Summary
RNA polymerase II syntetiserer en forløper RNA som strekker seg utover den 3'-enden av det modne mRNA. Den enden av det modne RNA genereres cotranscriptionally, på et sted diktert av RNA-sekvenser, via endonuklease aktivitet av spalting kompleks. Her har vi detaljer metoden for å studere cleavage reaksjoner in vitro.
Abstract
Den 3 'ende av pattedyr-mRNA'er er ikke dannet ved brå avslutning av transkripsjon av RNA polymerase II (RNPII). I stedet syntetiserer RNPII forløper mRNA utover slutten av modne RNA, og en aktiv prosess med endonuklease-aktivitet er nødvendig ved en bestemt område. Spalting av forløperen RNA oppstår vanligvis 10-30 nt nedstrøms fra konsensus polyA side (AAUAAA) etter CA dinucleotides. Proteiner fra spalting komplekset, en multifaktoriell proteinkompleks på omtrent 800 kDa, oppnå dette spesifikke nuclease-aktivitet. Spesifikke RNA sekvenser oppstrøms og nedstrøms for polyA styre valg av rekrutteringen av spalting kompleks. Umiddelbart etter spalting, blir pre-mRNA polyadenylated av polyA-polymerase (PAP) til å produsere modne stabile RNA-meldinger.
Behandling av 3 'enden av et RNA transkript kan studeres ved hjelp av cellulære nukleære ekstrakter med spesifikke radioaktivt merkede RNA-substrater. I sum, en lang 32 </ Sup> P-merkede uncleaved forløper RNA inkuberes med nukleære ekstrakter in vitro, og spalting bedømmes ved gelelektroforese og autoradiografi. Når korrekt spaltning inntreffer, en kortere 5 'spaltes produktet blir detektert og kvantifisert. Her beskriver vi spalting assay i detalj ved hjelp av, som et eksempel, er 3 'enden behandling av HIV-1 mRNA.
Introduction
Biosyntesen av de fleste modne eukaryote melding RNA (mRNA) krever flere post-transcriptional modifikasjoner som tildekking, skjøting og polyadenylering. Disse modifikasjonene er generelt koplet for å sikre riktig behandling og en sterkt øke stabiliteten av mRNA.
Den 3 'ende dannelse av pattedyr-pre-mRNA er generert av endonucleolytic spaltning av den begynnende RNA, etterfulgt av tilsetningen av adenylat-rester til 5' spaltet produkt av poly (A)-polymerase (PAP) 2-4. I pattedyr er spalting gjennomføres ved en multikomponent proteinkompleks, over ca 800 kDa, som setter sammen den spesifikke pre-RNA sekvenser. Det poly (A)-signal-sekvens, en høyt bevarte, anerkjente hexanucleotide sekvens AAUAAA, dirigerer spaltningssete ved omtrent 10 til 30 nt nedstrøms. Dette nettstedet er spesielt anerkjent av spalting og polyadenylering spesifisitet faktor (CPSF) og 73 kD subenhet avCSPF inneholder endonuclease aktivitet. Spaltingen stimuleringsfaktor (CstF) binder en mer degenerert GU-eller U-rik element sekvens nedstrøms for poly (A) område. Også som kreves for spalting er pattedyr spalting faktor I (CFIm) og pattedyr spalting faktor II (CFII). CFIm binder de spesifikke UGUA (N) nettsteder i oppstrøms sekvenselementer (bruker) som er definert for en rekke gener og synes å være involvert i viktige fysiologiske prosesser 5-8.
In vitro, blir RNA-prosesseringsreaksjoner ofte analysert ved bruk av radioaktivt merkede RNA-substrater 9-12. Disse kan syntetiseres ved run-off transkripsjons fra bakteriofag T7 eller SP6 promoter. Når man studerer en polyadenylerings-sete som ikke er karakterisert ovenfor, er det nødvendig å bruke genom-DNA i stedet for cDNA for å generere den RNA-substrat, som viktige nedstrøms-sekvenser ikke kan være til stede i cDNA. Design underlag for å inkludere minst 150 nt ligger oppstrømsm og 50 nt nedstrøms fra spaltningssetet / slutten på den modne mRNA. Spaltingen produktet vandrer hurtigere enn substratet; Imidlertid, fordi andre fragmenter kan bli dannet ved ikke-spesifikk nuklease handling, har spesifisiteten av reaksjonen å bli bekreftet av sin avhengighet av de riktige prosesssignalsekvenser. Derfor RNA-substrater med en punktmutasjon i det AAUAAA sekvens (f.eks AAGAAA) tjener som en negativ kontroll for spaltning reaksjonen.
Gitt at en liten mengde radiomerket RNA anvendes for spaltning reaksjoner, kan RNases stede i høy mengde i de fleste nukleære ekstrakter være problematisk, og begrenser valget av utgangsmaterialet for ekstrakt preparatet. HeLa-celler har en tendens til å inneholde lave nivåer av endogene RNases og således gi gode resultater i disse assays.
Den endonucleolytic spalting av RNA-substrater in vivo og in vitro er umiddelbart etterfulgt av poly (A) addisjonssetet, tos den spaltet mellom er ikke til stede i målbare mengder. Derfor, for å studere enten en spesifikk RNA-sekvens, eller proteiner som er involvert i en kløyvingsreaksjon blir eksperimenter utført under forhold som hindrer polyadenylering oppstår. Det er ingen avhengighet av cleavage på polyadenylering, eller vice versa, slik at man kan stoppe polyadenylering uten å skade spaltningsreaksjon. Således er ATP erstattet med en kjede terminere analogt som mangler 3'-hydroksyl-gruppen, slik at bare et enkelt nukleotid kan inkorporeres i poly (A) område og bare spaltes RNA kan detekteres.
På grunn av kompleksiteten og høye grad av spesielle ved denne type assay, beskriver vi en detaljert video-protokoll for å studere endonucleolytic spalting ved spalting / poly (A) mRNA-maskiner av forløpere in vitro. Vi beskriver hvordan å forberede kompetente atom ekstrakter, generere radiomerket RNA underlag, utføre spaltningsreaksjon, og analysere og tolke resultateting produkter. Figur 1 viser et eksempel på substrat-RNA som koder for 3'-enden av HIV-1 pre-mRNA for å brukes for en spalting assay. Den 3 'ende av HIV-RNA genom er satt sammen av mange viktige regulatoriske sekvensene slik som poly (A) område, et G+ U rik region, og bruken element, som alle er nødvendige for effektiv modning av viral mRNA-transkripter 13 . I dette eksempelet vil vi forvente at innspill RNA underlaget å være 338 nt og ved spalting 237 nt. Hvis polyadenylering fikk lov til å forekomme, ville en smøre-produkter holdes mellom 237 og 437 nt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Tilpasning av heftende celler inn Suspension
(Dette er et valgfritt trinn. Opphengs celler generelt ta bedre nukleære ekstrakter, men celler dyrket i plater kan også anvendes.)
- Tilpass adherente celler for vekst i suspensjonen ved hjelp av Joklik modifisert MEM supplert med 5-10% nyfødt kalveserum eller føtalt bovint serum og 1% L-glutamin: penicillin-streptomycin. Overfør cellene i spinnerflasker med et filterlokk ved 37 ° C med 8% CO2.
- Ved tilpasning celler, starter med 100 ml i en 500 ml spinnerkolbe. Opprettholde et minimum 0,3 x 10 6 celler / ml og erstatte medium hver 1-2 dager før den riktige veksten er oppnådd (vanligvis 2-6 uker). Når tilpasset, bør HeLa celler i suspensjon doble ca hver 24 time. MERK: Under bearbeidelsen fasen, vil det ta litt tid for cellene å vende tilbake til sin normale dobling rate.
- Opprettholde cellene i et hitetet i 0,5-0,8 x 10 6 celler / ml i det ønskede sluttvolum (typisk 1-10 L)
- Cellene er vanligvis høstet ved mid log fase (omtrent 0,5 til 0,65 x 10 6 celler / ml og> 90% levedyktig). Bruk av passende størrelse spinnerkolbe for den ønskede mengde av kulturmediet.
2. Nuclear Ekstrakter
- Buffer og reagensklargjøring
MERK: Ekstraksjoner er utført etter en modifisert Dignam et al (1983) 14 atom ekstrakt prosedyre..- Forbered 1X fosfat saltvann, buffer A, buffer C, og buffer D (Tabell 1) dagen før du fortsetter med ekstraksjon og oppbevar ved 4 ° C.
MERK: Høyere avkastning er vanligvis oppnås med nylagde buffer; er imidlertid buffer stabil i flere uker. Det er viktig at alle buffere, apparater og utstyr er forhåndskjølt og holdt kaldt for helheten av ekstraksjon.Bruk et kaldt rom for så mange skritt mulige og / eller holde alt på is. Legg DTT og PMSF umiddelbart før bruk.
- Forbered 1X fosfat saltvann, buffer A, buffer C, og buffer D (Tabell 1) dagen før du fortsetter med ekstraksjon og oppbevar ved 4 ° C.
- Samle og Vaske Cells
- Hell celler i fire 250 ml koniske flasker og sentrifuger ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C i en sentrifuge med en svingende eller en rotor med fast vinkel. Dekanter supernatanten og legge til en annen 250 ml cellekulturmedium til hver flaske. Gjenta spinner til alle cellene er pelletert.
- Resuspender kombin endelige pellets i totalt 250 ml av iskald PBS og bassenget inn i en 250 ml konisk flaske. Spin cellene ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C i en svingende spann sentrifuge.
- Hell av supernatanten og cellepelleten suspenderes i iskald PBS slik at totalvolumet ikke overstiger 50 ml. Løsne pellet via pipettering og overføring til en 50 ml konisk sentrifugerør.
- Spin cellene på nytt ved 500 x g i 6 minutter ved 4 ° C i en svingende spann sentrifuge. Hell av overståendet og estimat og merk cellen pellet volum (CPV) så nøyaktig som mulig. Bruk vann i en egen tilsvarende rør, for sammenligning, hvis pelleten er lavere enn volum markeringene på røret.
- Cellelysis
- Legg DTT til buffer A. Resuspender pelleten i buffer A med fem bind av estimerte CPV. Pipette for å bryte opp pelleten, og inkuber på is i 10 min.
- Spin cellene ved 931 xg i 10 min ved 4 ° C i en svingende spann sentrifuge.
- Aspirer forsiktig supernatanten stedet for dekantering. Pelletsvolumet burde ha økt omtrent to ganger i størrelse på grunn av hevelse i cellene.
- Tilsett 1 CPV med buffer A til cellene. Forsiktig bryte opp pelleten, og fjerne en liten alikvot (ca. 50 mL) til et mikrosentrifugerør på is. Overfør resuspenderte celler legges i en passende Douce-homogenisator (vanligvis 15 ml størrelse) avkjølt på is.
- Lyse cellene med 12-15 langsom, men jevn slag av en type B (TIGht) stampe. Fjerne en liten aliquot av lysatet og undersøke under et mikroskop for fullstendig lysis (intakte små mørke kjerner, sammenlignet med svellede celler) ved trypan blå farging. Intakte celler vil være klart). Fortsett homogenation inntil 90% lyse oppnås og stoppe her, kan løpet douncing negativt påvirke kvaliteten på atom ekstrakter.
- Overfør lysatet inn Ultraclear ultrasentrifugerør rør og merk det totale volumet. Balanse ved veiing rørene og spinn ved 1069 xg i 10 min ved 4 ° C.
MERK: ultrasentrifuge anvendes på dette trinn til tross for den lave sentrifugeringshastighet, fordi det samme røret blir spunnet ved høyere hastighet i neste trinn. Denne spinn vil gi en forholdsvis tett pellet som dekker bunnen av røret med cloudier supernatanten ovenfor, som kan samles og brukes til cytosoliske S100 ekstrakter. Hvis det er en synlig lipid-lag på toppen av røret, kan den fjernes. - Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og overføre den til anoth.. eh tube Unngå å forstyrre den kjernefysiske pellet MERK: Det vil være viktig å vite den endelige volum av supernatant for å kunne fastslå pakket atom volum (PNV).
- Utarbeidelse av Nuclear Extract
- Når supernatanten ble forsiktig fjernet, respin det rå kjerneekstrakt pellet ved 25 453 xg i 15 min ved 4 ° C i samme rør.
- Fjern de rester supernatanten (det bør være en liten mengde klar væske) og legge den til den forrige supernatant samling. Mål det endelige volum av supernatanten. Beregn PNV ved å subtrahere dette volum fra det totale volumet av den opprinnelige lysat som tidligere angitt. Alternativt, hvis pelleten er stor nok, dets volum kan bli estimert ved å sammenligne med tilsvarende volum av vann i et identisk rør.
- Tilsett 1 PNV volum av buffer C (omtrent 1 ml / ml celler). Løsne forsiktig pellet med en pipette tips og overfør til en hensiktsmessig siZed Douce-homogenisator. Ved å bruke samme homogenisator som før, prerinse homogenisatoren med sterilt avionisert vann.
- Resuspender pellet med ~ 5-10 slag via en Douce-homogenisator ved hjelp av en stram stampe.
- Overfør lysatet homogeniseres atom i et avkjølt rør, og bland ved inversjon i 30 min ved 4 ° C. Hvis volumet er stort nok, agitere ved hjelp av en magnetisk røreplate og rørestaven.
- Overfør lysatet til en ny ultraklar sentrifugerør og rotere ved 25 453 xg i 30 min ved 4 ° C. Pelleten skal være kompakt. Rundt 5 minutter før spinningen er fullført, hydrat dialyse kassetter eller rør som har en egnet molekylvekt cut off (MWCO) (for eksempel 7000 kDa).
- Fjern supernatanten (atom utdrag) fra røret i et avkjølt konisk rør ved hjelp av en overføring pipette deretter fortsette med dialyse.
- Dialyse
- Sprøyt ekstrakter inn hydrerte dialyse kassetter som per produsentenss instruksjoner og dialyser den nukleære ekstrakter med 500 ml av buffer D 50 i 1 time ved 4 ° C under omrøring.
- Sett buffer med 500 ml frisk, iskald Buffer D 50 og dialyser i ytterligere 4 timer ved 4 ° C. Dette 4 timers trinnet kan bli delt inn i to to t endringer i stedet.
- Fjern ekstraktene fra dialyse kassetten og overføre til kjølte rør. Spinn ekstrakter for 5 min ved 1500 xg ved 4 ° C.
- Delmengde ekstrakter i kjølte, Eppendorfrør og knipse fryse i flytende nitrogen (50-100 mL per porsjon). Oppbevares ved -80 ° C for senere bruk.
Tre. RNA Probe Synthesis
- Mal Forberedelse
MERK: Maler anvendt for transkripsjon kan være PCR-fragmenter eller plasmider som inneholder en T7-eller SP6 promoter oppstrøms og umiddelbart tilstøtende til den ønskede probe-sekvensen. Plasmid-maler må lineariseres nedstrøms av malen sekvens av interest. Vi bemerket høyere avkastning fra PCR-maler.- Den T7/SP6 promoter kan innføres i løpet av PCR-reaksjonen. Utform den forstand primer med T7/SP6 promoter oppstrøms for mål-sekvensen.
- Forsterke ønsket sekvens i 2-3 reaksjoner per mal via PCR per produsentens anvisninger ved hjelp av en high-fidelity polymerase.
- Kombiner tilsvarende reaksjoner og rens ved gel-ekstraksjon.
- Sequence PCR produktene for å kontrollere mal nøyaktighet. (Valgfritt)
- RNA transkripsjon med 32 P Merking
- Utføre in vitro transkripsjon fra 1 mikrogram av malen med et kommersielt tilgjengelig utstyrssett som er kompatibelt med den promoter (SP6-eller T7) med følgende modifikasjoner. Bruk 1 pl av ferskt 3000 Ci / mmol [α-32 P] UTP, 0,5 pl 10 mM kald UTP, 0,1 pl 10 mM GTP, og 0,9 pl 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G RNA hetten i et totalt sluttvolum på 20 pl.
MERK: G-cap forbedrer stabiliteten av RNA transkripsjoner i atom ekstrakter (cap: GTP) 10:01 ratio. Den kalde UTP blir tilsatt for å hindre at 32 P-UTP fra å være den begrensende reagensen. - Syntetisere en RNA størrelse stigen som er omtalt ovenfor uten G cap. Kommersielle maler er tilgjengelige for å generere den RNA størrelse markør.
- Inkuber transkripsjonsreaksjoner ved 37 ° C i 1 time (for SP6 bruk 40 ° C). Etter fullført, utfører DNase fordøyelse av malen i 15 min ved 37 ° C.
- Etter fordøyelse, tilsett 1 pl 0.5 M EDTA og 5 pl av lastebuffer II til RNA-substrater. Legg 20 mL lasting buffer II til markør.
- Varm opp RNA-markør og prober ved 95 ° C i 3 min og deretter plasseres på is.
- Utføre in vitro transkripsjon fra 1 mikrogram av malen med et kommersielt tilgjengelig utstyrssett som er kompatibelt med den promoter (SP6-eller T7) med følgende modifikasjoner. Bruk 1 pl av ferskt 3000 Ci / mmol [α-32 P] UTP, 0,5 pl 10 mM kald UTP, 0,1 pl 10 mM GTP, og 0,9 pl 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G RNA hetten i et totalt sluttvolum på 20 pl.
- Polyacrylamidgel Casting / Probe elektroforese
- Tilbered en L på 6% polyakrylamidgel (PAGE) blanding, og 400 ml 10% PAGE. For at 6%, bland 150 ml 40% 19:01 akrylamid: bis-acrylamide med 100 ml 10X Tris / borat / EDTA (TBE) og 460 g urea. Ta opp til 800 ml med sterilt avionisert vann og røre på en kokeplate mens søknad lav varme (rundt 50-80 ° C). Komplett til en L med avionisert vann.
MERK: Reaksjonen er endoterm. Varme fremmer oppløsning av urea. Fjern fra varme så snart urea er oppløst og bringe løsningen på en L med deionisert vann. Alternativt omrør ved romtemperatur over natten; for mye varme kan initiere polymerisasjon. - Beskytt PAGE mix fra lys med aluminiumsfolie og oppbevar ved romtemperatur. De HOVED mikser kan være forberedt på forhånd, og er stabilt i flere måneder.
- Forbered 400 ml 10% PAGE blanding ved å kombinere 100 ml av 40% 19:01 akrylamid: bis-akrylamid, 40 ml av 10x TBE og 184 g urea. Etter at urea oppløses, bringe opp til 400 ml med avionisert vann.
Alternativt, forberede en 20% 19:01 akrylamid løsning og en 0% akrylamid løsning with buffer og urea bare; Disse kan deretter blandes i hvilket som helst forhold for å gi en hvilken som helst andel mellom 0 og 20%; urea alltid er for treg til å løse seg opp. - Forbered 10-50 ml 10% ammoniumpersulfat (APS) oppløsning i sterilt avionisert vann, avhengig av hvor mange geler som skal felles.
- Vask 20 cm x 22 cm glass gel plater med 70% etanol (EtOH). Tørk med store lofri våtservietter.
- Vask det faste plate med 1 ml av 5 N natriumhydroksyd (NaOH) og deretter vask igjen med 70% EtOH. Coat hakk plate med gel frastøte silikonsiering løsning ved å tørke av platen med en mettet liten Kimwipe.
- Monter platene ved å plassere vanlig plate på tom pipettespissen boks eller et stykke isopor å heve det fra bordet med den rengjorte siden vendt opp. Lå 0,4 mm avstandsstykker på kanten av hver langside.
- Plasser forsiktig tannet plate over avstandsstykkene, slik at den belagte side vil være på innsiden av gelen. Bruk en barberhøvel eller annen tynn instrument for å skifteavstandsstykkene for en spyle innretting på bunnen og sidene av de gel-plater og deretter sikre med bindemiddel klemmene på hver side av de gel-plater over avstandsstykker.
- Forbered 30 ml 8% PAGE blanding per gel ved å blande 15 ml av 10% og 6% blander i et 50 ml rør. Raskt legge 300 pl 10% APS, etterfulgt av 30 pl N, N, N ', N'-tetra-methylethylenediamine (TEMED) til 8% gel blanding.
MERK: Passende gel prosenter for individuelle probe størrelser bør velges av eksperimentator. - Cap og invertere 2x og hell blandingen over i tannområdet gelplatene. Vær sikker på å lett heve platene for hånd, og å opprettholde en jevn helle til siden blandingen begynner å dryppe ut av bunnen.
- Senk platene tilbake til nivå og umiddelbart sette inn store 8-brønn rektangel kam for 0,4 mm x 20 cm gel. Små bobler nær bunnen vil ikke påvirke driften, men det bør ikke være noen bobler i brønnene.
MERK: </ Strong> Plasser papirhåndklær på bordet under bunnen og toppen av gel for å fange opp eventuelle utslipp under støping. - Tillat blandingen PAGE å polymerisere i minst 30 min.
- Overfør det polymeriserte gel til det kalde rom og montere elektroforese apparat. Legg kaldt TBE buffer til merkene på de øvre og nedre kammere.
- Fjern kammen og bruke en barberhøvel for å fjerne eventuelle rester. Sett gel i apparaturen, og å bruke et bindeklips for å holde platen i den forsegling. Legg kaldt TBE til øverste kammer før det strømmer inn i platene.
- Vask brønnene med en 30 ml syringe/21 G 1-1/2 "nål fylt med kaldt TBE rett før du legger de merkede RNA underlag. Plasser en aluminiumsplate på baksiden av glasset for å hjelpe til med fordelingen av varme under kjøring.
- Laste 3 mL av markøren, og det hele 25 pl transkripsjonsreaksjon av hver RNA-substrat i separate brønner. Legg igjen en brønn mellom tilsvarende størrelse transkripsjoner til pRevent krysskontaminering. Bromfenol blå og xylen cyanol fargestoffer i laste buffer kan bli brukt til å anslå størrelsen migrering på gelen.
- Kjør gelen ved en konstant wattforbruk som passer for størrelsen på RNA-prober (f.eks 25 watt i 2 timer for prober på 600 nt).
- Tilbered en L på 6% polyakrylamidgel (PAGE) blanding, og 400 ml 10% PAGE. For at 6%, bland 150 ml 40% 19:01 akrylamid: bis-acrylamide med 100 ml 10X Tris / borat / EDTA (TBE) og 460 g urea. Ta opp til 800 ml med sterilt avionisert vann og røre på en kokeplate mens søknad lav varme (rundt 50-80 ° C). Komplett til en L med avionisert vann.
- Merket RNA ekstraksjon og rensing
- Etter elektroforese, omhyggelig drenere den øverste kammer av gel apparatur. Det meste av radioaktiviteten vil være i gelen, og den nederste kammer; Imidlertid kan den øvre buffer inneholde noe radioaktivt materiale.
- Bruk en skuff for å transportere gel hvis du flytter til et annet radioaktivt materiale arbeidsområdet. Fjerne avstandsstykkene forsiktig ved å trekke den utstikkende stykke sideveis vekk fra gelen.
- Forsiktig skille platene. Gelen bør holde seg til den platen som ikke ble behandlet med silikon. Legg et stykke plastfolie over gel og glassplate.
- Plasser en glogos autorad markør klistremerke på plast brytes over en Areen av gel som er fri for alle prøver.
- I et mørkt rom, plasserer et stykke autoradiography film over hele platen og utsett i minst 1 min. Utvikle filmen.
- Plasser utviklet film på en lys overflate. Deretter plasserer plast side av gel ansiktet ned på film og justere autorad markør fra gelen til den eksponerte markør på filmen. Når de er rettet, kan du bruke en sort tusj for å markere plasseringen av de ønskede band på glasset.
MERK: Alternativt justere gels / film på følgende måte for å kutte ut RNA band. I det mørke rommet, plasser innpakket gel på en tabell, plasserer filmen på toppen av den og legger en kassett (eller en bok, etc.) på toppen av stykke film. Flick på lysbryter i rommet en kort stund, og deretter slå hvis off. Dette vil "forblits 'filmen genererer en skisse av alle brønnene på filmen på grunn av trykket / beskyttelse mot lys at kassetten på toppen gir. Dette gjør det enkelt å rette inn film på gelen og kuttetut bandet uten å bruke fluorescerende markører. - Fjern forsiktig plastfolie og bruke en fersk skalpell eller barberblad for hver RNA underlaget og avgiftsdirektoratet båndene fra gelen og sett inn i separate 1,7 ml mikrofugerør. Bruk en nutator for milde agitations under eluering.
- Til 500 pl av RNA-elueringsbuffer (0,5 M ammonium-acetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) til hvert rør. Kort sentrifuger å senke gel fragment. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 3-16 timer, avhengig av størrelsen probe.
- Overfør hele 500 pl av eluert materiale inn i et nytt rør. Unngå å overføre noen gel stykker som de vil interferere med rensing. Legg 1 mL av glykogen (20 mg / ml) sammen med 500 pl kald, surt fenol-kloroform (for RNA).
- Kort vortex, bør løsningen vises skyet. Spin ved romtemperatur i full fart (~ 16 000 xg) for 5-6 min.
- Nøye transfer toppen (vandig) Laget til nye rør samle så mye som mulig og unngå eventuelle rester fra den inter. Til en lik mengde av kloroform til den overførte vandige lag. Gjenta trinn 3.4.10 og overføre den øvre (vandige) lag i et nytt rør. Tilsett 1 ml iskald 95 til 100% EtOH til det oppsamlede materiale. Inkuber ved -80 ° C i 10 min. MERK: RNA kan bli lagret over natten om ønskelig.
- Pellet RNA i 30 min ved 16.000 xg ved 4 ° C. Hell forsiktig av supernatanten til en radioaktivt avfallsbeholder og tilsett 1 ml iskald 70% molekylær klasse EtOH til hver pellet.
- Pellet RNA ved 16.000 xg i 15 min ved 4 ° C, hell av supernatanten, spinne på nytt i 1 minutt, og fjerne eventuelle gjenværende EtOH via pipette og la ved romtemperatur med dekslene åpnes for å muliggjøre fordampning av eventuelt gjenværende EtOH.
- Suspender pellets i 20-30 mL av RNase-fritt vann. Merket RNA kan bli lagret ved -80 ° C.
MERK: En radioaktiv undersøkelse meter bør brukes gjennom hele utvinning prosedyre for å verifisere at merket RNA ikke har gått tapt i løpet av noen trinn.
- Kvantitering av merket RNA for et pre-mRNA 3 'mRNA spaltningsreaksjon
- Tilnærmet molariteten av cleavage underlag ved hjelp av følgende prosedyre.
- Ta for eksempel 1 pl av 3000 Ci / mmol [α-32 P] UTP og 10 mCi / ml. (På etiketten referansedato, vil den kjemiske konsentrasjonen av denne bestanden løsningen være 3,3 mikrometer UTP. Før denne datoen det er høyere og en halveringstid (~ 13 dager) etter at datoen er det ~ 1.6 mm, osv.) Det merkede UTP bidrag til den endelige reaksjonskonsentrasjon er vanligvis ubetydelig når en endelig kald UTP konsentrasjon over UTP K m benyttes. T7 RNAP K m for UTP er 114 mm 15.
- Fortynn o 1 mL i 39 ul vann. Deretter legger en mL av fortynnet [α-
- Fortynn 1 mL av hver merket RNA-substrat i separate ampuller med en lik mengde av scintillasjons-væsken som brukes i det foregående trinnet. Sørg for å ha en ampulle med bare scintillasjonsvæske å beregne bakgrunn. Kvantifisere radioaktiviteten i en scintillasjonsteller.
- Multipliser antall pr min (CPM) for [α-32 P] UTP prøven ved 40 å faktor i den første fortynning og trekke bakgrunnen innhentet av scintillasjonsvæske alene. Multipliser tellingene for hver RNA sonde ved mengden av RNase-fritt vann (20-30 pl) brukt til å resuspendere RNA sonder. Dette gir en total cpm av det rensede RNA.
Eksempel:. Max kpm = (kpm [α-32 P] UTP - bakgrunn) x 40 Merket RNA Eksempel 1 = 20 000 kpm x 20 = 400 000 kpm (hvis 20 mL brukes for resuspensjon) - Hvis en mengde som er annet enn en fil [α-32 P] UTP ble brukt til å lage utskrifter, da faktor dette volumet i den endelige cpm av [α-32 P] UTP ved å multiplisere cpm for [α-32-P] UTP prøven av mengden brukt.
Eksempel: 2 ul av [α-32 P] UTP blir brukt til å lage utskrifter. Den beregnede kpm for en pl [α-32 P] UTP er 500 000 kpm. Multipliser 500 000 * 2 = 1000000 kpm - Fordel beregnet merket RNA kpm av den beregnede kpm for [α-32 P] UTP alene. Dette vil grovt estimere prosenten av merket UTP innarbeidet.
Eksempel: 400 000/1000000 = 0,40 eller 40%innlemmet - Siden et enzym ikke kan skille mellom isotoper, er den samme prosentandel av merket og umerket UTP innlemmes i RNA ved transkripsjon. Beregn mengde kaldt UTP i mol som er lagt inn i transkripsjonsreaksjon (0,5 mL av en 10 mM løsning = 5,0 x 10 -9 mol UTP).
- Multipliser mol UTP i reaksjonen ved prosent inkorporert (kjent fra den varme UTP telling over), deretter dele det med antall uridines i RNA-sekvens.
Eksempel: 5,0 x 10 -9 mol UTP x 0,40 = 2 x 10 -9 mol UTP
2 x 10 -9 føflekker UTP / 73 U per avskrift = 2,7 x 10 -11 mol RNA - Konverter mol av RNA til molaritet ved å dividere volumet av det gjenopprettede RNA resuspendering løsning.
Eksempel: 2,7 x 10 -11 mol RNA / 20 mL = 1370 nM RNA. For T7 RNAP transkripsjoner laget fra ca 1 mikrogram lineærsert plasmid og resuspendert i 20 ul vann, verdier på 200 til 1400 nM er typiske.
NB: Den molare konsentrasjon av RNA blir brukt til å sikre at det endelige pre-mRNA substratkonsentrasjon i in vitro spaltningsreaksjon er mindre enn 5 nM pr spaltningsreaksjon. Cleavage effektivitet kan reduseres hvis den RNA-konsentrasjonen heves vesentlig over 5 nM.
- Tilnærmet molariteten av cleavage underlag ved hjelp av følgende prosedyre.
4. 3 'mRNA spaltningsreaksjon
- Spaltningsreaksjon reagensklargjøring
- Klargjøre alle reagensene som er nødvendige for spaltning reaksjonen. Gjør 10% polyvinylalkohol (PVA) ved å koke vann og sakte legge riktig mengde PVA pulver. 10% PVA blir viskøs og tar tid å oppløse. Oppbevares i romtemperatur eller -20 ° C.
- Forbered en M kreatinfosfat (CP) og oppbevar ved -80 ° C. Det er viktig å bruke en M CP som er mindre enn 4 måneder gamle.
- Forbered en M DTT og butikkved -20 ° C. Lag en frisk 0,2 M DTT fortynning fra en M DTT like før du gjør spaltningsreaksjon.
- Forbered ETS (cleavage stop-løsning): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS. Oppbevares i romtemperatur.
- Spaltningsreaksjon
- Varm opp merket RNA til 80 ° C i 2 min og deretter plasseres på is.
- Forsiktig vortex og deretter spinne 10% PVA i full fart i 2-3 min for å fjerne boblene.
- Master mix 1: For en enkelt reaksjon, kombinere 3,125 mL 10% PVA, 0,625 ul 1 M CP, 0.25 pl 0.5 M tRNA, 0,125 mL 100 mM dATP, 0,13 mL 40 U / pl RNase-inhibitor, 0.25 pl 0.1 M EDTA pH 8 , 0,1 pl 0,2 M DTT, og 0,645 ul RNase-fritt vann. Tilsett 5,25 mL mester mix en per rør på is.
- Master mix 2: Bruk 6,25 mL / omsetning av nukleære ekstrakter ved konsentrasjoner høyere enn 2 mg / ml. Atom ekstrakter kan fortynnes med buffer D 50 hvis needed.
- Kombiner de 6,25 mL av atom ekstrakt med tidligere utlevert 5,25 mL av mester mix 1. 1 mL av merket RNA underlaget som er fortynnet til 50 nM Legg til. Alternativt kan RNA bli inkludert i Master mix 1, forutsatt at det tilsettes etter at RNase inhibitor, DTT og tRNA. MERK: Bruk <5 nM av den merkede RNA-substratet.
- Forsiktig vortex og rask spinn hver prøve å fjerne boblene. Inkuber ved 30 ° C i opp til 2 timer, men en tid selvfølgelig bør utføres for optimale resultater. Lengre inkubasjoner kan øke bakgrunn degradering.
- Proteinase K Fordøyelse og rensing
- Fjern prøvene fra varmen og tilsett 182,5 mL av ETS stopp løsning til hver reaksjon. Tilsett 5 ul av 20 mg / ml proteinase K, og inkubere prøvene ved 37 ° C i 10 min.
- Ekstraher den RNA ved å tilsette 1 volum (200 ul) av syre fenol-kloroform, 1/10 volum (20 ul) av 3 M natriumacetat, og 1 pl av 20 mg / ml glykogen. Fortsett med uttak som er beskrevet i avsnitt 3.4.9-3.4.14.
- Når RNA ekstraksjon er fullført, må du huske å fjerne alle rester av EtOH. Resuspender pellet i 8 mL av laste buffer (90% formamide, 10 mM EDTA, med bromfenolblå (BFB) (og eller Xylen cyanol Blå)). Prøvene kan bli lagret ved -80 ° C, eller videre med gel-elektroforese.
- Spaltningsreaksjon Elektroforese
- Forbered en 6% akrylamid gel som tidligere nevnt i § § 3.3.1-3.3.17 med noen modifikasjoner. Bruk 20 cm x 42 cm sekvense gel plater med to bindemiddel klipp på hver langside. Bruk en 32-godt kam og forberede 40 ml gel mix.
- Laste gel med 3 mL av markør og 5 mL av hver prøve. Optimal elektroforesegelene innstillinger i henhold til pre-cleavage og kløyvde produktstørrelser.
- Når elektroforese er fullført, følger avsnitt 3.4.1-3.4.3 </ Strong> for å demontere gel. I stedet for å plastfolie, skjære et stykke av filterpapir til størrelsen av gelen platen og nøye plassere den på den ene side av det eksponerte gel.
- Trykk på filterpapiret godt til gel, deretter snu over platen, slik at filterpapiret er på bunnen og glasset er på toppen. Trykk fast glasset ned på bordet for å sikre at gelen er gripende filterpapiret jevnt.
- Sakte skrelle filterpapir, som skal ha gelen er festet til det, fra en av de korte endene inntil alt av filterpapir med gel festet fjernes fra glassplaten.
- Dekke utsatte gel side med plastfolie. Tape plastfolie til filterpapiret.
- Plasser gel på en gel tørketrommel med filtersiden mot sugesiden. Tørr i 15 minutter eller inntil gelen er fullstendig tørr.
MERK: Hvis en gel dryer ikke er tilgjengelig, kan røntgenfilm benyttes til å visualisere RNA-båndene. Eksponering bør utføres i en light tett kassett med intensiveskjerm ved -80 ° C. Eksponeringstiden bestemmes empirisk. Forsiktig: lave prosent akrylamidgeler kan sprekke ved frysing. - Gelen kan nå brukes til å eksponere filmen eller benyttes med en fosfor-imager. Eksponeringstiden er avhengig av styrken av merket RNA. Utgangspunktet en 24-timers eksponering kan anvendes. Ved hjelp av film, utsettes ved -80 ° C med en intensive skjerm og tillat blandingen å oppvarmes til romtemperatur før utviklingen.
- Måle forholdet mellom spaltet og un-spaltet RNA i hver prøve for å kvantifisere spalting effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater av et assay spalting av RNA-poly (A) områder av HIV-1 (figur 2). Vi kan observere uncleaved RNA-substrat, som er den langsomste migrere bånd på toppen av gelen. Den spesifikke spaltet produkt er den mest intense kortere fragment band som løper raskere i gelen med forventet størrelse, og er spesielt fraværende fra spalting analysen av mutpoly (A) kontroll som inneholder en punktmutasjon i polyA-sekvens (mutPolyA) RNA substrat. Nedbrytingsprodukter av inngangs underlaget kan noen ganger observeres. Kvantifisering av spalting aktiviteten kan bli bestemt ved densitometrisk plott av forholdet mellom uncleaved å spaltes RNA normalisert til 100% av uncleaved RNA.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av det HIV-pre-mRNA 3 'end prosesserings substrater, og forventede produktene av in vitro-spalting og polyadenylerings-reaksjoner. spaltningssetet, den dinukleotid-CA-, ligger 25 nt nedstrøms fra polyA området AAUAAA. LTR regioner: U3 (unik 3 'sekvens), R (gjentatt sekvens), og U5 (unike 5' sekvens).
Figur 2. (A) poly (A) område spalting. 32 P-merket RNA som inneholdt poly (A) av HIV-1 og en punktmutasjon av poly (A)-signal som opphever spalting (mutPolyA) ble inkubert i nukleære ekstrakter av HeLa-S3-celler eller BSA som en negativ kontroll. Uthevet pil viser 5 'spaltes produktet. Den 3 'fragment ofte renner av gelen eller nedbrytes og ikke alltid er synlig. (B) densitometrisk plott av spalting virkty uttrykt som et forhold mellom uncleaved å spaltes RNA normalisert til 100% av uncleaved RNA.
| Buffer A (100 ml) | 10 mM Tris (pH 7,9), 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0,5 mM ditiotreitol (DTT). | Legg DTT like før bruk av buffer A i løpet av ekstraksjonen. Legg 1 yl 1 M DTT per 1 ml av buffer A. |
| Buffer C (50 ml) | 20 mM Tris (pH 7,9), 25% (v / v) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,5 mM DTT, 0,5 mM fenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF). | Legg en proteasehemmer cocktail tablett om morgenen av ekstraksjon. |
| Buffer D 50 (2-4 L) | 20 mM Tris (pH7.9), 20% (v / v) glyserol, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 50 mM ammonium-sulfat. | HEPES-KOH, kan anvendes i stedet for Tris i buffer A, C og D. |
| 0,5 M Amonium-acetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) | Oppbevares i romtemperatur. | |
| Stopp Buffer (ETS) | 10 mM Tris (pH8.0), 10 mM EDTA, 0,5% SDS | Oppbevares i romtemperatur. |
| Cleavage Loading Buffer | 90% formamide, 5 mM EDTA PH8, 0,025% bromfenolblå | Oppbevares ved -20 ° C. |
Tabell 1. Sammensetning av buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in vitro-pre-mRNA 3 'spaltningsreaksjon, utført i HeLa celle-ekstrakter eller atom med spalt-ningsfaktorer fraksjonert fra disse ekstrakter, har muliggjort identifisering av kjernen spalt-ningsfaktorer og deres hoved komplekser 16-21. Mange flere proteiner knyttet til disse faktorene har nylig blitt identifisert 22, og in vitro reaksjon kan fortsette å belyse hvordan disse proteinene bidrar til reaksjonen. Kanskje på grunn av reaksjonen in vivo synes å være cotranscriptional 23, eller fordi enkelte medvirkende faktorer kan gå tapt under ekstraksjon og dialyse, er effektiviteten ofte dårlig, og sjelden mer enn 30% spalting er oppnådd. I tillegg, kan reaksjonen effektivitet plutselig falle fra dag til dag uten tilsynelatende grunn. Derfor er det viktig å sette hvilke fremgangsmåten er den mest kritiske, særlig ved forsøk på å tilpasse reaksjon på endring eller viralt infisert HeLa cells, til andre celletyper, eller til nye substrater.
Uten tvil, kvaliteten på ekstrakt og friskhet av in vitro transkribert RNA er viktig, så er behovet for å arbeide under Scrupulously RNase-frie forhold. Helsen til cellene på det tidspunkt de er høstet for utvinning er også viktig. Cellene skal vises sunn, bør de bli doblet på mindre enn 24 timer, bør de være i eller nærmer seg midten log fase, og det bør være noen døde celler eller annen uforklarlig rusk. Selvfølgelig bør cellene ikke være forurenset av mycoplasma-eller andre bakterier. Substratet bør ikke gjøres med en for høy spesifikk aktivitet, da dette kan føre til synlig nedbrytning.
Når et stort nok sekvens på hver side av kløyvingssetet er vurdert, og alternative polyadenylering er rede for, antall forskjellige poly (A) sekvens-signaler i det humane genom uten tvil overstiger antall gener 24 25. Kombinasjonen av en svak poly (A)-signal-sekvensen med andre enn standard HeLa-celler celler kan være frustrerende, og det er bedre først å bruke et sterkt substrat med nye celler, eller umodifiserte HeLa-celler med et potensielt svakt polyA substrat.
Selv etter å ha så mange år med vellykket bruk, er det fortsatt mindre hemmeligheter i forbindelse med in vitro-3 'spaltningsreaksjon. For eksempel, hvorfor er kreatin fosfat trengs? Det har vist seg at det opprinnelige grunnen for å inkludere det - for å regenerere ATP pool - ikke er gyldig 26. Interessant, kan det utelates med bare delvis tap av aktivitet når det nukleære ekstrakteranvendes, men blir progressivt mer nødvendig som ekstrakt fraksjoneres i delvis rensede cleavage faktorer som brukes til å rekonstituere reaksjonen. Faktisk fosfocholin, et annet lite molekyl med en fosfat-gruppe og en positivt ladet amin, men sannsynligvis ikke har noen in vivo rolle i reaksjonen, er blitt funnet å være mer effektive enn kreatinfosfat, i det minste i den rekonstituerte reaksjons 27.. PVA er en annen bestanddel som kravet er ikke fullt ut forklart. Det antas å være en trenging middel, som fører til en effektiv økning av spalting faktor-konsentrasjon, men også andre samles midler, slik som polyetylenglykol, fungerer ikke på langt nær så godt. Forstå disse faktorene kan føre til økt effektivitet, slik at utvidelsen av metoden til mindre effektiv celletyper og RNA underlag, og kan gi ledetråder til hvordan de ulike faktorene virker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
SV er takknemlig for økonomisk støtte fra NIH K22AI077353 og Landenberger Foundation. KR takknemlig erkjenner midler fra NIH (5SC1GM083754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Celstir flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 position slow speed stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table top centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250 ml conical tubes | Corning | 430776 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal bovine serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-glut:pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M sodium chloride solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium sulfate | Fisher | A702-500 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml |
| 15 ml Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand high fidelity PCR kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% absolute ethanol 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid phenol:chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase inhibitor | Promega | N261B | |
| Polyvinyl alcohol- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable sequencing unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| 20 cm x 22 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| 20 cm x 42 cm aluminum cooling plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| 0.4 mm x 22 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| 0.4 mm x 42 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| 8-well comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| 16-well comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 EA |
| 32-well comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel loading tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μl |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech vacuum pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U.
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S.
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
- Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
