Die Isolierung von Krebsstammzellen (KSZ), die direkt aus menschlichen Geweben ist Voraussetzung für ihre biologische Charakterisierung. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Isolierung von Prostata-Krebsstammzellen aus menschlichen Geweben, aber auch mit Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.
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Methodenartikel
Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Krebsstammzellen (CSC)-Modell wurde erheblich in den letzten zwei Jahrzehnten revisited. Während dieser Zeit KSZ wurden identifiziert und direkt isoliert aus menschlichen Geweben und seriell in immundefizienten Mäusen propagiert, typischerweise durch Antikörpermarkierung von Subpopulationen von Zellen und Fraktionierung mittels Durchflusszytometrie. Allerdings haben die einzigartigen klinischen Eigenschaften von Prostatakrebs erheblich begrenzt das Studium der Prostata KSZ von frischen menschlichen Tumorproben. Wir berichteten kürzlich über die Isolierung der Prostata-Krebsstammzellen direkt aus menschlichen Geweben durch ihre HLA-Klasse-I (hlai)-negative Phänotyp. Prostatakrebszellen aus chirurgischen Proben entnommen und mechanisch dissoziiert. Eine Zellsuspension erzeugt und mit Fluoreszenz-konjugierte hlai und Stromazellen Antikörpern markiert. Subpopulationen von hlai-negativen Zellen werden schließlich mit einem Durchflusszytometer isoliert. Die wichtigste Einschränkung dieses Protokoll ist das häufig mikroskopischen und multifokale Naturprimären Krebs in Prostatektomie Proben. Dennoch sind isolierter lebender Prostata-Krebsstammzellen für die molekulare Charakterisierung und funktionellen Validierung durch Transplantation bei immungeschwächten Mäusen.
Einleitung
Intratumorale Heterogenität wird als ein Kennzeichen von Krebs 1 sein. Tatsächlich mehrere Mechanismen der intratumoralen Heterogenität beschrieben wurden, einschließlich genetischer Mutation und Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung. Darüber hinaus können einige Krebsarten eine zelluläre Hierarchie mit einer Subpopulation von Krebsstammzellen (KSZ), die die Eigenschaften tumorinitiierende Kapazität und Selbsterneuerung in serielle Transplantation Assays 2-5 zeigt enthalten. Zunächst in hämatologischen 6, Brust 7 und 8 Malignitäten des Gehirns beschrieben, wurden auch in KSZ Prostatakrebs 9-12 sowie a....
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Protokoll
1. Ernte und Verarbeitung von menschlichen Prostatakrebs-Gewebe von chirurgischen Proben
- Man stellt zwei 50-ml-Polystyrolröhrchen, konische 15 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Pathologie Service-Personal ernten primären und metastatischen Prostatakrebs Proben von Prostatektomie und palliative Operationen Proben jeweils unter einem Institutional Review Board genehmigt Protokoll. Proben können von metastatischen Lymphknoten Dissektion während der ersten Operation erhalten werden, die Wirbel während palliative chirurgische Verfahren, wie Rückenmarks Dekomp....
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Ergebnisse
Fig. 1 ist. Menschliche Prostatakrebstumor Ernte und Durchflusszytometrie Diagramm, welches spezifische Populationen von einem menschlichen Prostatakrebs. (A) Tumorknoten werden geerntet, um eine Zellsuspension zu erzeugen. Tumorgehalt der verarbeiteten Probe wird unter Verwendung herkömmlicher Hämatoxylin und Eosin-Färb.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von CSC aus frischen menschlichen Prostata-Krebsgewebe. Einige wichtige Überlegungen beeinflussen das erfolgreiche Ergebnis dieses Protokolls.
Die Erholung der hohen Zahl von lebensfähigen Prostatakrebs-Zellen ist abhängig von der sorgfältigen Beurteilung der Brutto chirurgischen Proben. Nach unserer Erfahrung ist die erfolgreiche Isolierung von tumorerzeugenden Zellen der Prostata am besten gewährleistet, wenn makroskopische Tumorknoten werden beob.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Familie Hariri-Stiftung und der TJ Martell Foundation unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm, 15 mm Zellkulturschale | Corning | 3295 | |
| 35 & Mikro; m Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml konisches Röhrchen | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml konisches Röhrchen | Crystalgen | 23-2265 | |
| Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE Antikörper | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC Antikörper | eBioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC Antikörper | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE-Antikörper | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC Antikörper | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrolröhrchen mit Zellsiebkappe | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% neutraler Puffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
Referenzen
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C....
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Nachdrucke und Genehmigungen
