Nanopodia - Dünne, Zerbrechlich Membran Projektionen mit Rollen in der Zellbewegung und interzelluläre Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten.

Zusammenfassung

Adhärenten Zellen in Kultur pflegen einen Polarisationszustand, um Bewegung und interzellulären Interaktionen unterstützen. Nanopodia sind dünne, längliche, weitgehend F-Actin-negative Membran Projektionen in Endothel-und Krebszellen, die durch TM4SF1 (Transmembrane-4-L-Sechsfamilien-1) Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden kann. TM4SF1 Cluster in 100-300 &mgr; m Durchmesser TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro omains d), die 3 bis zu 14 einzelne TM4SF1 Molekülen. TMED intermittierend entlang nanopodia in einem regelmäßigen Abstand von 1 bis 3 μ m pro TMED und fest zu verankern, um nanopodia Matrix angeordnet sind. Dies ermöglicht nanopodia mehr als 100 μ m von der Vorderfront oder Nachlauf polarisierten Endothelzellen oder Tumorzellen erstrecken, und bewirkt Membranreste hinter auf matr überlassenix, wenn die Zelle sich bewegt. TMED nanopodia und wurden aufgrund ihrer extremen Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Temperaturübersehen worden. Routine Waschen und Fixierung stören die Struktur. Nanopodia durch direkte Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) bei 37 º C aufbewahrt, gefolgt durch kurze Exposition gegenüber 0,01% Triton X-100 vor der Färbung. Nanopodia neue Perspektiven zu öffnen in der Zellbiologie: sie versprechen, unser Verständnis, wie Zellen ihre Umwelt wahr neu zu gestalten, zu erkennen und zu identifizieren anderen Zellen in einem Abstand, initiieren interzellulären Wechselwirkungen an engen Kontakt, und der Signalmechanismen in Bewegung, Proliferation und Zell -Zell-Kommunikation. Die, die für das Studium TM4SF1 abgeleitete nanopodia entwickelt werden Verfahren kann für die Studien von nanopodia, die in anderen Zelltypen durch die Vermittlung von klassischen Tetraspaninen, insbesondere des ubiquitär exprimiert CD9, CD81 und CD151 zu bilden.

Einleitung

Während Polarisation für Bewegung, Tierzellen erstrecken sich über eine Vielzahl von dynamischen, Membran Vorsprünge von ihren Oberflächen, einschließlich Filopodien, Lamellipodien, Rückzug Fasern und Rüschen ^ein. Kürzlich zu dieser Liste hinzugefügt nanopodia eine neu erkannte Art von dünnen (100-300 um Durchmesser), längliche (bis zu 50-100 um lang) Membran Projektion, die Membrankanäle für die Erweiterung der F-Aktin Strukturen wie Filopodien stellen waren und Zurückziehen Faser, und das Flecken positiv mit TM4SF1 (Transmembran-4-L-sechs-Familie-1) in kultivierten Endothelzellen und Tumorzellen ^2,3.

TM4SF1 ist ein....

Protokoll

1. Zellkultur auf Collagen Beschichtete Glasplatten

1. Platz Glasplatten (12 mm Durchmesser) in einem Glas (4 oz) und Autoklav, um die Scheiben zu sterilisieren.
2. Setzen Sie 25 ml 70% Ethanol in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und legen Sie sie in einer Zellkultur Kapuze. Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden, bis der Pegel der Lösung auf 20 ml sinkt.
3. Legen Sie ein scharfe Zange mit einer extra feinen Spitze in der 70% Ethanol für 5 Minuten, bevor Sie es auf die Glasscheibe zu behandeln.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Zange aus dem Rohr, und schließen Sie den Deckel, dann vorsichtig platzieren Sie die Ethanol behandelt Zange....

Ergebnisse

Für Schritt 1:

Wenn Zellen (wie HUVEC und PC3 in dieser Studie verwendet) sind in der Lage, normal zu wachsen, werden Zellen, die mit Kollagen beschichteten Platte innerhalb von 30 min zu befestigen, nachdem sie ausgesät sind, zu polarisieren und zu mobilen bald danach, und erstrecken sich nanopodia vor ihrem Weg Bewegungs. Fig. 1A und 1B jeweils eine polarisierte oder proliferierende HUVEC. 2A zeigt polarisierten PC3-Zellen in einem mobilen Zu.......

Diskussion

Nanopodia sind dünne Zellmembran Kanäle, die fest an, um durch TMED Matrix und kann mehr als 100 um aus einer mobilen Zelle polarisiert, um die Umwelt zu erfassen und zu vermitteln interzellulären Wechselwirkungen ^2,3 verlängern. Nanopodia haften so fest, dass die Rückstände hinter wie die Zelle bewegt sich nach links Matrix (Abbildungen 1 und 2). Nanopodia damit es uns ermöglichen, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt spüren und bestimmen den Weg der Zellbewegung, und wie .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glasscheiben	Fisher Scientific	12-545-82	mit 12 mm Durchmesser
	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Jars mit geraden Seiten, 4 oz
Objektträger	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Mikroskopobjektträger aus einfachem Glas
50 ml Falcon Tube	BD Falcon 352070		50 ml konisches Zentrifugenröhrchen aus hochklarem Polypropylen, 16.000 rcf Bewertung. Keimfrei.
15 ml Falcon Röhrchen mit Styroporgestell	Corning	430790	Corning 15 ml PP Zentrifugenröhrchen
Scharfe Pinzette	Fisher Scientific	13-812-42	Präparieren Extra feine spitze Splitterzange
24 Well Zellkulturplatte	BD Bioscience	353047	24 Well Zellkulturplatte
150 mm Zellkulturplatte	BD Bioscience	353025	150 mm Zellkulturplatte
19 G 1 und frac12; Spritzenkanüle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen Lösung	BD Bioscience	354249	Collagen I, hohe Konzentration, Rattenschwanz, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0,25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), flüssig, mit L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Lösung, pH 7,4
PFA (Paraformaldehyd)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fötales Rinderserum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basalmedium 500 ml und EGM-2 SingleQuot Kit Ergänzung & Wachstumsfaktoren
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	In Wasser gelöst. 4% Stammlösung und Arbeitskonzentration 0,4%.
Maus Anti-Human-Antikörper TM4SF1	Millipore	MAB3127	Epitop befindet sich in der extrazellulären Domäne
Maus-Anti-Human-CD9-Antikörper	BD Bioscience	555370	Epitop befindet sich im extrazellulären Bereich
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus 2. Antikörper	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamin-konjugiertes Phalloidin
Anti-Fade-Eindeckmedien	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagenz mit DAPI
70% Ethanol			17,5 ml Ethanol (200 Proof) 7,5 ml doppelt deionisiertes Wasser
10x PBS (200 ml)			20 ml 10x PBS 180 ml doppelt deionisiertes Wasser
20 % Triton X-100 (20 ml herstellen)			4 ml Triton X-100 16 ml doppelt deionisiertes Wasser
4 % NaN3 (ergibt 25 ml)1			g NaN3 25 ml doppelt deionisiertes Wasser
50 ng/ml Rinderkollagenlösung in PBS (Herstellung 5 ml)			Stammlösung von 50 μm; g/ml (50 ml) 830 μ l Kollagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (1 ml zugeben) 0,04% NaN3 (100 μm; l davon 4 % NaN3)
ICC Blocking Buffer/0,01 % Triton X-100 (ergibt 50 ml)			50 ml ICC Blocking Buffer 25 μ l davon 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435<	a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org
Zellkulturhaube	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Serie 60) Biologische Sicherheitswerkbank
37°; C, 5% CO2 Zellkultur-Inkubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Wasserummanteltes
Inkubator-Heizkissen	K& H Fertigung	1020	K& H Lectro Kennel Heizkissen mit freiem Fleecebezug (www.amazon.com)
Zentrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Tischzentrifuge
Hämozytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hämozytometer

Glasgefäß