Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Synaptischen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) spielen eine entscheidende Rolle bei der synaptischen Plastizität und Zellüberlebenssignalwohingegen die Aktivierung von extrasynaptischen NMDARs können Neurodegeneration und Zelltod auslösen. Diese Veränderungen hängen von streng kontrollierten / reglementierten Tätigkeit abhängige Genexpression und erfordern daher eine ständige Kommunikation zwischen aktivierten Synapsen oder Dendriten und den Zellkern ^7. Die MAP-Kinasen ERK1 / 2 Effektoren der synaptischen NMDARs Signalisierung und in NMDAR-Aktivierungs-induzierte Genexpression beteiligt, während Signalisierung über extrasynaptischen NMDAR keine oder eine hemmende Wirkung auf ERK1 / 2 Aktivität ^8,11.

Es gibt eine Reihe von Proteinen, die Shuttle zwischen dem distalen Dendriten und den Zellkern gezeigt wurden. Viele dieser Proteine ​​enthalten ein Kernlokalisierungssignal und aktiv an Mikrotubuli in einer Dynein und Importin-abhängige Weise in den Zellkern transportiert ^6,9. Interestingly, einige dieser Botenstoffe nur Transit an den Kern in Reaktion auf spezifische Stimuli synaptische. Beispielsweise retrograden Transport von cAMP response element binding protein 2 (CREB2) durch chemische LTD aber nicht LTP ¹² induziert. Lokalisierten NMDAR-abhängige synaptische Stimulation treibt CREB-regulierten Transkriptions Coaktivator (CRTC1) in den Zellkern, einer Translokation, die in langfristigen hippocampalen Plastizität ⁴ beteiligt ist. Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein Bote Jacob transloziert in den Zellkern, nachdem beide, synaptic und extrasynaptischen NMDAR-Aktivierung und regelt CREB abhängigen Gentranskription ^5. Die synaptische oder extrasynaptischen Ursprung des Signals in einer posttranslationalen Modifikation von Jacob kodiert. Synaptische Aktivität induziert ERK1 / 2 abhängige Phosphorylierung von Jacob an einem entscheidenden Serin an Position 180 (pJacobS 180), die eine Voraussetzung für die anschließende Translokation in den Zellkern in der Grund Hippocampus Kultur ist. Außerdem habe ichn CA1 Neuronen des Hippocampus akuten pJacobS 180 transloziert in den Zellkern nach Schaffer Sicherheiten LTP aber nicht LTD ^1,10. PS-180 Jacob führt zu einer erhöhten Expression von Genen Plastizität und das Gen-Expression zurückführt, die synaptische Funktion. In scharfem Kontrast dazu Jacob, die in den Zellkern transloziert nach extrasynaptischen NMDARs Aktivierung nicht an Ser180 phosphoryliert und kann mit verschiedenen Protein-Komplex in den Zellkern bewirkt in Verbindung gebracht werden "CREB abgeschaltet" und ein Zurückziehen der synaptischen Kontakte ^10.

Die meisten veröffentlichten Studien über die Kernimport synapto-Kernprotein Messenger in dissoziierten neuronalen Primärkulturen durchgeführt worden. Daher wäre es interessant zu sehen, ob solche Erkenntnisse in physiologisch relevanter Bedingungen mit Hippocampus wiedergegeben werden, wo neuronale Konnektivität und Funktion sind viel besser erhalten. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Beurteilung der LTP-dependent nukleäre Translokation von Protein Boten durch Immunoblotting. Dieses Verfahren ist auch für die Analyse Aktivität abhängige Phosphorylierung von Proteinen in einer rohen Kernfraktion. Insbesondere beinhaltet das aktuelle Protokoll Vorbereitung der akuten CA1 des Hippocampus, Induktion, und die Aufnahme von LTP. Als nächstes wird CA1 Region mikroskopisch seziert, um den angeregten Bereich zu isolieren. Wir kombinierten und modifizierte das Protokoll für die Isolierung durch Atomkern CellLytic Extraction Kit mit Änderungen von Zhao und Kollegen ¹⁷ eingeführt wird. Das optimierte Verfahren umfasst die Lyse von seziert CA1 Regionen in hypotonischen Puffer ermöglicht Zellschwellung und die Freisetzung von Kernen. Zell-Lyse und Kerne Morphologie kann durch mikroskopische Untersuchung festgestellt werden. Urananreicherung wird durch einen kurzen Zentrifugationsschritt erzielt. Immunoblotting-Analyse mit Antikörpern gegen NeuN und NSE2, spezifische Marker für nukleare oder cytosolischen Fraktionen zeigt, dass dieser Ansatz als schneller eingesetzt werdenund reproduzierbare Protokoll, diese subzellulären Fraktionen zu isolieren und sehr labil posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung zu studieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für kleine Gewebeproben, die aus sezierten Bereiche CA1 des Hippocampus und kann vorteilhaft in Kombination Immunhistochemie von Schnitten des Hippocampus verwendet werden.

1. Vorbereitung der akuten Hippocampus von erwachsenen Ratte Gehirn

1. Betäuben Ratten mit Isofluran. ACHTUNG: Führen Sie das Verfahren unter Verwendung eines geschlossenen Exsikkator, nicht einatmen Isofluran. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt.
2. Enthaupten die Ratte, schnell zu isolieren, die das Gehirn, und tauchen es in precarbonated (95% O _2/5% CO ₂ Gasgemisch) eiskalt Gey-Lösung (Zusammensetzung in mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O 0,3 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 11 MgCl ₂ · 6H ₂ O, 0,23 KH ₂ PO _4, 0,8 Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 5 Glucose · H ₂ O, 25 HEPES, 22 NaHCO _3, pH 7,32) 30 min ^1,2,10,16.
3. Entfernen Sie das Kleinhirn und ein Teil des entorhinalen Kortex. Trennen Sie die kortikalen Hemisphären mit einem mittleren sagittalen Schnitt, dann platzieren Sie jede Halbkugel nach unten auf seiner medialen Oberfläche. Danach machenein 50-70 ° Schnitt (50-70 ° quer) entlang der dorsalen Rand jeder Hemisphäre ^13,14.
4. Kleben jeder Hemisphäre mit dem frisch geschnittenen Fläche, auf der Schneideplattform des Schneidesystems. Die Plattform sollte von precarbogenated eiskalten Gey-Lösung abgedeckt werden.
5. Schneiden Sie 350 um 50-70 ° Querschnitten von anterior nach Seite mit einem Vibratom angepasst, um z-Achse Pendeln zu minimieren posterior. Der Hippocampus, entorhinalen Kortex und subicular, sowie die Rinden, die dorsolateralen zum Hippocampus befinden, werden Teil der für Versuche verwendeten Scheiben ^13,14 sein.
6. Übertragen des Hippocampus zu einer U-Form und Art Inkubator eingetaucht und Inkubation für mindestens 2 h bei 32 ° C mit carbogenated künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, enthaltend in mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 1,5 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 1,24 KH ₂ PO _4, 10 Glucose · H ₂O, 27,4 NaHCO _3, pH 7,3) ^1,2,10,16.

2. Positionierung der Elektroden, Baseline-Aufnahme, und die Induktion von LTP

1. Übertragen Sie die Hippocampus-Scheibe zu einem untergetauchten Aufzeichnungskammer unter dem Mikroskop montiert. Perfusion (6-7 ml / min) mit carbogenated ACSF für mindestens 30 min bei 32 ° C aufweist.
2. Bereiten Glaskapillare gefüllt mit Mikroelektroden ACSF (Spitze Widerstand ist 3-5 MQ).
3. Stellen Sie ein Glas-Mikroelektroden mit ACSF in der CA1-Schaffer Sicherheiten Fasern für die Stimulation und in der CA1 Stratum radiatum für fEPSP Aufnahme ^1,2,10 (Abbildung 2) gefüllt. Der Abstand zwischen den Elektroden beträgt ca. 300 um.
4. Evoke Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (fEPSPs) durch Stimulation der Schaffer-Sicherheiten Fasern mit zweiphasigen Rechteckstromimpulse (200 ms / Polarität) in einem Bereich von 3-4 V.
5. Führen Sie die maximale Stimulationstest durch Messung der InPut-Ausgangs-Beziehung und definieren die Stimulationsstärke als 40% der maximalen erhalten fEPSP-Steigungswerte und halten Sie sie während des Experiments konstant.
6. Beginnen Sie mit der Baseline-Aufnahme für mindestens 15 Minuten nach der maximalen Stimulationstest. Messen Sie die Antworten auf Teststimuli jede Minute während des Experiments. Führen Baseline-Aufnahmen mit niedriger Frequenz Stimulation.
7. Nehmen Sie die Grundlinie für mindestens 30 min.
8. Für Late-LTP Induktion gelten Hochfrequenz 100 Hz Tetanisierung aus drei 1 sec Reiz Züge bei 100 Hz mit einer 5 Minuten-Intervall intertrain. Um das Feld der Stimulation innerhalb CA1-Region 5 uM Bicucullin erhöhen kann in 2 min vor Tetanisierung gewaschen werden und sollte unmittelbar nach der letzten Tetanisierung gewaschen werden.

3. Sammlung von Scheiben nach der Induktion von LTP und Snap-Freezing

1. Stop LTP Aufnahme 2 min oder 30 min nach drei Zügen der tetanischen Stimulation induziert Spät-LTP.
2. Sammeln jede Scheibe in einem 1,5-ml-Röhrchen und bei -80 ° C.

4. Isolierung von Kern angereicherten Fraktionen aus der CA1-Region des Hippocampus

1. Nehmen Sie 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit den gefrorenen Scheiben von -80 ° C und halten sie auf dem Eis.
2. 0,5 ml frischem kaltem TBS-Puffer, der Protease (PI) und Phosphatase-(PS)-Inhibitoren, in die Röhre. Inkubation für 2-3 min und Transfer zu einem Stereomikroskop. ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Kittel bei der Arbeit mit PI und PS.
3. Präparieren des Stratum pyramidale CA1-Region des Hippocampus mit Hilfe von zwei Nadeln. Verwenden Sie eine Nadel zum Halten der Scheibe unter dem Stereomikroskop und die zweite Nadel zum Schneiden der CA1-Region.
4. Sammeln Sie die seziert CA1-Regionen von 5 Scheiben (für jede Gruppe) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit 50 ul Lysepuffer (1x hypotonische Lyse-Puffer, enthaltend in mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl _2, 10 KCl, pH 7,9, mit PI und PS). Beachten Sie, dass diese Menge an Material ausreicht, um 2-3 Immunoblots laufen.
5. Homogenisieren gesammelte Gewebe durch sorgfältige Pipettieren auf und ab. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette. Bebrüten das Lysat auf Eis für 5-7 min, damit sich die Zellen zu schwellen.
6. Nehmen Sie 2 ul des Lysates, fallen auf einen Objektträger und visualisieren die Schwellung der Zellen unter einem Hellfeld-Mikroskop. Mit der richtigen Schwellung der Zellen die Zellkerne erscheinen als runde Strukturen intakt.
7. Sammeln Sie 20 ul Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen als "Homogenat Fraktion '. Hinzufügen 8 ul der Denaturierung 4x SDS-Probenpuffer.
8. Zentrifugieren Sie die verbleibenden Lysate bei 11.000 rpm für 1 min.
9. Sorgfältig sammeln Stand von oben ("cytosolische Fraktion), transfer in ein neues Röhrchen und fügen Sie 20 ul 4x Probenpuffer.
10. Das Pellet in 60 ul hypotonischen Puffer und fügen Sie 20 ul 4x Probenpuffer. Diese Fraktion wird als "Kern angereicherte Fraktion" bezeichnet.
11. Homogenisat, zytosolischen und nuklearen angereicherten Fraktionen bei -20 ° C oder -80 ° C für die spätere Immunoblotting gespeichert werden.

5. Semiquantitative Immunoblotting für Synapto-Kernproteine

1. Aufzutauen die Proben und kochen Sie sie für 5 min bei 95 ° C.
2. Take 5 ul von jeder Fraktion und bestimmen die Proteinkonzentration von Amidoschwarz Test oder BCA-Test.
3. Laden gleiche Menge von Proteinproben aus Homogenat und zytoplasmatische angereicherten Fraktionen auf SDS-PAGE. Proben von Kontrolle und LTP Scheiben sollten auf dem gleichen Gel zum direkten Vergleich gesetzt werden.
4. Führen Sie eine Standard-Western-Blot-Verfahren (Nasstransfer wird empfohlen).
5. Sonde die Membranen mit ter Antikörper Wahl. Neuron spezifischen enolase2 (NSE2) und Kernmarker - - NeuN und Actin-Antikörper als Ladekontrolle anschließend die gleichen Blots (oder gleichen Proben parallel laufen) kann mit einem zytoplasmatischen Marker untersucht werden.

6. Datenanalyse

1. Effizienz der Induktion von LTP durch Clampfit Software analysiert werden. Die durchschnittlichen Steigung von Baseline-Aufnahmen wurde mit den Pisten nach Tetanisierung mit Zwei-Wege-ANOVA, p gegen <0,05 wurde als signifikant unterschiedlich. Die fEPSP Steigungswerte wurden in Diagrammen als Mittelwert ± SEM dargestellt,
2. Zur Quantifizierung der Immunoblots, Scannen entweder die autoradiographische Film und mit einem Licor System analysieren die integrierte Dichte der Proteinbanden durch ImageJ oder Fluoreszenzbanden. Werte der immunreaktiven Banden sollte für die Be-und Löschsteuer normalisiert werden. Zum Vergleich der Steuer-und LTP-Gruppen ein nonparametrical Mann-Whitney-U-Test verwendet werden könnte.

Tabelle 1. Puffer.

Wir haben bereits gezeigt, dass die synapto-Kernprotein Bote Jacob sammelt sich im Zellkern nach der Induktion von LTP aber nicht LTD 1. Darüber hinaus Translokation von Jacob nach synaptischer Stimulation erfordert die Aktivierung der MAPK ERK1 / 2 und Phosphorylierung von Jacob in Ser180 (Abbildung 1). Phosphorylierte Jacob transloziert in den Kern in einer Importin-abhängigen Art und Weise und die phosphorylierten Zustand über längere Zeit durch die Verbindung mit dem Zwischen Filament αinternexin 15 (Figur 1) erhalten. Der Phospho-Zustand des Jacob ist wichtig für die Expression aktivitätsabhängigen Gene und das Überleben der Zelle. Interessanterweise Aktivierung extrasynaptischen NMDARs treibt auch Jacob in den Zellkern, aber in diesem Fall ist nicht phosphoryliert Jacob an Ser180 und ihre Akkumulation im Kern induziert CREB "abgeschaltet" 5,10. Die oben beschriebenen Ergebnisse wurden erhalten Protocols in unserer aktuellen Studie festgestellt (siehe 10 für detaillierte Beschreibung des Modells Karpova et al.).

Um zu beweisen, dass Jacob transloziert in den Zellkern nach der Induktion von LTP, wir induziert und gemessen die Induktion von Schaffer Sicherheiten fEPSP Potenzierung in akuten Schnitten des Hippocampus und isoliert neuronalen Zellkerne von CA1-Neuronen anschließend (Abbildungen 2 und 3). Wir verglichen zwei verschiedenen Zeitpunkten nach der Anwendung des Hochfrequenzstimulation (2 min und 30 min) und erfasst die Induktion von LTP für jede Scheibe, die anschließend für die Kernisolierung und Western Blotting verarbeitet wurde (2 und 3). Bereicherung der neuronalen Marker NeuN Kern in der Kern angereicherten Fraktion aus der CA1-Region vorbereitet seziert gesehen werden, während zytosolische Marker Neuron spezifischen enolase2 (NSE) ist vor allem in der nach Zentrifugation erhaltene Überstand lysiert c Fraktion vorhandenEllen (4A). Die Spezifität der Antikörper PS-180 Jacob vorher gekennzeichnet wurden (Details siehe Karpova et al. 10). PS-180 Jacob Stufen unverändert blieb insgesamt CA1 Protein Homogenaten und in der Kern angereicherte Fraktion 2 min nach Tetanisierung (4B), aber wir fanden einen signifikanten Anstieg pJacobS 180 Immunreaktivität von 30 min nach der Induktion von LTP (4C), die bestätigt, dass Jacob Translokation in den Zellkern in diesem zellulären Plastizität Modell ist an Ser180 phosphoryliert.

Abbildung 1 Jacob phosphoryliert bei S180 codiert die synaptische Ursprung NMDARs Signale. Tetanische Stimulation der Schaffer hippocampalen Sicherheiten Fasern zu einer Aktivierung der synaptischen NMDARs und nachfolgende Aktivierung von MAPKERK1 / 2 Signalkaskade. Aktiv ERK1 / 2 bindet und phosphoryliert an Serin 180 Jacob und Jacob-ERK1 / 2 komplexen transloziert in den Kern und das korreliert mit erhöhter Aktivität und CREB-Aktivierung der Plastizität verbundene Genexpression.

Abbildung 2. Ausrüstung und Werkzeuge für LTP-Induktion und Zerlegung der CA1-Region des Hippocampus aus. 3 - Mikromanipulator und Perfusion System;; 4 - Rekodierung Elektrode, 5 - Stimulationselektrode, 6 - Wasser Objektiv - Vibratom) B1-2) Elektrophysiologie und Bildgebung Setup (2 - Mikroskop A) Vibratom für die Vorbereitung der akuten Hippocampus (1 verwendet , 7 - Slice Halter mit Hippocampus-Scheibe) C) Anlagen für die Präparation der CA1-Region des Hippocampus aus verwendet (8. Stereomicroscope; 9 - Insulin-Spritze mit Nadeln; 10 - Kleine chirurgische Scheren, 11 - Skalpell, 12 - Kunststoff Pasteur-Pipette, 13 - Thin Spachtel; 14-100 mm Kunststoff-Kulturschale mit Eiswasser gefüllt ist, und 40 mm Kunststoff-Kulturschale für die Präparation von Scheiben verwendet.

Abbildung 3. Cartoon Demonstration der Versuchsdurchführung. Zahlen geben Schritte im Protokoll. 2,1-2,8) Eine akute Hippocampus Scheibe im Tauchkammer mit Glaselektroden im Stratum radiatum für Potenzierung der Schaffer-CA1 Synapsen Sicherheiten gestellt. Der Einschub stellt die Probe fEPSP analogen Spuren, die horizontale Balken zeigt 5 ms und der vertikale Balken zeigt 0,5 mV. 3.3) Die Scheiben wurden nach in 1,5-ml-Röhrchen gesammeltLTP Aufnahme und schockgefroren. 4.3) Dissektion der CA1-Region von erwachsenen Ratte Hippocampus. 4,4-4,5) CA1 Regionen homogenisiert in hypotone Lyse-Puffer, der osmotische Schwellung der Zellen und die Freisetzung von Keimen verursacht. 4.8) Die Zentrifugation von Lysaten bei 11.000 rpm für 1 min. 4.10) Sammlung der Zytoplasma-und Kern angereicherten Fraktionen für Immunoblotting. 5.3) Laden von zytoplasmatischen und nuklearen angereicherten Fraktionen auf SDS-PAGE und anschließende Standard-Western-Blot.

Abbildung 4. Induktion von LTP CA1 führt zur Akkumulation von pJacS180 im Kern. A) Immunoblot zum Homogenat, zytosolischen und Kern angereicherten Fraktionen von CA1-Lysat mit zytosolischen und Kernmarken. B) Immunoblot-Analyse von PJAC-S180 Ebene in Homogenat 2 min und 30 min nach indu sondiertktion von Tetanisierung. C) Immunoblot-Analyse von pJacS180 Ebene in Kern angereicherte Fraktion 2 min und min nach Tetanisierung. Diese Ergebnisse sind Teil der in Karpowa et al 10 veröffentlicht Quantifizierung Graphen. Diese repräsentativen Immunoblots sind nicht bei der ursprünglichen Veröffentlichung enthalten.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.