Bradford-Reagenz enthält. Fortfahren mit dem EEU, bis kein Protein mehr nachgewiesen wird, um zu dialysieren und/oder Rena.

Die Proteine werden jeweils in Dialyse-Schläuche überführt und gegen den geeigneten Puffer dialysiert, einmal vier Stunden bei vier Grad Celsius, bevor der Puffer durch den jeweiligen Puffer ersetzt wird. Zwei Übernachtungen bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie Spin-Konzentratoren, um die dialysierten Proteine auf weniger als fünf Milliliter einzukonzentrieren, und reinigen Sie gegebenenfalls durch Größenausschlusschromatographie mittels Atin acht.

Entsprechend dem Textprotokoll wurden während der Testexpression NGF und SEMA drei A zunächst vier Stunden bei 37 Grad Celsius induziert, und die SDS-Page-Analyse ergab, dass sich beide Proteine in diesem löslichen Fraktion befanden. Die Proteinexpression schien zufriedenstellend, daher wurde eine weitere Testexpression mit einer Übernacht-Induktion bei 18 Grad Celsius untersucht. Die Expression von NGF in der löslichen Fraktion verbesserte sich, während kein bemerkbarer Unterschied bei SEMA drei festzustellen war.

NGF wurde unter nativen und nicht-nativen Bedingungen isoliert und zur Reinigung über eine FPLC-Säule geleitet. Obwohl NGF während der Testexpression in der löslichen Fraktion vorlag, ergab die native Isolierung eine geringe Ausbeute sowohl bei der Induktion bei 37 Grad Celsius als auch bei 18 Grad Celsius. Eine höhere Ausbeute an NGF wurde dagegen durch nicht-native Isolierung mit anschließender Renaturierung erzielt.

Daher wurde NGF unter nicht-native Bedingungen isoliert. Nach einer Übernachtlichen Induktion bei 18 Grad Celsius führte die nicht-native Isolierung zu keiner Produktion von SEMA drei a, während bei nativer Isolierung 8,61 ± 3,1 Milligramm pro Hauptkultur von zwei Litern erhalten wurden. Daher wurde SEMA drei A vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius induziert und unter Verwendung nativer Isolierungsparameter gewonnen.

Die FPLC-Peaks wurden gesammelt und NGF- sowie SEMA drei A-Proben wurden mittels SDS-Page analysiert. Zusätzliche Proteinpeaks, die in der FPLC-Ausgabe für SEMA drei A gefunden wurden, wurden gesammelt und per SDS-Page analysiert und befanden sich nicht im molekulargewichtsmäßigen Bereich von SEMA drei A. Diese Fraktionen sind höchstwahrscheinlich Abbauprodukte, da sie in zellbasierten Assays nicht funktionell aktiv waren, im Gegensatz zu SEMA drei.

Ein Peak ist hier markiert. Sobald die rekombinante Proteinexpression etabliert und beherrscht ist, sollten Isolierung und Reinigung, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden, nur noch wenige Tage in Anspruch nehmen. Die anfänglichen Schritte der bakteriellen Transformation und der Testexpression dauern jedoch länger, um die Proteinsolubilität korrekt bestimmen zu können.

Nach der Bestimmung der Löslichkeit kann eine Bibliothek der transformierten Bakterien bei minus 80 gelagert werden. Außerdem können E. coli-Pellets nach der Proteinexpression ebenfalls bei minus 80 aufbewahrt werden, bis eine weitere Isolierung und weitere Experimente durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die Puffer sterilisiert und frisch hergestellt werden, um zu verhindern, dass Proteasen die Proteine denaturieren und abbauen.

Puffer für die Isolierung sollten alle vier bis sechs Wochen hergestellt und sterilisiert werden, und Dialysepuffer sollten am Tag vor der Isolierung angesetzt werden. N-I-N-T-A- und FPLC-Säulen sollten gemäß den Herstellervorschriften gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination durch mehrere biotinylierte Proteine zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man maßgeschneiderte biotinylierte Proteine mittels eines bakteriellen Expressionssystems exprimiert, isoliert und reinigt.

Dies ähnelt den wissenschaftlichen und kommerziellen Verfahren im kleinen und großen Maßstab. Daher ist dies breit anwendbar.