Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten.
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Methodenartikel
Nanopodia - Dünne, Zerbrechlich Membran Projektionen mit Rollen in der Zellbewegung und interzelluläre Wechselwirkungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adhärenten Zellen in Kultur pflegen einen Polarisationszustand, um Bewegung und interzellulären Interaktionen unterstützen. Nanopodia sind dünne, längliche, weitgehend F-Actin-negative Membran Projektionen in Endothel-und Krebszellen, die durch TM4SF1 (Transmembrane-4-L-Sechsfamilien-1) Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden kann. TM4SF1 Cluster in 100-300 &mgr; m Durchmesser TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro omains d), die 3 bis zu 14 einzelne TM4SF1 Molekülen. TMED intermittierend entlang nanopodia in einem regelmäßigen Abstand von 1 bis 3 μ m pro TMED und fest zu verankern, um nanopodia Matrix angeordnet sind. Dies ermöglicht nanopodia mehr als 100 μ m von der Vorderfront oder Nachlauf polarisierten Endothelzellen oder Tumorzellen erstrecken, und bewirkt Membranreste hinter auf matr überlassenix, wenn die Zelle sich bewegt. TMED nanopodia und wurden aufgrund ihrer extremen Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Temperaturübersehen worden. Routine Waschen und Fixierung stören die Struktur. Nanopodia durch direkte Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) bei 37 º C aufbewahrt, gefolgt durch kurze Exposition gegenüber 0,01% Triton X-100 vor der Färbung. Nanopodia neue Perspektiven zu öffnen in der Zellbiologie: sie versprechen, unser Verständnis, wie Zellen ihre Umwelt wahr neu zu gestalten, zu erkennen und zu identifizieren anderen Zellen in einem Abstand, initiieren interzellulären Wechselwirkungen an engen Kontakt, und der Signalmechanismen in Bewegung, Proliferation und Zell -Zell-Kommunikation. Die, die für das Studium TM4SF1 abgeleitete nanopodia entwickelt werden Verfahren kann für die Studien von nanopodia, die in anderen Zelltypen durch die Vermittlung von klassischen Tetraspaninen, insbesondere des ubiquitär exprimiert CD9, CD81 und CD151 zu bilden.
Einleitung
Während Polarisation für Bewegung, Tierzellen erstrecken sich über eine Vielzahl von dynamischen, Membran Vorsprünge von ihren Oberflächen, einschließlich Filopodien, Lamellipodien, Rückzug Fasern und Rüschen ein. Kürzlich zu dieser Liste hinzugefügt nanopodia eine neu erkannte Art von dünnen (100-300 um Durchmesser), längliche (bis zu 50-100 um lang) Membran Projektion, die Membrankanäle für die Erweiterung der F-Aktin Strukturen wie Filopodien stellen waren und Zurückziehen Faser, und das Flecken positiv mit TM4SF1 (Transmembran-4-L-sechs-Familie-1) in kultivierten Endothelzellen und Tumorzellen 2,3.
TM4SF1 ist ein Protein mit tetraspanin artige Topologie, das ursprünglich als ein Tumorzellantigen 4 vor der Entdeckung, dass das Molekül ein Endothelzellen-Biomarker, die eine wesentliche Rolle bei der Endothelzellenproliferation und-migration 2,3 spielt bekannt war. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass TM4SF1 wird lokalisiert, um perinucLear Vesikel mit der Plasmamembran und in TM 4SF1 e nriched Mikro d omains (TMED) angereichert. TMED Anker nanopodia zu Matrix und in regelmäßigen Abständen von 1-3 gebändert Muster TMED / um Länge nanopodia vorhanden. Nanopodia erstrecken sich typischerweise von führenden vor einer Zelle und Nachlauf während der Zellpolarisation für Bewegung. Aufgrund der Natur der Firma haft TMED sind nanopodia nicht wieder in die Zelle zurückziehen, wie es sich bewegt; aufgegeben nanopodia Rückstände so verfolgen den Weg der Zellbewegung. Nanopodia Membrankanäle für die F-Aktin-und Ausfahren zu schaffen, und sind Websites der interzellulären Interaktion und Kommunikation 2,3. Diese Eigenschaften bedeuten, dass nanopodia eine einzigartige Gelegenheit, um die Mechanismen F-Actin-Montage während der Zellpolarisation, Zellerkundung der Umwelt, die Bestimmung der Weg und die Richtung der Zellbewegung und interzellulären Interaktionen zugrunde liegenden Studie liefern einnd-Kommunikation.
Aufgrund der stark hydrophoben Natur TMED und der dünnen und zerbrechlichen Natur des häutigen nanopodia, braucht besondere Pflege, um TMED und nanopodia bewahren genommen werden. Die Zerstörung und Entfernung von nanopodia TMED durch gemeinsame Labormethoden ist ein möglicher Grund, warum nur dreiundsechzig Publikationen auf TM4SF1 seit seiner ersten Entdeckung im Jahr 1986 ein und für den kompletten Mangel an Wissen über TM4SF1 Bereicherung in 100-300 um auf Mikrodomänen erschienen der Zelloberfläche, bis der Bericht der TM4SF1 in Endothelzellen in 2009 2.
Konventionelle Methoden verwenden Immunfärbung häufig organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol oder Aceton, um Zellen zu reparieren und zu verwenden 0,1% oder höher Triton X-100-Konzentration auf Zellen permeabilisieren 5. Hier beschriebenen Studien implementiert drei wichtige Änderungen der herkömmlichen Methode zu zeigen, TMED und nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA und fixieren Zellen in einer 3776, C-Inkubator, (ii) gelten sanfte Raumtemperatur PBS waschen, und (iii) weniger als 0,03% Triton X-100 nur kurz, um Zellen permeabilisieren vor der Zugabe des primären Antikörpers, wie Triton X-100 höher als 0,03% wird extrahiert TM4SF1.
Alle Tetraspaninen bilden Mikrodomänen auf der Zellmembran 6 und einige kolokalisiert mit TMED in Endothelzellen und Tumorzellen 2,3. Wie Tetraspaninen wie CD9, CD81 und CD151 sind ubiquitär exprimiert, kann die hier beschriebenen Färbungsprotokoll zu vielen verschiedenen Zelltypen, die TM4SF1 fehlt für die Studien von nanopodia Funktion erweitert werden.
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Protokoll
1. Zellkultur auf Collagen Beschichtete Glasplatten
- Platz Glasplatten (12 mm Durchmesser) in einem Glas (4 oz) und Autoklav, um die Scheiben zu sterilisieren.
- Setzen Sie 25 ml 70% Ethanol in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und legen Sie sie in einer Zellkultur Kapuze. Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden, bis der Pegel der Lösung auf 20 ml sinkt.
- Legen Sie ein scharfe Zange mit einer extra feinen Spitze in der 70% Ethanol für 5 Minuten, bevor Sie es auf die Glasscheibe zu behandeln.
- Entfernen Sie vorsichtig die Zange aus dem Rohr, und schließen Sie den Deckel, dann vorsichtig platzieren Sie die Ethanol behandelt Zange auf dem Rohr an der Luft trocknen für 2 min. Lassen Sie die Spitze der Zange, um alles in der Haube berühren.
- Mit den sterilen Pinzette einem sterilen Glasplatte aus dem Glas zu greifen und es in eine Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte. Wiederholen, bis die gewünschte Anzahl von Vertiefungen hat, mit Scheiben besiedelt.
- Geben Sie 500 ul Rinderkollagenlösung (50 ng / ml) in jede Vertiefung, die eine Glasplatte enthält und es in einem 37 ° C, 5% CO 2 Zellkulturbrutschrank für mindestens 30 min. Es schadet nicht, in einer längeren Inkubationszeit.
- Ernte HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) oder PC3 (Prostata-Tumorzellen), die bereits in 150 mm-Zellkulturplatte durch Trypsinierung angebaut wurden, und blockieren die Trypsin-Aktivität mit seiner kompletten Kulturmedium. Sammeln Sie Zellen in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen und sicherzustellen, dass die Überlebensfähigkeit von mehr als 90% ist.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
- Verwenden des Kulturmediums, um die Zellen zu 10 5 Zellen / ml zu verdünnen. Zeigen Zellen auf Eis.
- Absaugen Kollagen in Zellkulturhaube und sanft Ort 500 ul Zellsuspension zu jeder Vertiefung, in der Glasscheiben wurden mit Kollagen vorbeschichtet ist. 5 x 10 4 Zellen / Well in 24-Well-Platte geben wird, 60% confluency für HUVEC und 30% Konfluenz für PC3-Zellen. Hinweis: fügen Sie mehr Zellsuspension für höhere Zelldichte.
- Kultur die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 1 h, 2 h, 4 h, 6 h oder 24 h bis nanopodia Aktivitäten und Zellpassage zu verfolgen. Typischerweise werden die Zellen auf die Glasscheibe in der ersten 30 Minuten anzubringen, dann anfangen zu polarisieren und wandern in der ersten Stunde, und durchzuführen, die interzelluläre Wechselwirkungen und die Zellteilung in den folgenden Stunden.
2. Zellfixierung
- Jedes der gut brauchen 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd), um die Zellen zu fixieren. Entweder kommerziell hergestellt oder frisch zubereiteten 4% PFA verwendet werden. Berechnen der Menge des PFA bezogen auf die Anzahl von Vertiefungen hergestellt benötigt, und legen PFA in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen. ACHTUNG: Para steht im Verdacht, krebserregend.
- Setzen Sie die Falcon-Röhrchen in einem Styropor-Stand, der bereits in einem 37 ° C-Inkubator war. Lassen Sie das Rohr in den Brutschrank für 30 Minuten in den Kriegm die PFA bis 37 ° C
- Legen Sie ein Heizkissen in der Kultur Haube und schalten Sie ihn ein.
- Nehmen Sie die 24-Loch-Zellkulturplatte und den vorgewärmten PFA aus dem Inkubator und legen Sie es auf dem Heizkissen.
- Mit einer Hand das Medium von einem gut absaugen, und sofort nach der mit der anderen Hand sanft gleiten PFA 500 ul in die gut durch die Wannenkante. Zur leichteren Absaugen, kippen Sie die Kulturplatte bei etwa 45 °, lehnte sie gegen die Styropor-Stand, so dass es in diesem Winkel stabil. Dadurch wird das Absaugen und Zugabe von PFA Lösung der gut ohne die Zellen in Kultur zu stören erleichtern. Dies ist der wichtigste Schritt die ursprüngliche Zellstruktur Zellaktivitäten zu erhalten.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Vertiefungen mit einer Glasscheibe haben PFA erhalten. Hinweis: Alle Schritte, die zu bereits bestehenden Lösung aus der auch ändern müssen, ist selbe Streben Verfahren anzuwenden.
- Die Platte wird in 37 ° C für 5 min.
- Nehmen Sie die Platte zurück in die Kultur Kapuze und kippen gegen Styropor, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Mit einer Hand sanft überweisen Sie den PFA aus dem Brunnen in ein Sammelrohr; mit der anderen Hand, um gleich darauf legen mindestens 500 ul PBS Raumtemperatur in den Brunnen. Nachdem alle Brunnen gewaschen wurden, zurück und wiederholen den PBS-Wasch noch einmal in jeden gut. Leeren Sie die gesammelten PFA in eine gefährliche Abfallbehälter.
- Vorbereitung ICC Blockierungspuffer durch Zugabe von 2% fötalem Rinderserum zu PBS. 0,04% Natriumazid (von 20% Stammlösung verdünnt) als Konservierungsmittel zugesetzt. ACHTUNG: Natriumazid ist eine giftige Verbindung. Der Puffer kann in 4 ° C für eine lange Zeitdauer ohne bakterielle Kontamination gespeichert werden.
- Mit der Kulturplatte noch vor einem Stand durch jeden gut zu PBS Absaugen entfernen und sofort danach Zugabe von 500 ul von ICC-Blockierungspuffer gekippt, wieder Zyklus. Die Zellen sind nun bereit für Immunfluoreszenzfärbung. Falls erforderlich, diefixierten Zellen in einem 4 ° C Kühlraum für eine Woche ohne wesentlichen Verlust an Protein TM4SF1 gespeichert werden.
3. TM4SF1 Immunfluoreszenz-Färbung von Nanopodia
- In jede Vertiefung, ersetzen Sie das ICC 500 ul Blockierungspuffer mit einem neuen Blockierungspuffer mit 0,01% Triton X-100 und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 1 Stunde sitzen. Verwenden Sie nicht mehr als 0,03% Triton X-100, wie es TM4SF1 aus Zellmembranen zu entfernen. PBS gewaschenen Zellen aus Schritt 2.10 kann direkt auf die Blockierungspuffer Triton bewegt werden, wenn die Färbung bereit, sofort gestartet werden.
- Verdünnte Primäranti TM4SF1 (oder Anti-CD9) Antikörper bis 0,5 ug / ml in Blockierungspuffer ICC.
- In jede Vertiefung, entfernen Sie die ICC/0.01% Triton-Puffer und ersetzen Sie es mit 300 ul der Anti-TM4SF1-Antikörperlösung. Inkubation 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht verlassen bei 4 ° C
- Waschen Sie jede Vertiefung mit nicht weniger als 500 ul PBS. 3x wiederholen; jedes Mal geben bei least 5 min Inkubationszeit.
- Vorbereitung eines sekundären Antikörpers und Phalloidin-Lösung in ICC Blockierungspuffer unter Verwendung einer 1000-fachen Verdünnung von Alexa 488 markierten Esel-anti-Maus-Sekundär-Antikörper (2 &mgr; g / ml Endkonzentration) und 1000 x Verdünnung Phalloidin (50 ng / ml Endkonzentration).
- Entfernen PBS und 300 ul des sekundären Antikörpers und Phalloidin Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 2 Stunden oder lassen Sie es über Nacht bei 4 ° C
- Wiederholen PBS Waschschritten mit mindestens 5 min Inkubation pro Waschgang. In der letzten Waschung, lassen jede Vertiefung in PBS für 1 Stunde.
- Werfen Sie einen einzigen Tropfen (~ 10 ul) von Anti-Fade-Montagetechnik auf einem Glasträger.
- Biegen Sie die Spitze einer 19 G 1 ½ Spritzennadel in 90 °, indem Sie sanft auf eine harte Oberfläche. Mit einer Hand gebogenen Nadel zu halten und heben eine Glasscheibe aus dem Brunnen, und mit der anderen Hand, um die Scheibe zu erfassen mit den scharfen Pinzette.
- Drehen Sie die Glasscheibe &# 160; Gesicht nach unten lassen die Seitenkontaktzelle die Montagetechnik auf dem Objektträger. Legen Sie vorsichtig die Glasscheibe und lassen Sie es über Nacht trocknen an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur.
- Fahren Sie mit dem Bild Immunfluoreszenz gefärbt nanopodia oder die Folien in einer Dia-Box bei -20 ° C Die Bilder werden sichtbar für ein paar Monate in -20 ° C bleiben
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Ergebnisse
Für Schritt 1:
Wenn Zellen (wie HUVEC und PC3 in dieser Studie verwendet) sind in der Lage, normal zu wachsen, werden Zellen, die mit Kollagen beschichteten Platte innerhalb von 30 min zu befestigen, nachdem sie ausgesät sind, zu polarisieren und zu mobilen bald danach, und erstrecken sich nanopodia vor ihrem Weg Bewegungs. Fig. 1A und 1B jeweils eine polarisierte oder proliferierende HUVEC. 2A zeigt polarisierten PC3-Zellen in einem mobilen Zu...
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Diskussion
Nanopodia sind dünne Zellmembran Kanäle, die fest an, um durch TMED Matrix und kann mehr als 100 um aus einer mobilen Zelle polarisiert, um die Umwelt zu erfassen und zu vermitteln interzellulären Wechselwirkungen 2,3 verlängern. Nanopodia haften so fest, dass die Rückstände hinter wie die Zelle bewegt sich nach links Matrix (Abbildungen 1 und 2). Nanopodia damit es uns ermöglichen, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt spüren und bestimmen den Weg der Zellbewegung, und wie ...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Dr. Harold Dvorak für hilfreiche Diskussionen einschließlich der Vorschlag, Fixierung in 37 ° C PFA versuchen. Diese Arbeit wurde vom NIH P01 CA92644 und durch einen Vertrag von der Nationalen Stiftung für Krebsforschung unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Glasscheiben | Fisher Scientific | 12-545-82 | mit 12 mm Durchmesser |
| Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Jars mit geraden Seiten, 4 oz | |
| Objektträger | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Mikroskopobjektträger aus einfachem Glas |
| 50 ml Falcon Tube | BD Falcon 352070 | 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen aus hochklarem Polypropylen, 16.000 rcf Bewertung. Keimfrei. | |
| 15 ml Falcon Röhrchen mit Styroporgestell | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Zentrifugenröhrchen |
| Scharfe Pinzette | Fisher Scientific | 13-812-42 | Präparieren Extra feine spitze Splitterzange |
| 24 Well Zellkulturplatte | BD Bioscience | 353047 | 24 Well Zellkulturplatte |
| 150 mm Zellkulturplatte | BD Bioscience | 353025 | 150 mm Zellkulturplatte |
| 19 G 1 und frac12; Spritzenkanüle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen Lösung | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, hohe Konzentration, Rattenschwanz, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0,25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), flüssig, mit L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Lösung, pH 7,4 |
| PFA (Paraformaldehyd) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fötales Rinderserum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basalmedium 500 ml und EGM-2 SingleQuot Kit Ergänzung & Wachstumsfaktoren |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | In Wasser gelöst. 4% Stammlösung und Arbeitskonzentration 0,4%. |
| Maus Anti-Human-Antikörper TM4SF1 | Millipore | MAB3127 | Epitop befindet sich in der extrazellulären Domäne |
| Maus-Anti-Human-CD9-Antikörper | BD Bioscience | 555370 | Epitop befindet sich im extrazellulären Bereich |
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus 2. Antikörper | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamin-konjugiertes Phalloidin |
| Anti-Fade-Eindeckmedien | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagenz mit DAPI |
| 70% Ethanol | 17,5 ml Ethanol (200 Proof) 7,5 ml doppelt deionisiertes Wasser | ||
| 10x PBS (200 ml) | 20 ml 10x PBS 180 ml doppelt deionisiertes Wasser | ||
| 20 % Triton X-100 (20 ml herstellen) | 4 ml Triton X-100 16 ml doppelt deionisiertes Wasser | ||
| 4 % NaN3 (ergibt 25 ml)1 | g NaN3 25 ml doppelt deionisiertes Wasser | ||
| 50 ng/ml Rinderkollagenlösung in PBS (Herstellung 5 ml) | Stammlösung von 50 μm; g/ml (50 ml) 830 μ l Kollagen I (3 mg) 50 ml PBS | ||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (1 ml zugeben) 0,04% NaN3 (100 μm; l davon 4 % NaN3) | ||
| ICC Blocking Buffer/0,01 % Triton X-100 (ergibt 50 ml) | 50 ml ICC Blocking Buffer 25 μ l davon 20% Triton X-100 | ||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435< | a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org |
| Zellkulturhaube | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Serie 60) Biologische Sicherheitswerkbank |
| 37°; C, 5% CO2 Zellkultur-Inkubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Wasserummanteltes |
| Inkubator-Heizkissen | K& H Fertigung | 1020 | K& H Lectro Kennel Heizkissen mit freiem Fleecebezug (www.amazon.com) |
| Zentrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Tischzentrifuge |
| Hämozytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hämozytometer |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
