Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.
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Methodenartikel
Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Studium Aktivität abhängige Protein-Expression, subzelluläre Translokation oder Phosphorylierung ist unerlässlich, um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der synaptischen Plastizität zu verstehen. Langzeit-Potenzierung (LTP) und Langzeit-Depression (LTD) bei akuten Hippocampus induziert werden allgemein als Zellmodelle von Lernen und Gedächtnis akzeptiert. Es gibt zahlreiche Studien, die Live-Cell-Imaging oder Immunhistochemie Ansätze verwenden, um Aktivität abhängige Proteindynamik zu visualisieren. Diese Verfahren stützen sich auf die Eignung der Antikörper für Immunzytochemie oder Überexpression von Fluoreszenz-markierten Proteine in einzelnen Neuronen. Immunoblotting von Proteinen ist eine alternative Methode, die unabhängige Bestätigung der Ergebnisse. Die erste limitierende Faktor in der Vorbereitung subzellulärer Fraktionen aus einzelnen tetanized Hippocampus ist die geringe Menge an Material. Zweitens ist die Handhabung Verfahren entscheidend, weil auch sehr kurze und kleinere Manipulationen living Scheiben könnten Aktivierung bestimmter Signalkaskaden auslösen. Hier beschreiben wir einen optimierten Arbeitsablauf, um eine ausreichende Menge von Kern angereicherte Fraktion von ausreichender Reinheit aus der CA1-Region des Hippocampus akuten aus Rattenhirn erhalten. Als ein repräsentatives Beispiel gezeigt, dass die ERK1 / 2 phosphorylierte Form des synapto-Kernprotein Messenger Jacob aktiv transloziert in den Kern nach der Induktion von LTP und kann in einem Kern angereicherte Fraktion von CA1-Neuronen nachgewiesen werden.
Einleitung
Synaptischen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) spielen eine entscheidende Rolle bei der synaptischen Plastizität und Zellüberlebenssignalwohingegen die Aktivierung von extrasynaptischen NMDARs können Neurodegeneration und Zelltod auslösen. Diese Veränderungen hängen von streng kontrollierten / reglementierten Tätigkeit abhängige Genexpression und erfordern daher eine ständige Kommunikation zwischen aktivierten Synapsen oder Dendriten und den Zellkern 7. Die MAP-Kinasen ERK1 / 2 Effektoren der synaptischen NMDARs Signalisierung und in NMDAR-Aktivierungs-induzierte Genexpression beteiligt, während Signalisierung über extrasynaptischen NMDAR keine oder eine hemmende Wirkung auf ERK1 / 2 Aktivität 8,11.
Es gibt eine Reihe von Proteinen, die Shuttle zwischen dem distalen Dendriten und den Zellkern gezeigt wurden. Viele dieser Proteine enthalten ein Kernlokalisierungssignal und aktiv an Mikrotubuli in einer Dynein und Importin-abhängige Weise in den Zellkern transportiert 6,9. Interestingly, einige dieser Botenstoffe nur Transit an den Kern in Reaktion auf spezifische Stimuli synaptische. Beispielsweise retrograden Transport von cAMP response element binding protein 2 (CREB2) durch chemische LTD aber nicht LTP 12 induziert. Lokalisierten NMDAR-abhängige synaptische Stimulation treibt CREB-regulierten Transkriptions Coaktivator (CRTC1) in den Zellkern, einer Translokation, die in langfristigen hippocampalen Plastizität 4 beteiligt ist. Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein Bote Jacob transloziert in den Zellkern, nachdem beide, synaptic und extrasynaptischen NMDAR-Aktivierung und regelt CREB abhängigen Gentranskription 5. Die synaptische oder extrasynaptischen Ursprung des Signals in einer posttranslationalen Modifikation von Jacob kodiert. Synaptische Aktivität induziert ERK1 / 2 abhängige Phosphorylierung von Jacob an einem entscheidenden Serin an Position 180 (pJacobS 180), die eine Voraussetzung für die anschließende Translokation in den Zellkern in der Grund Hippocampus Kultur ist. Außerdem habe ichn CA1 Neuronen des Hippocampus akuten pJacobS 180 transloziert in den Zellkern nach Schaffer Sicherheiten LTP aber nicht LTD 1,10. PS-180 Jacob führt zu einer erhöhten Expression von Genen Plastizität und das Gen-Expression zurückführt, die synaptische Funktion. In scharfem Kontrast dazu Jacob, die in den Zellkern transloziert nach extrasynaptischen NMDARs Aktivierung nicht an Ser180 phosphoryliert und kann mit verschiedenen Protein-Komplex in den Zellkern bewirkt in Verbindung gebracht werden "CREB abgeschaltet" und ein Zurückziehen der synaptischen Kontakte 10.
Die meisten veröffentlichten Studien über die Kernimport synapto-Kernprotein Messenger in dissoziierten neuronalen Primärkulturen durchgeführt worden. Daher wäre es interessant zu sehen, ob solche Erkenntnisse in physiologisch relevanter Bedingungen mit Hippocampus wiedergegeben werden, wo neuronale Konnektivität und Funktion sind viel besser erhalten. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Beurteilung der LTP-dependent nukleäre Translokation von Protein Boten durch Immunoblotting. Dieses Verfahren ist auch für die Analyse Aktivität abhängige Phosphorylierung von Proteinen in einer rohen Kernfraktion. Insbesondere beinhaltet das aktuelle Protokoll Vorbereitung der akuten CA1 des Hippocampus, Induktion, und die Aufnahme von LTP. Als nächstes wird CA1 Region mikroskopisch seziert, um den angeregten Bereich zu isolieren. Wir kombinierten und modifizierte das Protokoll für die Isolierung durch Atomkern CellLytic Extraction Kit mit Änderungen von Zhao und Kollegen 17 eingeführt wird. Das optimierte Verfahren umfasst die Lyse von seziert CA1 Regionen in hypotonischen Puffer ermöglicht Zellschwellung und die Freisetzung von Kernen. Zell-Lyse und Kerne Morphologie kann durch mikroskopische Untersuchung festgestellt werden. Urananreicherung wird durch einen kurzen Zentrifugationsschritt erzielt. Immunoblotting-Analyse mit Antikörpern gegen NeuN und NSE2, spezifische Marker für nukleare oder cytosolischen Fraktionen zeigt, dass dieser Ansatz als schneller eingesetzt werdenund reproduzierbare Protokoll, diese subzellulären Fraktionen zu isolieren und sehr labil posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung zu studieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für kleine Gewebeproben, die aus sezierten Bereiche CA1 des Hippocampus und kann vorteilhaft in Kombination Immunhistochemie von Schnitten des Hippocampus verwendet werden.
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Protokoll
1. Vorbereitung der akuten Hippocampus von erwachsenen Ratte Gehirn
- Betäuben Ratten mit Isofluran. ACHTUNG: Führen Sie das Verfahren unter Verwendung eines geschlossenen Exsikkator, nicht einatmen Isofluran. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt.
- Enthaupten die Ratte, schnell zu isolieren, die das Gehirn, und tauchen es in precarbonated (95% O 2/5% CO 2 Gasgemisch) eiskalt Gey-Lösung (Zusammensetzung in mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O 0,3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucose · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7,32) 30 min 1,2,10,16.
- Entfernen Sie das Kleinhirn und ein Teil des entorhinalen Kortex. Trennen Sie die kortikalen Hemisphären mit einem mittleren sagittalen Schnitt, dann platzieren Sie jede Halbkugel nach unten auf seiner medialen Oberfläche. Danach machenein 50-70 ° Schnitt (50-70 ° quer) entlang der dorsalen Rand jeder Hemisphäre 13,14.
- Kleben jeder Hemisphäre mit dem frisch geschnittenen Fläche, auf der Schneideplattform des Schneidesystems. Die Plattform sollte von precarbogenated eiskalten Gey-Lösung abgedeckt werden.
- Schneiden Sie 350 um 50-70 ° Querschnitten von anterior nach Seite mit einem Vibratom angepasst, um z-Achse Pendeln zu minimieren posterior. Der Hippocampus, entorhinalen Kortex und subicular, sowie die Rinden, die dorsolateralen zum Hippocampus befinden, werden Teil der für Versuche verwendeten Scheiben 13,14 sein.
- Übertragen des Hippocampus zu einer U-Form und Art Inkubator eingetaucht und Inkubation für mindestens 2 h bei 32 ° C mit carbogenated künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, enthaltend in mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1,5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Glucose · H 2O, 27,4 NaHCO 3, pH 7,3) 1,2,10,16.
2. Positionierung der Elektroden, Baseline-Aufnahme, und die Induktion von LTP
- Übertragen Sie die Hippocampus-Scheibe zu einem untergetauchten Aufzeichnungskammer unter dem Mikroskop montiert. Perfusion (6-7 ml / min) mit carbogenated ACSF für mindestens 30 min bei 32 ° C aufweist.
- Bereiten Glaskapillare gefüllt mit Mikroelektroden ACSF (Spitze Widerstand ist 3-5 MQ).
- Stellen Sie ein Glas-Mikroelektroden mit ACSF in der CA1-Schaffer Sicherheiten Fasern für die Stimulation und in der CA1 Stratum radiatum für fEPSP Aufnahme 1,2,10 (Abbildung 2) gefüllt. Der Abstand zwischen den Elektroden beträgt ca. 300 um.
- Evoke Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (fEPSPs) durch Stimulation der Schaffer-Sicherheiten Fasern mit zweiphasigen Rechteckstromimpulse (200 ms / Polarität) in einem Bereich von 3-4 V.
- Führen Sie die maximale Stimulationstest durch Messung der InPut-Ausgangs-Beziehung und definieren die Stimulationsstärke als 40% der maximalen erhalten fEPSP-Steigungswerte und halten Sie sie während des Experiments konstant.
- Beginnen Sie mit der Baseline-Aufnahme für mindestens 15 Minuten nach der maximalen Stimulationstest. Messen Sie die Antworten auf Teststimuli jede Minute während des Experiments. Führen Baseline-Aufnahmen mit niedriger Frequenz Stimulation.
- Nehmen Sie die Grundlinie für mindestens 30 min.
- Für Late-LTP Induktion gelten Hochfrequenz 100 Hz Tetanisierung aus drei 1 sec Reiz Züge bei 100 Hz mit einer 5 Minuten-Intervall intertrain. Um das Feld der Stimulation innerhalb CA1-Region 5 uM Bicucullin erhöhen kann in 2 min vor Tetanisierung gewaschen werden und sollte unmittelbar nach der letzten Tetanisierung gewaschen werden.
3. Sammlung von Scheiben nach der Induktion von LTP und Snap-Freezing
- Stop LTP Aufnahme 2 min oder 30 min nach drei Zügen der tetanischen Stimulation induziert Spät-LTP.
- Entfernen Sie die Elektroden und schnell übertragen die Scheibe auf eine Metallplattform precold auf Trockeneis gelegt. Wiederholen Sie den Vorgang für eine Steuerscheibe in U-förmigen Inkubator gehalten. ACHTUNG: Handschuhe bei der Arbeit mit Trockeneis.
- Sammeln jede Scheibe in einem 1,5-ml-Röhrchen und bei -80 ° C.
4. Isolierung von Kern angereicherten Fraktionen aus der CA1-Region des Hippocampus
- Nehmen Sie 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit den gefrorenen Scheiben von -80 ° C und halten sie auf dem Eis.
- 0,5 ml frischem kaltem TBS-Puffer, der Protease (PI) und Phosphatase-(PS)-Inhibitoren, in die Röhre. Inkubation für 2-3 min und Transfer zu einem Stereomikroskop. ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Kittel bei der Arbeit mit PI und PS.
- Präparieren des Stratum pyramidale CA1-Region des Hippocampus mit Hilfe von zwei Nadeln. Verwenden Sie eine Nadel zum Halten der Scheibe unter dem Stereomikroskop und die zweite Nadel zum Schneiden der CA1-Region.
- Sammeln Sie die seziert CA1-Regionen von 5 Scheiben (für jede Gruppe) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit 50 ul Lysepuffer (1x hypotonische Lyse-Puffer, enthaltend in mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7,9, mit PI und PS). Beachten Sie, dass diese Menge an Material ausreicht, um 2-3 Immunoblots laufen.
- Homogenisieren gesammelte Gewebe durch sorgfältige Pipettieren auf und ab. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette. Bebrüten das Lysat auf Eis für 5-7 min, damit sich die Zellen zu schwellen.
- Nehmen Sie 2 ul des Lysates, fallen auf einen Objektträger und visualisieren die Schwellung der Zellen unter einem Hellfeld-Mikroskop. Mit der richtigen Schwellung der Zellen die Zellkerne erscheinen als runde Strukturen intakt.
- Sammeln Sie 20 ul Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen als "Homogenat Fraktion '. Hinzufügen 8 ul der Denaturierung 4x SDS-Probenpuffer.
- Zentrifugieren Sie die verbleibenden Lysate bei 11.000 rpm für 1 min.
- Sorgfältig sammeln Stand von oben ("cytosolische Fraktion), transfer in ein neues Röhrchen und fügen Sie 20 ul 4x Probenpuffer.
- Das Pellet in 60 ul hypotonischen Puffer und fügen Sie 20 ul 4x Probenpuffer. Diese Fraktion wird als "Kern angereicherte Fraktion" bezeichnet.
- Homogenisat, zytosolischen und nuklearen angereicherten Fraktionen bei -20 ° C oder -80 ° C für die spätere Immunoblotting gespeichert werden.
5. Semiquantitative Immunoblotting für Synapto-Kernproteine
- Aufzutauen die Proben und kochen Sie sie für 5 min bei 95 ° C.
- Take 5 ul von jeder Fraktion und bestimmen die Proteinkonzentration von Amidoschwarz Test oder BCA-Test.
- Laden gleiche Menge von Proteinproben aus Homogenat und zytoplasmatische angereicherten Fraktionen auf SDS-PAGE. Proben von Kontrolle und LTP Scheiben sollten auf dem gleichen Gel zum direkten Vergleich gesetzt werden.
- Führen Sie eine Standard-Western-Blot-Verfahren (Nasstransfer wird empfohlen).
- Sonde die Membranen mit ter Antikörper Wahl. Neuron spezifischen enolase2 (NSE2) und Kernmarker - - NeuN und Actin-Antikörper als Ladekontrolle anschließend die gleichen Blots (oder gleichen Proben parallel laufen) kann mit einem zytoplasmatischen Marker untersucht werden.
6. Datenanalyse
- Effizienz der Induktion von LTP durch Clampfit Software analysiert werden. Die durchschnittlichen Steigung von Baseline-Aufnahmen wurde mit den Pisten nach Tetanisierung mit Zwei-Wege-ANOVA, p gegen <0,05 wurde als signifikant unterschiedlich. Die fEPSP Steigungswerte wurden in Diagrammen als Mittelwert ± SEM dargestellt,
- Zur Quantifizierung der Immunoblots, Scannen entweder die autoradiographische Film und mit einem Licor System analysieren die integrierte Dichte der Proteinbanden durch ImageJ oder Fluoreszenzbanden. Werte der immunreaktiven Banden sollte für die Be-und Löschsteuer normalisiert werden. Zum Vergleich der Steuer-und LTP-Gruppen ein nonparametrical Mann-Whitney-U-Test verwendet werden könnte.
| Name der Puffer | Reagens | Konzentration (mM) | Menge | Kommentare / Beschreibung |
| Gey-Lösung (pH-Wert: 7,3 ~ 7,4) | NaCl | 130 | 7,6 g | Sterilfiltration |
| 1000 ml | KCl | 4.9 | 0,37 g | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1,5 | 0,22 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 0,3 | 0,0739 g | ||
| MgCl 2 · 6H 2 O | 11 | 2,24 g | ||
| KH 2 PO 4 | 0,23 | 0,0313 g | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0,8 | 0,2145 g | ||
| Glucose · H 2 O | 5 | 0,9909 g | ||
| HEPES | 25 | 5,96 g | ||
| NaHCO 3 | 22 | 1,85 g | ||
| ACSF (pH-Wert: 7,3 ~ 7,4) | NaCl | 110 | 6,428 g | Sterilfiltration |
| 1000 ml | KCl | 2.5 | 0,1865 g | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 2.5 | 0,368 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 1,5 | 0,370 g | ||
| KH 2 PO 4 | 1,24 | 0,169 g | ||
| Glucose · H 2 O | 10 | 1,9817 g | ||
| NaHCO 3 | 27,4 | 2,3 g | ||
| 1x hypotonischen Puffer (pH-Wert: 7,9) | HEPES | 10 | 0,23 g | |
| 100 ml | MgCl 2 · 6H 2 O | 1,5 | 0,0304 g | |
| KCl | 10 | 0,07455 g |
Tabelle 1. Puffer.
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Ergebnisse
Wir haben bereits gezeigt, dass die synapto-Kernprotein Bote Jacob sammelt sich im Zellkern nach der Induktion von LTP aber nicht LTD 1. Darüber hinaus Translokation von Jacob nach synaptischer Stimulation erfordert die Aktivierung der MAPK ERK1 / 2 und Phosphorylierung von Jacob in Ser180 (Abbildung 1). Phosphorylierte Jacob transloziert in den Kern in einer Importin-abhängigen Art und Weise und die phosphorylierten Zustand über längere Zeit durch die Verbindung mit dem Zwischen Filament αin...
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Diskussion
Die in der oben beschriebenen Protokoll Schritten eine Anleitung, wie die Vorbereitung von jungen Hippocampus akuten oder erwachsenen Ratten in Scheiben geschnitten, induzieren und Rekord LTP, schnell sezieren stimulierten Bereich der Scheibe, und bereiten Kern angereicherte Fraktion für das Studium Aktivität abhängige Proteindynamik. Dieser Ansatz ergibt sich aus Kombination von mehreren verschiedenen Methoden unabhängig voneinander verwendet. Wir optimierten Workflow und eine ausführlich genug für Anfänger, in denen i...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde gefördert durch die DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK und SB), MM ist Empfänger des European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) und Marie-Curie IEF.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ausrüstung | |||
| CED 1401 AD/DA-Wandler | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomikroskop | Leica S4E, Deutschland | ||
| Vibrotom | Leica VT1000S, Deutschland | ||
| Isolierter Pulsstimulator | A-M Systems, USA | Modell 2100 | |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE System | Biorad | ||
| Kühler | Julabo | ||
| Hellfeldmikroskop | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Zellkultur-Inkubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Mikromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Deutschland | ||
| Blotting-Kammer und Stromlieferant | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Untergetauchte Aufnahmekammer | nach Maß U-förmiger | ||
| und untergetauchter Inkubator | maßgefertigte | ||
| kleine chirurgische Schere | |||
| , Skalpell | |||
| , dünner Spatel, | |||
| Kunststoff-Pasteur-Pipette, | |||
| Kunststoff-Kulturschale | |||
| Bunsenbecher | |||
| Spritze | |||
| Reagenzien | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥ 99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | &ge≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2· 2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro Analyse |
| MgSO4· 2H2O | Merck | 5886.05 | pro Analyse |
| MgCl2· 6H2O | AppliChem | CAS-NR.: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | für Molekularbiologie |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | für Molekularbiologie |
| Na2HPO4· 2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra reine |
| Glukose & Middot; H2 | O Roth | Art.-Nr.6887.1 | für Molekularbiologie |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥ 99,5 %, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro Analyse |
| Proteasehemmer Cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Antikörper | |||
| Primärantikörper | Firmenkatalog Nummer | Spezies | |
| pJac-s180 | Biogenes | Kaninchen (verdünnt 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | Maus (verdünnt 1:1.000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | Kaninchen (verdünnt 1:1.000) |
| Beta-Aktin | Sigma | A-5441 | Maus (verdünnt 1:5.000) |
| Sekundärantikörper | Firmenkatalognummer | Spezies | |
| IgG HRP konjugiert | DAKO | Ziege Anti-Maus (1:5.000) | |
| IgG HRP konjugiert | NEB | Ziege Anti-Kaninchen (1:5.000) |
Referenzen
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